陳顯韜，杜位良

慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）是指結(jié)腸的傳輸功能障礙，腸內(nèi)容物傳輸緩慢所致的便秘[1]。目前認為，腸神經(jīng)遞質(zhì)的異常改變是STC發(fā)病的重要機制之一[2]。肺與大腸相表里最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，是指肺與大腸生理和病理上相互聯(lián)系。而現(xiàn)代研究亦證實，肺腸在進化發(fā)育、表面活性物質(zhì)、黏膜免疫及神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡都存在著一定的相關(guān)性[3]。5-羥色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）、P 物質(zhì)（substance P，SP）都是同時存在于肺、腸并通過發(fā)揮生物學作用而影響肺、腸的生理病理變化[4-5]。本研究擬通過觀察補肺湯對STC模型大鼠結(jié)腸內(nèi)5-HT、SP表達的影響，為臨床基于“肺與大腸相表里”理論從肺論治STC提供動物實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，體重150～180 g，雌雄各半。由瀘州醫(yī)學院實驗動物中心提供。隨機分為空白對照組（A組），模型對照組（B組），補肺湯治療組（C組）。

1.2 藥物 （1）復方地芬諾酯片（compound diphenoxylate，DC），鄭州復升藥業(yè)有限公司。配制成DC混懸液（2.5 g/L）。（2）補肺湯（《云岐子保命集》卷下）由瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院臨床藥物實驗中心提供。組成：黃芪（炙）30 g，人參15 g，熟地黃20 g，紫菀15 g，桑白皮15 g，五味子5 g。傳統(tǒng)水煎，熬制成含成藥1 g/mL濃縮液。（3）活性炭混懸液。稱取阿拉伯樹膠50 g，加水400 mL，煮沸至溶液透明。稱取活性碳25 g，加至上述溶液中煮沸3次。待溶液涼后，加水定容成500 mL混懸液（50 g/L），于冰箱4 ℃保存。使用前玻璃棒攪拌混勻。

1.3 試劑與儀器 大鼠5-HT、SP一抗免疫組化試劑盒（北京博奧森生物有限公司）；PBS緩沖液、二抗免疫組化檢測試劑盒（PV-6001，北京中衫金橋生物有限公司）；HRP-DAB底物顯色試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]。石蠟切片機HM325（德國MICROM公司）；光學顯微鏡BX-70（日本Olympus光學有限公司）。

1.4 STC大鼠模型 參照文獻[6-7]擬定方案。大鼠適應性喂養(yǎng)后，隨機分為A組10只和STC造模組20只（包括B組、C組，每組各10只）。A組每日給予生理鹽水0.2 mL/10 (g·d)灌胃，造模組每日給予DC混懸液15 mg/(kg·d) 灌胃。連續(xù)灌胃21天，期間不限食水。

1.5 給藥 參考徐叔云《藥理實驗方法學》人和動物藥物用量，按體表面積折算的等效劑量比值為0.018計算。造模成功后，A組與B組給予蒸餾水0.2 mL/10 (g·d)灌胃治療，C組給予補肺湯濃縮液10.5 g [10.5 mL/(kg·d)] 灌胃治療。療程為14天。

1.6 活性碳推進試驗 造模結(jié)束及藥物灌胃治療結(jié)束，大鼠在活性炭推進實驗前禁食不禁水24 h，每只大鼠用活性炭混懸液2 mL灌胃，分籠飼養(yǎng)觀察，不禁食水。分別觀察記錄每只大鼠首粒黑便排出時間及24 h內(nèi)大便粒數(shù)及濕重，以測定各組大鼠腸道傳輸功能及STC改善程度。

1.7 5-HT、SP免疫組化檢測 活性炭推進實驗結(jié)束，各組大鼠頸椎脫臼處死。打開腹腔，剪取回盲部近端結(jié)腸1～1.5 cm，用4 ℃生理鹽水洗凈腸內(nèi)容物及血液。放入4%多聚甲醛內(nèi)固定，選取固定待檢的大鼠結(jié)腸組織，再行脫水、透明、石蠟包埋，制成石蠟塊。作5 μm厚的組織切片編號。采用免疫組化SP法測定結(jié)腸組織5-HT、SP含量,具體操作按試劑盒說明進行。

1.8 圖像分析 在高倍鏡下（×400）對每張切片隨機選取5個具有代表性的視野，測量各視野平均光密度值（density mean，MD）。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0對各組數(shù)據(jù)進行處理，所得數(shù)據(jù)結(jié)果均以均數(shù)±標準差（）表示，多組均數(shù)差異顯著性的比較采用單因素方差分析，多個樣本均數(shù)的兩兩比較用SNK法（q檢驗），P＜0.05時表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 活性炭推進實驗 A組大鼠首粒黑便排出時間小于B、C組（P＜0.05），而24 h大便粒數(shù)、24 h大便濕重均大于B、C組（P＜0.05）；B、C組分別對三項檢測指標分別行組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。證明已成功建立了大鼠STC模型。見表1。

表1 STC造模結(jié)束活性炭推進實驗結(jié)果

中藥治療結(jié)束，B組和C組大鼠首粒黑便排出時間大于A組（P＜0.05），而24 h大便粒數(shù)、24 h大便濕重小于A組（P＜0.05）；B組與C組比較大鼠首粒黑便排出時間，24 h大便粒數(shù)以及24 h大便濕重差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 治療后各組大鼠活性炭推進實驗結(jié)果及大便基本情況檢測情況

2.2 5-HT、SP免疫組化檢測 免疫組化陰性對照見圖1，5-HT、SP免疫組化陽性對照分別見圖2、圖3；實驗觀察發(fā)現(xiàn)，大鼠結(jié)腸內(nèi)5-HT主要表達于結(jié)腸黏膜層、黏膜下層，主要分布于腸絨毛上皮細胞以及腸腺上皮之間，著色細胞呈棕黃色，胞核無色染。如圖4～圖6。而結(jié)腸內(nèi)SP主要表達于結(jié)腸肌間神經(jīng)叢神經(jīng)元細胞胞漿內(nèi)及黏膜下神經(jīng)叢，著色細胞呈棕黃色，胞核無色染。如圖7～ 圖 9。

圖1 免疫組化陰性對照（結(jié)腸，×400）

圖2 免疫組化陽性對照（5-HT，×400）

圖3 免疫組化陽性對照（5-HT，×400）

圖4 A組結(jié)腸5-HT（5-HT，×400）

圖5 B組結(jié)腸5-HT（5-HT，×400）

圖6 C組結(jié)腸5-HT（5-HT，×400）

圖7 A組結(jié)腸SP（SP，×400）

圖8 B組結(jié)腸SP（SP，×400）

圖9 C組結(jié)腸SP（SP，×400）

結(jié)腸內(nèi)5-HT、SP MD比較，B組均低于A、C組（P＜0.05），C組低于A組（P＜0.05）。見表3。

表3 治療后各組大鼠結(jié)腸組織免疫組化5-HT、SP表達MD比較

3 討論

基于“肺與大腸相表里”從肺論治便秘由來已久?！夺t(yī)經(jīng)精義》點明“理大便必須調(diào)肺氣也”。STC老年多發(fā)[8]，多為本虛標實之證，屬中醫(yī)學虛秘的范疇。相關(guān)文獻分析便秘的證侯發(fā)現(xiàn)氣虛、陰虛、陽虛、血虛共占總頻數(shù)的54.4%，反映了STC以正虛為主的特點，而肺氣虛占一定的比例，是其常見的證型[9-10]。實驗研究亦發(fā)現(xiàn)便秘小鼠皮毛失去光澤，皮膚出現(xiàn)菲薄、干燥，正如《素問·五臟生成》云：“肺之合皮也，其榮毛也”[11]。故從肺論治便秘具有重要實際意義。臨床治療中[12-13]以補肺健脾法、調(diào)肺潤腸、宣肺養(yǎng)陰等治療慢傳輸型便秘，均獲良效。補肺湯出自《云岐子保命集》卷下，以桑白皮（蜜炙）、熟地黃、人參、紫菀、黃芪（蜜炙）、五味子為主要組成藥物，諸藥合用，共奏補肺益氣之功效。補肺湯已廣泛運用于肺炎、氣管炎、慢性阻塞性肺疾病等的治療，臨床亦有報道補肺湯配合針刺治療術(shù)后腹脹具有較好的臨床療效[14]。實驗研究[15-16]發(fā)現(xiàn)補肺湯可減輕肺氣虛證大鼠支氣管、肺組織病理學變化，增強大鼠免疫功能有作用；加速細胞外基質(zhì)的降解，抑制肺纖維化的形成。

高健群等[17]研究發(fā)現(xiàn)，基于肺與大腸相表里理論運用肅肺潤腸湯可以提高藥物依賴性便秘大鼠腸道杯狀細胞、免疫反應細胞5-HT的形態(tài)分布和數(shù)量，從而促進胃腸蠕動,改善胃腸道的傳輸功能。同時研究表明，5-HT、SP均為腸神經(jīng)系統(tǒng)分泌的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，5-HT能激活腸黏膜下傳入神經(jīng)纖維，通過腸神經(jīng)系統(tǒng)來調(diào)節(jié)胃腸道局部的興奮和抑制，并能夠加速結(jié)腸運動和傳輸[18]。SP可以刺激胃腸壁內(nèi)神經(jīng)元的去極化，調(diào)節(jié)胃腸局部血流及改變血管通透性，增強對胃腸道環(huán)行肌和縱行肌的雙重收縮作用[19]。均具有促進腸道的蠕動與排空的功能。

本實驗以補肺湯為治療藥物，研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠結(jié)腸內(nèi)5-HT、SP表達明顯低于空白對照組，證明STC模型組大鼠結(jié)腸內(nèi)存在腸興奮性神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、SP降低的情況。補肺湯治療組大鼠結(jié)腸內(nèi)5-HT、SP表達均雖低于空白對照組，但較模型對照組均有不同程度的增加。這與相關(guān)文獻報道中藥通過增加結(jié)腸內(nèi)5-HT的量而改善腸道傳輸功能的結(jié)果相符[17]。治療后，大鼠結(jié)腸活性炭推進實驗顯示，補肺湯治療組大鼠結(jié)腸傳輸功能明顯低于空白對照組，且與模型對照組無統(tǒng)計學差異。實驗綜合表明，補肺湯不能有效改善STC模型大鼠結(jié)腸的傳輸功能，但能增加STC模型大腸結(jié)腸內(nèi)5-HT、SP在結(jié)腸內(nèi)的表達，對STC的治療有一定協(xié)助作用。本實驗為從肺論治STC的機理提供了一定的動物實驗依據(jù)，但如何完全揭示從肺論治STC的機理仍需進一步研究。