盛鵬程 周冬仁 韓新榮 胡曉波 葉雪平 徐 磊 周 聃吳琦芳 郝貴杰①

(1.農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省魚(yú)類(lèi)健康與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省淡水水產(chǎn)研究所 湖州 313001；2.桐鄉(xiāng)市水產(chǎn)工作站 桐鄉(xiāng) 314500)

烏鱧(Ophiocephalus argus),又名黑魚(yú)、烏魚(yú)、生魚(yú)、財(cái)魚(yú)、蛇魚(yú)、火頭魚(yú)等,隸屬于鱧科、鱧屬。除新疆、西藏外,烏鱧在我國(guó)各大水系廣泛分布。烏鱧營(yíng)養(yǎng)豐富、骨剌少、蛋白含量高,且具有去瘀生新、滋補(bǔ)調(diào)養(yǎng)、健脾利水的醫(yī)療功效,是集食用與藥補(bǔ)于一身的名貴魚(yú)類(lèi)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),目前烏鱧的養(yǎng)殖面積5764ha,總產(chǎn)量達(dá)到51788t,總產(chǎn)值為10.38億元。

微生物大量地存在于腸道中,將其作為棲息地。腸道不僅有復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng),而且其作為宿主生命活動(dòng)的重要組成部分,對(duì)宿主的生長(zhǎng)發(fā)育也具有重要的影響(劉增新等,2017)。穩(wěn)定的腸道微生物區(qū)系對(duì)多種宿主功能都有影響,如腸道微生物的建立及感染敏感性等。腸道微生物對(duì)宿主免疫、宿主適應(yīng)性及宿主營(yíng)養(yǎng)代謝等宿主的生命活動(dòng)有十分重要影響(Wuet al,2010；Ravelet al,2014)。而飼糧改變會(huì)影響動(dòng)物腸道微生物種類(lèi)及數(shù)量(Xuet al,2015)。為了更好地理解腸道微生物群與宿主之間的關(guān)系,有必要確定腸道微生物的組成及其比例。目前,對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物腸道微生物多樣性進(jìn)行的研究很多,如黃顙魚(yú)(Pelteobagrus fulvidraco)、草魚(yú)(Cten opharyngodonidellus)、對(duì)黑虎蝦(P.monodon)和太平洋藍(lán)蝦(Litopenaeus stylirostris)(Wuet al,2010；Rungrassameeet al,2014；Liet al,2015；Cardonaet al,2016),但對(duì)烏鱧腸道微生物的研究鮮有報(bào)道。

目前不少養(yǎng)殖戶為了降低養(yǎng)殖成本,在烏鱧的養(yǎng)殖過(guò)程中投喂畜禽內(nèi)臟,但投喂畜禽內(nèi)臟對(duì)烏鱧的影響尚未明確。本試驗(yàn)以烏鱧為研究對(duì)象,將冰鮮魚(yú)、畜禽內(nèi)臟兩種投喂方式應(yīng)用于烏鱧的養(yǎng)殖,對(duì)烏鱧消化道的微生物開(kāi)展相關(guān)研究,評(píng)價(jià)不同的養(yǎng)殖方式對(duì)烏鱧腸道中微生物菌群種類(lèi)的影響,為評(píng)價(jià)烏鱧的產(chǎn)品質(zhì)量,發(fā)展健康綠色生態(tài)養(yǎng)殖提供參考。為探究飼糧因素對(duì)烏鱧腸道的菌群組成與宿主間特異性關(guān)系等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物試驗(yàn)

試驗(yàn)場(chǎng)地選址于浙江省嘉興市某漁場(chǎng),選擇健康、規(guī)格基本一致的烏鱧(Ophiocephalus argus)隨機(jī)分為試驗(yàn)W1組、W2組。每組2個(gè)重復(fù),分別飼喂于4個(gè)池塘中,W1組投喂冰鮮魚(yú),W2組投喂畜禽內(nèi)臟。以烏鱧體重4%左右投喂飼糧。每日7：00與17：00各投喂1次,共投喂為12周。

1.2 樣品采集

烏鱧養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行樣品采集,每組取6尾魚(yú),無(wú)菌操作臺(tái)中將其腸道迅速分離,內(nèi)容物取出并混合后,于液氮中速凍,最后置于-80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總DNA的提取

從-80°C超低溫冰箱取出兩組樣品,在無(wú)菌條件下用電動(dòng)組織研磨器充分研磨,參照糞便基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明步驟提取總DNA。將提取的DNA取2μL利用電泳儀(120V,30min)檢測(cè),選取具有單一條帶的DNA作為模板,擴(kuò)增其16S rRNA V4—V5區(qū),擴(kuò)增引物采用515F和907R。PCR采用20μL擴(kuò)增體系；4μL 5×Fast Pfu Buffer,2μL 2.5mmol/L dNTPs,0.4μL 上游引物,0.4μL 下游引物,0.4μL Fast Pfu Polymerase,10ng Template DNA,加滅菌水補(bǔ)至20μL。擴(kuò)增條件；95°C 預(yù)變性 2min；25 個(gè)循環(huán),95°C 30s,55°C 30s,72°C 45s；72°C 延伸 10min。

1.4 文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證,目的條帶膠采用QIA quick GelEx-traction Kit試劑盒(Qiagen,德國(guó))回收純化,將純化產(chǎn)物送至上海美吉生物有限公司,測(cè)序平臺(tái)為Illumina MiSeq。DNA樣品送至上海生工進(jìn)行Illumina Hiseq高通量測(cè)序分析,樣品編號(hào)分別為；W1-1、W1-2；W2-1、W2-2。

1.5 生物信息學(xué)分析

首先將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,然后進(jìn)行OTU聚類(lèi)分析,采用 Alpha多樣性分析、衡量樣本物種的多樣性。對(duì)序列進(jìn)行物種分類(lèi),并對(duì)每個(gè)樣本和每個(gè)物種單元分類(lèi)進(jìn)行序列豐度的計(jì)算,構(gòu)建樣本和物種分類(lèi)單元序列的豐度矩陣,分析物種的分類(lèi)?；贠TU聚類(lèi)分析及物種分類(lèi)的共有進(jìn)行多維度分析。繪制所有群落分布間的進(jìn)化樹(shù)圖,同時(shí)繪制OTU聚類(lèi)結(jié)果中豐度較高的OTU進(jìn)化樹(shù)圖,并標(biāo)注出其所屬的群落分布信息,對(duì)所涉及的物種進(jìn)行分類(lèi)樹(shù)構(gòu)建。使用Beta多樣性分析,比較多(組)樣本之間的差別度量。最后進(jìn)行菌群差異分析和功能預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列數(shù)與OTU數(shù)量統(tǒng)計(jì)

2.1.1 樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 高通量測(cè)序的最原始的測(cè)序序列數(shù)、經(jīng)過(guò)處理和質(zhì)控后得到的最終序列以及序列平均長(zhǎng)度(表1),由表可知,每個(gè)樣品所得條帶序列均在15000條以上,共得到序列242609條。

去除嵌合體及非特異性擴(kuò)增序列后,得到數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。由表2可知,去除嵌合體及非特異性擴(kuò)增序列后W1-1、W1-2、W2-1、W2-2的序列數(shù)分別為47800、54448、38546、40050。

2.1.2 基因OTU的VENN圖 VENN圖用來(lái)統(tǒng)計(jì)樣本中共有和獨(dú)有OTU的數(shù)目,直觀展現(xiàn)出環(huán)境樣品OTU數(shù)目組成的相似性及重疊情況等。優(yōu)化序列在 Silva數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比對(duì),OTU序列分類(lèi)(97%相似水平)是采用RDP classifier貝葉斯算法進(jìn)行的,W1-1組腸道細(xì)菌獲得OTU 1072個(gè),W1-2組腸道細(xì)菌獲得OTU 1559個(gè),W2-1組腸道細(xì)菌獲得OTU2385個(gè),W2-2組腸道細(xì)菌獲得OTU 1729個(gè),W1組和W2組共同含有OTU 19個(gè)(圖1)。

表1 各樣本數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計(jì)Tab.1 Statistics of sample data information

表2 處理后結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Tab.2 Statistical results after treatment

圖1 OTU分布Venn圖Fig.1 Venn diagram of OTU distribution

2.1.3 基于OTU的樣本聚類(lèi)樹(shù) 樣本聚類(lèi)樹(shù)圖(圖2)通過(guò)樹(shù)枝結(jié)構(gòu)直觀反映出多個(gè)樣品間的相似性和差異關(guān)系。根據(jù)beta多樣性距離矩陣進(jìn)行層次聚類(lèi)(Hierarchical clustering)分析,再使用非加權(quán)組平均法UPGMA(Unweighted pair group method with arithmetic mean)算法進(jìn)行樹(shù)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)建,從而獲得樹(shù)狀關(guān)系形式進(jìn)行可視化分析。

2.2 腸道菌群的α多樣性

2.2.1 Alpha多樣性 各樣品的OTU數(shù)目、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)及樣品覆蓋率如表3所示,由表3可知,4組樣品的覆蓋率均在96%以上,較好地反映了樣本菌群情況,W1樣品中ACE和Chao1指數(shù)最大,說(shuō)明飼喂冰鮮魚(yú)烏鱧腸道中菌群總數(shù)最多,W2樣品中OTU數(shù)目最多且Shannon指數(shù)最高,說(shuō)明飼喂畜禽內(nèi)臟烏鱧腸道中菌群豐度最高,多樣性最好。

圖2 基于OTU樣本的聚類(lèi)樹(shù)圖Fig.2 Bray tree plot based on OUT

2.2.2 Alpha指數(shù)稀疏曲線 通過(guò)MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)飼喂冰鮮魚(yú)和畜禽內(nèi)臟烏鱧腸道細(xì)菌的16S rDNA基因V3—V4區(qū)進(jìn)行微生物多樣性的檢測(cè)分析,獲得W1組和W2組平均細(xì)菌總優(yōu)化序列 51124和39298條。采用Mothur軟件繪制稀釋曲線(Shannon rarefaction plot)。曲線慢慢走向平穩(wěn),即表明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理可靠(圖3)。

2.3 烏鱧腸道菌群結(jié)構(gòu)

2.3.1 PCA分析 見(jiàn)圖4。不同顏色的點(diǎn)代表不同的樣本,若空間距離越近,則相似度越高。從圖4中均可以看出,W1冰鮮魚(yú)飼喂烏鱧腸道中菌群差異比較小,W2飼喂畜禽內(nèi)臟烏鱧腸道中菌群相似度較高。

圖3 Alpha指數(shù)稀疏曲線圖Fig.3 Alpha exponential sparse curve

2.3.2 樣本間菌群豐度差異分析 樣本間菌群豐度差異分析(圖5)顯示,W1組飼喂冰鮮魚(yú)烏鱧腸道中未分類(lèi)菌群豐度較小,W2組畜禽內(nèi)臟飼喂烏鱧腸道中未分類(lèi)菌群豐度較大；W1組畜禽內(nèi)臟飼喂烏鱧腸道中鄰單胞菌屬(Plesiomonas)占極大比例,W2組鄰單胞菌屬(Plesiomonas)豐度顯著小于W1組。W2組未分類(lèi)菌群豐度差異不明顯,W1組中鄰單胞菌屬(Plesiomonas)豐度差異明顯。

2.3.3 屬水平物種豐度 通過(guò)屬分類(lèi)水平上的統(tǒng)計(jì)分析,W1組顏色偏藍(lán),W2組顏色偏紅,說(shuō)明飼喂畜禽內(nèi)臟烏鱧腸道中菌群豐度高于飼喂冰鮮魚(yú)烏鱧組(圖6,圖7)；通過(guò)種屬分類(lèi)水平上的統(tǒng)計(jì)分析,確定飼喂冰鮮魚(yú)烏鱧組腸道種屬種類(lèi)較少,其中優(yōu)勢(shì)種屬為鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、狹義梭菌屬(Clostridium sensu stricto)、鯨蠟菌屬(Cetobacterium),其他及未分類(lèi)細(xì)菌；飼喂畜禽內(nèi)臟烏鱧組腸道種屬種類(lèi)比較豐富,其中優(yōu)勢(shì)種屬為狹義梭菌屬(Clostridium sensu stricto)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、Spartobacteria、甲基副球菌屬(Methyloparacoccus)、桿菌屬(Alsobacter)、Saccharibacteria、分支桿菌屬(Mycobacterium)、其他及未分類(lèi)細(xì)菌。

圖4 基于OTU的PCA圖Fig.4 PCA based on OTU

3 討論

目前很多養(yǎng)殖戶為了降低養(yǎng)殖成本,在烏鱧的養(yǎng)殖過(guò)程中投喂畜禽內(nèi)臟,投喂畜禽內(nèi)臟對(duì)烏鱧的影響尚未明確。此外,魚(yú)類(lèi)是典型的水生脊椎動(dòng)物,物種數(shù)目繁多,其消化道中同樣棲居著種類(lèi)繁多的微生物,發(fā)揮著重要的生理功能(王純,2017),腸道中豐富的微生物已被證明對(duì)宿主具有舉足輕重的影響(Benjaminoet al,2018)。水產(chǎn)動(dòng)物腸道微生物存在于宿主腸道中特定的位置,并且在宿主體內(nèi)平衡、代謝、腸道發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育以及進(jìn)化等方面發(fā)揮重要的作用(邢孟欣,2013)。為了揭示一定時(shí)間內(nèi),冰鮮魚(yú)、畜禽內(nèi)臟兩種不同飼糧的組成是如何影響烏鱧腸道的菌群組成,課題組設(shè)計(jì)了本試驗(yàn)。

圖5 差異比較的誤差線圖Fig.5 Error line diagram for difference comparisons

上述研究結(jié)果表明,投飼冰鮮魚(yú)飼料和畜禽內(nèi)臟飼料的烏鱧腸道細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群種類(lèi)和數(shù)量方面相似度不高,差異顯著,而且飼喂畜禽內(nèi)臟飼料烏鱧腸道細(xì)菌的群落種類(lèi)多樣性、OTU豐富度和物種總數(shù)均高于飼喂冰鮮魚(yú)烏鱧。飼喂畜禽內(nèi)臟飼料烏鱧腸道細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群為狹義梭菌屬(Clostridium sensu stricto)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、Spartobacteria、甲基副球菌屬(methyloparacoccus)、桿菌屬(Alsobacter)、Saccharibacteria、分支桿菌屬(Mycobacterium),而飼喂冰鮮魚(yú)飼料烏鱧腸道細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群為鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、狹義梭菌屬(Clostridiumsensustricto)、鯨蠟菌屬(Cetobacterium)。飼喂冰鮮魚(yú)飼料烏鱧和飼喂畜禽內(nèi)臟飼料烏鱧腸道細(xì)菌有2種相同的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群,分別為狹義梭菌屬(Clostridium sensu stricto)和鄰單胞菌屬(Plesiomonas),狹義梭菌屬在低蛋白質(zhì)的飼糧生長(zhǎng)育肥豬糞便中有顯著降低(王晶等,2018),Fan等(2017)研究表明,飼糧蛋白質(zhì)水平的降低,豬回腸中狹義梭菌屬的數(shù)量明顯降低,分析原因認(rèn)為是飼糧蛋白質(zhì)水平的降低導(dǎo)致發(fā)酵底物氮源的缺乏而引起的。狹義梭菌屬(Clostridium sensu stricto)同時(shí)是飼喂冰鮮魚(yú)飼料烏鱧和飼喂畜禽內(nèi)臟飼料烏鱧腸道的優(yōu)勢(shì)菌群,這也與投喂飼糧有關(guān),冰鮮魚(yú)和畜禽內(nèi)臟均為高蛋白質(zhì)飼糧。De La Rosa(2011)通過(guò)454焦磷酸測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)鄰單胞菌屬是羅非魚(yú)腸道中的優(yōu)勢(shì)屬之一,此外,吳振聰?shù)?2019)利用PCR-DGGE和Illumina測(cè)序技術(shù)研究了羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)腸道菌群結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌屬為鯨桿菌屬(Cetobacterium)、Neochlamydia、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和分支桿菌屬(Mycobacterium)等6個(gè)菌屬和一些未知屬。鄰單胞菌屬中的常見(jiàn)菌是一些條件致病菌,如食用未煮熟的貝類(lèi)會(huì)導(dǎo)致Plesiomonas shigelloides感染,引起腹瀉(Holmberget al,1984,1986；Niedzielaet al,2002)。但Larsen等(2014)對(duì)斑點(diǎn)叉尾(Ictalurus punctatus)、大嘴鱸(Micropterus salmoides)和藍(lán)鰓鱸(Lepomis macrochirus)研究表明鄰單胞菌屬也是腸道中的正常菌群。本研究檢測(cè)到的鄰單胞菌屬只能鑒定到屬水平,種水平暫無(wú)分類(lèi),其在魚(yú)腸道中的功能有待進(jìn)一步研究。有研究表明鯨桿菌屬能發(fā)酵多肽碳水化合物,還可以生成維生素B12(Tsuchiyaet al,2008),對(duì)魚(yú)類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)吸收發(fā)揮重要的作用。Li等(2015)研究表明鯨蠟菌屬可以產(chǎn)生醋酸,醋酸可促進(jìn)蛋白質(zhì)及碳水化合物和脂肪的代謝。冰鮮魚(yú)含有豐富的蛋白質(zhì),且投喂冰鮮魚(yú)烏鱧腸道鯨蠟菌屬是優(yōu)勢(shì)菌群,有可能與烏鱧腸道消化需求有關(guān)。Eissa等(2011)在大量急性死亡的石斑魚(yú)肝臟中,Lara-Flores等(2014)在墨西哥大量死亡的羅非魚(yú)中檢測(cè)到分支桿菌屬的細(xì)菌,分支桿菌屬中的一些種類(lèi)如M.fortuitum和M.marinum,多與水產(chǎn)動(dòng)物疾病暴發(fā)有關(guān)。甲基副球菌屬(Methyloparacoccus)歸屬于γ-變形菌門(mén)(Gammaproteobacteria)TypeⅠ型好氧甲烷氧化菌,好氧甲烷氧化菌主要存在于甲烷和氧氣共存的微小界面空間內(nèi),如水-空氣界面、土壤-空氣、植物根際及植物內(nèi)部。Hoefman等(2014)于池塘水中發(fā)現(xiàn)的一種新型甲烷氧化菌,該菌在其他魚(yú)類(lèi)中尚未見(jiàn)報(bào)道,這有可能與烏鱧是底層生物有關(guān)。桿菌屬(Alsobacter)在土壤中也被檢測(cè)出(Baoet al,2014),但其功能尚不明確。Spartobacteria屬在水和南美白對(duì)蝦腸道中亦被檢測(cè)出,其功能亦尚不明確。Saccharibacteria屬尚未見(jiàn)在水生動(dòng)物腸道中被檢測(cè)出的報(bào)道。Benjamino等(2018)研究證明飼糧組成會(huì)影響動(dòng)物后腸微生物的組成,但核心的菌群保持相對(duì)穩(wěn)定。不同物種之間腸道微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同,但在同一物種的特定發(fā)育階段能保持相對(duì)穩(wěn)定(饒劉瑜等,2018)。不同的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物,乃至相同的水產(chǎn)動(dòng)物,其腸道的優(yōu)勢(shì)種屬不同,可能反映了飼糧、環(huán)境、飼養(yǎng)密度和溫度對(duì)腸道微生物區(qū)系的影響。

圖6 屬分類(lèi)水平多樣本熱圖Fig.6 Microbial community heatmap at the genus level

圖7 屬分類(lèi)水平所有樣本群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig.7 Distribution of microbial community at the genus level

4 結(jié)論

本研究表明W1組飼喂冰鮮魚(yú)飼料和W2組飼喂畜禽內(nèi)臟飼料的烏鱧腸道細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群種類(lèi)和數(shù)量方面相似度不高,差異顯著,且W2組烏鱧腸道細(xì)菌群落種類(lèi)的多樣性、OTU的豐富度和物種的總數(shù)均高于W1烏鱧腸道；W1組腸道有益菌OTU豐富度大于W2組,且W2組還存在一些潛在致病菌,從烏鱧腸道微生物角度研究,冰鮮魚(yú)較畜禽內(nèi)臟更適合作為烏鱧的飼糧。