劉婉玉，寧春紅，高基民

(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的癌癥之一[1]，85%的肺癌是由吸煙導(dǎo)致的[2]。苯并芘(benzoapyrene，B[a]P)是煙草煙霧的主要成分之一，是重要的完全致肺癌多環(huán)芳烴類化合物[3-4]，存在于煤焦油、石油、木材等燃燒產(chǎn)生的煙氣，香煙煙霧、汽車尾氣和焦化、煉油、塑料等工業(yè)污水中，在肺癌的發(fā)生中扮演著重要的角色[4]。已有研究證實(shí)，通過皮下注射或氣管灌注苯并芘可誘導(dǎo)小鼠肺部發(fā)生腫瘤，吸入多環(huán)芳烴污染物可導(dǎo)致肺癌發(fā)生率升高。炎癥是重要的腫瘤特性之一[5-6]，慢性炎癥與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，主要包括促進(jìn)腫瘤惡變、腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲、腫瘤組織血管的生成[7]。慢性炎癥可以破壞免疫系統(tǒng)識別惡變前細(xì)胞的能力，通過多種機(jī)制促進(jìn)多種類型腫瘤的起始和進(jìn)展[8]。其中，炎癥細(xì)胞通過釋放多種細(xì)胞因子、趨化因子來調(diào)節(jié)肺慢性炎癥微環(huán)境，促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化并逐步發(fā)展到癌前病變及癌轉(zhuǎn)移，在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。因此，探究肺癌發(fā)生發(fā)展過程中免疫微環(huán)境相關(guān)免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的動態(tài)變化及作用，有望通過改善炎癥組織微環(huán)境，為肺癌的早期預(yù)防和免疫治療提供新策略。在該過程中，免疫微環(huán)境可誘導(dǎo)髓源抑制性細(xì)胞(特異性免疫抑制細(xì)胞)的產(chǎn)生，抑制宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)，在腫瘤相關(guān)的免疫抑制方面起著重要的作用[9]。髓源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是一種異質(zhì)性的細(xì)胞群體，由未成熟的巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和其他早期分化的髓系細(xì)胞組成，在小鼠中的特異性表面標(biāo)志為CD11b+Gr-1+[10]，是一種重要的機(jī)體免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，其免疫抑制功能主要是通過各種效應(yīng)分子來調(diào)節(jié)。MDSCs在癌癥、慢性感染及由細(xì)菌引起的感染性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中都起著重要的作用[11]。盡管在大多數(shù)癌癥小鼠模型中都發(fā)現(xiàn)有MDSCs的積累，但在慢性炎癥至肺癌發(fā)生發(fā)展動態(tài)過程中對MDSCs的研究較少。因此，本研究利用苯并芘誘導(dǎo)KM小鼠，構(gòu)建肺慢性炎癥和肺癌模型[12]，通過免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)對小鼠肺組織和脾臟中MDSCs數(shù)量變化進(jìn)行檢測，同時結(jié)合臨床肺組織標(biāo)本進(jìn)一步驗(yàn)證MDSCs在肺癌病人肺組織中的表達(dá)情況，旨在探討MDSCs在苯并芘誘導(dǎo)的小鼠肺慢性炎癥至肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的變化及作用，不僅有助于肺慢性炎癥和肺癌的有效防治，而且為臨床采用其相關(guān)拮抗劑對肺慢性炎癥的治療和肺癌的預(yù)防提供了適宜的動物模型和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物

SPF級雄性昆明小鼠，購自上海斯萊克動物實(shí)驗(yàn)中心，引進(jìn)飼養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，6～8周齡，體重(60±5)g。臨床肺組織標(biāo)本：癌、癌旁、正常組織石蠟塊取自溫州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科。

1.1.2 試劑

苯并芘購自中國阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；玉米油購自美國Sigma公司；CD11b、Gr-1流式抗體購自美國BioLegend公司；免疫組化Gr-1抗體購自美國eBioscience公司；免疫組化CD33抗體購自英國Abcam公司。

1.2 方法

將60只SPF級昆明種小鼠，置于室溫25 ℃，相對濕度55%，12 h明暗交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水。適應(yīng)7 d后，將小鼠隨機(jī)分成2組，經(jīng)右側(cè)胸壁穿刺肺內(nèi)注射，對照組給予50 μL玉米油，處理組給予50 μL苯并芘-玉米油溶液(苯并芘濃度為20 mg·mL-1)，每周處理1次，共4次。每日觀察小鼠飲食、排便、毛色、精神和活動狀況。分別在處理后30、90、180 d處死小鼠，采取小鼠肺、脾臟組織以供檢測。

1.3 樣品測定

1.3.1 小鼠肺組織形態(tài)觀察

將小鼠肺組織取出，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，光鏡下觀察組織細(xì)胞形態(tài)改變，比較炎癥細(xì)胞浸潤程度及腫瘤細(xì)胞浸潤情況。

1.3.2 小鼠肺組織Gr-1、臨床肺組織標(biāo)本CD33的表達(dá)情況

將小鼠肺組織取出，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，經(jīng)免疫組織化學(xué)兩步法(脫蠟復(fù)水、抗原修復(fù)、封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、脫水、透明、封片)染色，光鏡下觀察不同視野細(xì)胞染色數(shù)目及程度。臨床肺組織標(biāo)本：癌、癌旁、正常組織石蠟塊連續(xù)切片，染色、觀察方法同上。

1.3.3 MDSCs浸潤情況

將小鼠肺組織和脾臟取出，研磨消化制成單細(xì)胞懸液，200目尼龍膜過濾，Anti-CD11b-APC、Anti-CD11b-FITC、Anti-Gr-1-PerCP-Cy5.5、Anti-Gr-1-PE-Cy7流式抗體染色，4 ℃避光孵育30 min，IMDM培養(yǎng)基清洗3遍，上機(jī)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

Gr-1表達(dá)的半定量分析用IPP6.0軟件，數(shù)據(jù)用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，ns表示差異不顯著(P>0.05)，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠肺組織細(xì)胞形態(tài)

小鼠右側(cè)肺組織切片如圖1。如圖所示，相較于對照組小鼠，處理組小鼠肺組織出現(xiàn)了明顯的炎癥反應(yīng)和病理改變，且隨著暴露時間延長炎癥反應(yīng)和病理改變逐漸明顯。苯并芘暴露180 d后，小鼠肺組織出現(xiàn)大量異型細(xì)胞，且伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺組織的正常生理結(jié)構(gòu)消失改變，出現(xiàn)肺癌組織病理特征。對照組小鼠肺泡腔、毛細(xì)血管及終末細(xì)支氣管均無明顯的結(jié)構(gòu)異常。

圖1 小鼠肺組織的切片(400×)

2.2 小鼠肺組織Gr-1的表達(dá)情況

Gr-1是髓系分化狀態(tài)細(xì)胞表達(dá)的蛋白，MDSCs是髓源抑制性細(xì)胞，在小鼠中其表面標(biāo)志為CD11b+Gr-1+。本研究以Gr-1為MDSC的標(biāo)志蛋白進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，不同處理組小鼠肺組織Gr-1的表達(dá)及定位情況代表圖見圖2，不同處理對小鼠肺組織Gr-1表達(dá)水平的影響差異見圖3。如圖所示，苯并芘暴露后，Gr-1主要位于支氣管黏膜上皮、肺泡上皮細(xì)胞核中，陽性染色為棕黃色；苯并芘暴露30、90、180 d后，小鼠肺組織中Gr-1的染色強(qiáng)度均明顯高于對照組，并隨暴露時間的延長逐漸增強(qiáng)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果表明，MDSCs很有可能參與了苯并芘誘導(dǎo)小鼠肺慢性炎癥至肺癌的發(fā)生發(fā)展。

圖2 不同處理小鼠肺組織Gr-1的表達(dá)及定位

圖3 不同處理小鼠肺組織Gr-1表達(dá)水平

2.3 小鼠肺組織中MDSCs浸潤情況

不同處理組小鼠肺組織中MDSCs表達(dá)流式細(xì)胞圖見圖4，不同處理對小鼠肺組織MDSCs表達(dá)水平的影響差異見圖5。如圖所示，苯并芘暴露后30、90、180 d小鼠肺組織中MDSCs百分比相比玉米油對照組顯著增加，且與玉米油對照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果表明，MDSCs在苯并芘誘導(dǎo)的肺慢性炎癥至肺癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。

a—玉米油暴露30 d；b—玉米油暴露90 d；c—玉米油暴露180 d；d—苯并芘暴露30 d；e—苯并芘暴露90 d；f—苯并芘暴露180 d。圖4 不同處理小鼠肺組織MDSCs流式細(xì)胞

2.4 小鼠脾臟中MDSCs浸潤情況

脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。不同處理組小鼠脾臟中MDSCs表達(dá)流式細(xì)胞圖見圖6，不同處理對小鼠脾臟中MDSCs表達(dá)水平的影響差異見圖7。如圖所示，苯并芘暴露180 d時，MDSCs百分比顯著增加；苯并芘暴露30、90、180 d時，小鼠脾臟中MDSCs百分比相比玉米油對照組顯著增多。

a—玉米油暴露30 d；b—玉米油暴露90 d；c—玉米油暴露180 d；d—苯并芘暴露30 d；e—苯并芘暴露90 d；f—苯并芘暴露180 d。圖6 不同處理小鼠脾臟MDSCs流式細(xì)胞

圖7 不同處理小鼠脾臟MDSC細(xì)胞水平

2.5 肺癌組織中CD33的表達(dá)情況

目前人體內(nèi)的MDSCs表型尚未明確統(tǒng)一，不同腫瘤類型中的MDSCs具有異質(zhì)性。最常見的癌癥患者體內(nèi)分離出來的MDSCs表型為CD11b+CD14-，此外還有CD33+、CD34+、CD15+和MHC-Ⅱ類分子HLA-DR-等標(biāo)志。有報道稱,肺癌患者體內(nèi)MDSCs(CD33+HLA-DR-CD11b+Lin-)的含量與其分期有關(guān)，Ⅳ期腫瘤患者伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時體內(nèi)MDSC的含量明顯增高。因此，本研究以CD33作為MDSCs的標(biāo)志物，來進(jìn)一步驗(yàn)證MDSCs在肺癌病人肺組織中的表達(dá)情況。本研究選取了25例肺腺癌臨床標(biāo)本，與其對應(yīng)的癌旁標(biāo)本13例、正常標(biāo)本11例，免疫組織化學(xué)染色檢測CD33表達(dá)的情況。如圖8所示，CD33定位于細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)中也有少量表達(dá)，大部分表達(dá)于癌巢間正常細(xì)胞。MDSCs細(xì)胞核較大，為腎形和馬蹄形，胞漿豐富，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈現(xiàn)出髓系前體細(xì)胞形態(tài)，于包膜部位呈現(xiàn)不同程度的棕黃色。正常組織(陽性比率0/11)和癌旁組織(陽性比率1/13)基本無陽性染色，而肺癌組織(陽性比率14/25)中CD33陽性染色程度升高。臨床標(biāo)本研究表明，相比正常和癌旁組織(基本陰性表達(dá))，肺癌組織中MDSCs出現(xiàn)了不同程度的表達(dá)，可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著作用。

圖8 人正常肺組織、癌旁組織和肺腺癌CD33的表達(dá)

3 討論

多環(huán)芳香碳?xì)浠衔?polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH)及其衍生物與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。已有研究證實(shí)，香煙中有60多種致癌化合物，其中B[a]P及其代謝產(chǎn)物B[a]PDE(B[a]P在細(xì)胞內(nèi)通過細(xì)胞色素P450代謝生成)是香煙中最為明確的重要致肺癌化合物，主要存在于煤焦油、香煙煙霧、汽車尾氣和工業(yè)廢氣污水中，可應(yīng)用于多種動物模型中，用于多種腫瘤的研究。近年來，許多相關(guān)文獻(xiàn)報道B[a]P與許多癌癥密切相關(guān)，已經(jīng)證明B[a]P能誘發(fā)皮膚癌、肺癌和胃癌等多種癌癥。B[a]P能通過多種途徑誘導(dǎo)肺癌，并且常用小鼠來建立肺癌動物模型，便于直接觀察肺慢性炎癥至肺癌的動態(tài)演變過程和肺癌發(fā)生發(fā)展過程的形態(tài)變化。已有文獻(xiàn)報道B[a]P與肺癌之間存在著密切聯(lián)系，并通過霧化吸入、腹腔注射、灌胃等多種方法成功構(gòu)建動物的肺癌模型[13]。本研究將B[a]P溶入玉米油中，采用經(jīng)胸壁穿刺肺內(nèi)直接注射的方法構(gòu)建小鼠肺癌模型，該方法創(chuàng)傷小，不易造成氣胸，小鼠恢復(fù)快，且定位準(zhǔn)確。

肺癌組織學(xué)表現(xiàn)復(fù)雜多樣，總體可以分為小細(xì)胞肺癌(small cel lung cancer，SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中非小細(xì)胞肺癌占80%。臨床上將肺癌組織分為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌3類。80%～90%的非小細(xì)胞肺癌與煙草煙霧直接相關(guān)，而小細(xì)胞肺癌幾乎都與吸煙有關(guān)[14-15]。肺上皮細(xì)胞經(jīng)B[a]P誘導(dǎo)后，既可以發(fā)展為鱗癌、腺癌，也可以發(fā)展為未分化細(xì)胞癌。一般動物模型可以同時出現(xiàn)肺鱗癌、腺癌和未分化癌，這種現(xiàn)象類似于臨床肺癌。因此，本研究構(gòu)建的小鼠肺癌模型不僅適用于研究肺癌的發(fā)病機(jī)制，也能用于評價肺癌的化療、放療方案及預(yù)后判斷。本研究應(yīng)用的小鼠肺組織經(jīng)病理學(xué)診斷，根據(jù)B[a]P誘導(dǎo)的小鼠肺慢性炎癥至肺癌模型中30、90、180 d的肺組織病理變化，可以明確判定小鼠可由肺慢性炎癥發(fā)展為肺腺癌，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

慢性炎癥以持續(xù)的免疫細(xì)胞招募和炎性介質(zhì)產(chǎn)生為主要特征，與癌癥之間存在密切關(guān)系。越來越多的研究表明，肺慢性炎癥與肺癌的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。人類肺癌的發(fā)生主要是由慢性炎癥淋巴細(xì)胞和髓源性細(xì)胞的浸潤，以及免疫反應(yīng)的改變導(dǎo)致。在荷瘤宿主中，有多種不同的免疫抑制細(xì)胞，構(gòu)成了一個免疫抑制網(wǎng)絡(luò)[16-17]。在不同功能的免疫抑制細(xì)胞中，CD11b+Gr-1+髓系起源細(xì)胞被認(rèn)為是一種重要的免疫抑制細(xì)胞[18]。髓源抑制性細(xì)胞(MDSCs)是一種重要的調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的異質(zhì)性的細(xì)胞群體，由未成熟的巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和其它早期分化的髓系細(xì)胞組成，對腫瘤逃脫免疫反應(yīng)做出了重要的貢獻(xiàn)[19]。MDSCs是髓源抑制性細(xì)胞，其在小鼠中的特異性表面標(biāo)志為CD11b+Gr-1+[20]，主要包括單核系monocytic MDSCs(M-MDSCs，表型為CD11b+Ly6G-Ly6Chigh)和粒系granulocytic MDSCs(G-MDSCs，表型為CD11b+Ly6G+Ly6Clow)[21]。MDSCs通過抑制機(jī)體固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的能力抑制了宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)，由于其具有免疫抑制功能近年來受到廣泛關(guān)注。Gr-1是髓系分化狀態(tài)細(xì)胞表達(dá)的蛋白。本研究通過構(gòu)建小鼠肺癌模型、HE染色、免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)等方法，研究了MDSCs在B[a]P誘導(dǎo)小鼠肺慢性炎癥至肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵作用。結(jié)合臨床肺癌標(biāo)本進(jìn)一步驗(yàn)證MDSCs在肺癌病人肺組織中的表達(dá)情況，提示MDSCs可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。在此研究基礎(chǔ)之上，未來可對MDSCs在肺慢性炎癥至肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體分子機(jī)制做進(jìn)一步研究，這對臨床上將其作為治療靶點(diǎn)，有針對性地對肺慢性炎癥進(jìn)行治療及預(yù)防，從而對肺癌的早期預(yù)防起著重要的作用。