陳 直，宋 偉, 朱永娜，劉 茜

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠 233000)

慢性根尖肉芽腫是一種最常見(jiàn)的慢性根尖疾病。該疾病以炎性骨組織破壞吸收為特征[1]。促炎因子和抗炎因子(如細(xì)胞白介素-17，白細(xì)胞介素-27及白細(xì)胞介素-12等)在慢性根尖肉芽腫的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[2]。

白細(xì)胞介素-35(IL-35)是一種新發(fā)現(xiàn)的、主要由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tegulatory T cells, Tregs)分泌的免疫調(diào)節(jié)因子，該因子隸屬于白細(xì)胞介素-12(Interleukin-12，IL-12)家屬[3]。文獻(xiàn)報(bào)道Tregs可以抑制慢性根尖周炎中白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17, IL-17)的分泌，抑制根尖組織炎性反應(yīng)及組織破壞[4]。IL-12家族成員還包括白細(xì)胞介素-27(Interleukin-27，IL-27)、白細(xì)胞介素-12(Interleukin-12, IL-12)及白細(xì)胞介素-23(Interleukin-23, IL-23)三種炎性因子。研究發(fā)現(xiàn)IL-12家族中的IL-27、IL-12及IL-23調(diào)節(jié)慢性根尖周病發(fā)生進(jìn)展，其中IL-12及IL-27發(fā)揮雙重作用[2]。

Tregs及IL-12家族炎性因子調(diào)節(jié)慢性根尖周炎的發(fā)生發(fā)展，扮演重要角色。但是，IL-35作為由Tregs分泌的IL-12家族的新成員，其慢性根尖周炎中的作用尚不清楚。因此，本課題探討IL-35在慢性根尖肉芽腫中的表達(dá)，分析其臨床意義，為促進(jìn)該疾病的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2018年3月～2018年5月就診于蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院、臨床及影像學(xué)診斷為慢性根尖肉芽腫的患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡在18～65歲；②無(wú)其他口腔疾病和全身系統(tǒng)性疾??；③3個(gè)月內(nèi)未服用抗生素和其他激素類(lèi)藥物；④X線診斷為慢性根尖肉芽腫；⑤有拔牙指征，且無(wú)拔牙禁忌證， 篩選患者并收集拔除患牙的根尖軟組織。另選取同期在本院因拔除阻生牙時(shí)切除的健康軟組織5例為對(duì)照組，患者符合納入標(biāo)準(zhǔn)的①②③⑤。所有操作均取得患者知情同意，并簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1HE染色:將收集到的軟組織用等離子水沖洗3 min，去除多余水分后，用4%福爾馬林固定24 h，然后石蠟包埋。將蠟塊切成4 μm厚的連續(xù)切片，按HE染色步驟進(jìn)行染色。封片后，倒置顯微鏡下觀察染色結(jié)果，根據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)判定標(biāo)本類(lèi)型。根尖肉芽腫病理判斷標(biāo)準(zhǔn)為可見(jiàn)以大量炎性細(xì)胞、毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞增生為主的炎性肉芽組織。篩選出影像學(xué)和病理診斷一致并符合要求的標(biāo)本，最終獲得試驗(yàn)組8例。

1.2.2免疫組織化學(xué):根據(jù)SP步驟，將符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包塊切成4 μm厚的連續(xù)切片。常規(guī)二甲苯脫蠟乙醇梯度脫水，等離子水漂洗。取出切片置于3%的過(guò)氧化氫溶液中充分滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水沖洗3次，3 min/次。然后將切片浸在0.01 M檸檬酸鈉緩沖液中加熱用于熱修復(fù)抗原，冷卻至室溫后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)充分洗滌。滴加封閉液，室溫20 min后去除多余液體，滴加一抗50 μl避光放于4℃恒溫箱12 h(一抗1∶400稀釋)?；謴?fù)至室溫后滴加羊抗兔二抗50 μl在37℃恒溫箱孵育30 min，用PBS充分洗滌。然后滴加鏈霉親和素-POD工作液，于37℃恒溫箱中孵育30 min，PBS充分洗滌，將滴加DAB顯色液滴，鏡下控制染色時(shí)間，待充分染色后，蒸餾水洗去多余液體；蘇木素輕度復(fù)染，脫水，中性膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。用PBS緩沖液代替一抗孵育切片作為陰性對(duì)照組。

陽(yáng)性試驗(yàn)結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上出現(xiàn)黃色或棕色顆粒。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照，并用Image-J軟件進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)分析采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析比較兩組中IL-35的表達(dá)情況。所有檢驗(yàn)均以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組HE結(jié)果比較：試驗(yàn)組見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大量成纖維細(xì)胞增生(見(jiàn)圖1A)。對(duì)照組見(jiàn)大量纖維組織及少量炎性細(xì)胞(見(jiàn)圖1B)。

圖1 兩組患者病理切片圖

2.2IL-35的表達(dá)情況:試驗(yàn)組和對(duì)照組均可見(jiàn)IL-35表達(dá)(如圖2)。試驗(yàn)組IL-35表達(dá)量為0.422±0.044，對(duì)照組則為0.086±0.011，經(jīng)t檢驗(yàn)，試驗(yàn)組IL-35表達(dá)高于對(duì)照組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.37，P<0.05)。

圖2 IL-35在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均表達(dá)

3 討論

慢性根尖肉芽腫是引起頜骨破壞的一種常見(jiàn)炎性疾病，根管系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)菌感染引起宿主一系列的免疫炎性反應(yīng)，這一反應(yīng)過(guò)程中的炎性細(xì)胞、促炎因子(如中性粒細(xì)胞、IL-17、白細(xì)胞介素-1)等導(dǎo)致根尖軟硬組織的破壞[5]。此外，在根尖肉芽腫的發(fā)生過(guò)程中機(jī)體啟動(dòng)保護(hù)機(jī)制，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增加，抗炎因子的分泌增多等[6-7]。IL-35是IL-12家族的最新成員，在炎性疾病中發(fā)揮抗炎作用。但是，IL-35是否在慢性根尖肉芽腫中表達(dá)尚不清楚。因此，本課題探索IL-35在慢性根尖肉芽腫中的表達(dá)情況，以期促進(jìn)該疾病的治療。

本課題發(fā)現(xiàn)在慢性根尖肉芽腫中IL-35的表達(dá)量為0.422±0.044，正常對(duì)照組中的表達(dá)量為0.086±0.011，前者表達(dá)較高。Aksha等人用RT-PCR比較了IL-35在慢性牙周炎及侵襲性牙周炎中的表達(dá)情況，研究發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者的牙齦組織中該因子的表達(dá)量高于侵襲性牙周炎患者的牙齦組織，正常牙齦組織中IL-35的表達(dá)量最低[8]。劉迪昕等人用ELISA研究發(fā)現(xiàn)牙周炎患者血清和齦溝液中IL-35的表達(dá)較健康者血清和齦溝液中的表達(dá)高[9]。本研究中IL-35在慢性根尖肉芽腫的表達(dá)較高，與之前牙周炎中IL-35表達(dá)較高結(jié)果一致，可能因?yàn)槁愿馊庋磕[和牙周炎相同均伴隨炎性骨吸收。

IL-35主要由誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌。Tregs能夠抑制炎性反應(yīng)，抑制疾病的進(jìn)展。體外研究發(fā)現(xiàn)Tregs在骨組織代謝中，抑制破骨細(xì)胞的形成，抑制骨組織的吸收破壞。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，Tregs能夠抑制類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)中骨組織破壞[10]。Carolina等人發(fā)現(xiàn)在牙周炎進(jìn)展過(guò)程中，向病損組織遷移的Tregs增多，同時(shí)隨著該細(xì)胞的增多，牙周骨組織破壞減緩，表明該細(xì)胞能夠減輕牙周炎炎性反應(yīng)及骨組織吸收[11]。2016年學(xué)者通過(guò)鼠實(shí)驗(yàn)性根尖周炎模型，探索Tregs在慢性根尖周炎中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著病情的發(fā)展，Tregs 量逐漸增加，而抑制 Tregs后，與對(duì)照組相比，其在疾病誘導(dǎo)的第14天和第21天根尖病損直徑較大。在野生型鼠根尖周炎中Tregs數(shù)量和根尖病損程度成反相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)在抑制鼠Tregs后，除了根尖周病損增大外，同時(shí)促炎因子(如IL-17、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1)分泌增高，Treg 標(biāo)志分子(如IL-10)及組織愈合分子的降低，可見(jiàn)Tregs 細(xì)胞在根尖炎進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮抑制疾病進(jìn)展，促進(jìn)組織愈合的作用[4]。本研究發(fā)現(xiàn)根尖肉芽腫中IL-35的表達(dá)較正常對(duì)照組高，可能與分泌IL-35的 Tregs在慢性根尖周炎增多相關(guān)。 IL-35與Tregs在慢性根尖肉芽腫的關(guān)系還需要進(jìn)一步的研究。

IL-35在炎性反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮抗炎作用，而IL-17是由Th17細(xì)胞分泌的一種重要的促炎因子，因此學(xué)者探索了IL-35與IL-17的關(guān)系。KochetkovaI等人在2010年發(fā)現(xiàn)IL-35通過(guò)刺激IL-10依賴的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞間接抑制IL-17的分泌[12]。后來(lái)Okada等人在2017年發(fā)現(xiàn)IL-35能夠通過(guò)抑制Th17的轉(zhuǎn)錄因子，直接抑制該因子的分化，抑制IL-17的分泌[13]。在炎性反應(yīng)疾病中，IL-35通過(guò)抑制Th17細(xì)胞的應(yīng)答，抑制IL-17的釋放發(fā)揮其抗炎作用。之前的研究發(fā)現(xiàn)在鼠實(shí)驗(yàn)性根尖周炎及人根尖周炎中均發(fā)現(xiàn)IL-17的表達(dá)，IL-17在根尖周炎的急性期表達(dá)升高，IL-17在慢性根尖炎的發(fā)生進(jìn)展中扮演重要角色[14]。在慢性根尖肉芽腫中，IL-35可能通過(guò)抑制IL-17，發(fā)揮其抑制作用，但還要進(jìn)一步研究。

綜上所述，慢性根尖肉芽腫中IL-35的表達(dá)較高，IL-35可能在該疾病中發(fā)揮抑制根尖區(qū)組織炎性反應(yīng)，抑制組織破壞的作用。但本實(shí)驗(yàn)有實(shí)驗(yàn)方法單一，樣本量的不足。