楊海嬌，楊廣民

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，吉林 長(zhǎng)春 130021)

HBV呈世界性流行，其在機(jī)體中的長(zhǎng)期存在，是肝癌發(fā)生發(fā)展的重要條件。Hp是一種酸性糖蛋白，主要合成于肝臟，廣泛存在于人類的血清及其他體液中[1]。人類Hp主要存在3種基因型：Hp1-1型、Hp2-1型和Hp2-2型[2]。由于Hp的基因多態(tài)性，近些年以Hp列為靶點(diǎn)探究其與疾病的關(guān)系，進(jìn)而分析疾病病因及發(fā)病機(jī)制已成為一個(gè)重要課題?，F(xiàn)選取在吉林省人民醫(yī)院治療的HBV-HCC患者，以健康體檢者作為對(duì)照，對(duì)所有受檢人員Hp基因型進(jìn)行檢測(cè)，以探究Hp的基因多態(tài)性與HBV感染相關(guān)肝癌的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:隨機(jī)選取2019年3月至12月在吉林省人民醫(yī)院治療的HBV-HCC患者98例，男81例，女17例，平均年齡61歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>18歲；(2)肝癌符合《中國(guó)肝癌診治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，慢性乙型肝炎符合《慢性乙型肝炎防治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有HCV、HIV、梅毒、肝吸蟲等其他病毒或寄生蟲感染；②有嚴(yán)重心、肺、腎等重要臟器疾病。同時(shí)選取健康體檢者104例作為對(duì)照。

1.2設(shè)備和試劑: Thermo Heraeus Fresco 17冷凍微量離心機(jī)，ABI PCR System 9700 PCR擴(kuò)增儀，引物合成參照文獻(xiàn)[3]，上游引物F1：5′-GCTGTCACTGCTGCGTAAAG-3′；下游引物R1：5′-GGTCAGTCTTTGGTTGGGTAG-3′；上游引物F2：5′-CCTGCCTCGTATTAACTGCACCAT-3′；下游引物R2：5′-CCGAGTGCTCCACATAGCCATGT-3′；由吉林省庫美生物科技有限公司合成特異性引物，PCR擴(kuò)增試劑盒由北京Promega生物技術(shù)有限公司提供，DNA提取試劑盒由天根生物工程股份有限公司提供，DNA Marker 由日本Takara公司提供。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1DNA提取和檢測(cè):留存HBV-HCC患者及健康體檢者EDTA抗凝全血2 ml，嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒說明書的操作要求從全血中提取基因組DNA。保存至-20℃條件下待用。

1.3.2PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系:應(yīng)用PCR技術(shù)特異性擴(kuò)增目的基因，體系包括模板DNA 2 μl，擴(kuò)增緩沖液及DNA聚合酶12.5 μl，10 μM上下游引物mix 2 μl，加入無核酶水補(bǔ)至25 μl。第1步用上游引物F1和下游引物R1擴(kuò)增Hp1的1757 bp產(chǎn)物和(或)Hp2的3481 bp產(chǎn)物，第2步用上游引物F2和下游引物R2擴(kuò)增Hp2特異性的349 bp產(chǎn)物。引物F2和R2與引物F1和R1擴(kuò)增體系相同。反應(yīng)條件：引物F1和R1擴(kuò)增時(shí)，95℃預(yù)變性2 min，95℃變性1 min，69℃退火并延伸2.5 min，共35個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)后72℃充分延伸10 min，冷卻至4℃。引物F2和R2擴(kuò)增反應(yīng)條件同上。

1.3.3Hp基因型的判定:取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物7 μl，依次點(diǎn)樣于0.8%瓊脂糖凝膠加樣孔中，并點(diǎn)樣相匹配的DNA Marker。電壓100 V，電泳40 min。應(yīng)用Tanon1600R全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)，在紫外燈下檢測(cè)并攝像，通過觀察電泳圖，進(jìn)行Hp基因型分型。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:基因計(jì)數(shù)法計(jì)算出等位基因頻率。采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，應(yīng)用卡方分析處理分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

HBV-HCC患者組Hp1-1基因型頻率為18.37%，Hp2-1為38.78%，Hp2-2為42.86%；健康人組Hp1-1基因型頻率為7.69%，Hp2-1為34.62%，Hp2-2為57.69%。兩組間Hp1-1基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HBV-HCC組Hp1基因頻率為37.76%，Hp2基因頻率為62.24%；健康人組為25.00%，Hp2基因頻率為75.00%。等位基因Hp1的基因頻率升高明顯，且兩組間有顯著性差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1104例健康人與HBV感染相關(guān)肝癌Hp基因頻率比較[例(%)]

基因型例數(shù)(頻率)健康人HBV-HCCχ2值P值Hp1-18(7.69)18(18.37)6.9050.032Hp2-136(34.62)38(38.78)Hp2-260(57.69)42(42.86)總Hp152(25.00)74(37.76)7.6500.006總Hp2156(75.00)122(62.24)

3 討論

HBV的持續(xù)感染與肝癌密切相關(guān)。HBV是一種雙鏈DNA病毒，其能將DNA整合入宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，從而誘發(fā)原發(fā)性肝細(xì)胞癌[4]。另外HBV會(huì)激發(fā)人體產(chǎn)生過度的細(xì)胞免疫反應(yīng)，導(dǎo)致大規(guī)模的肝細(xì)胞損傷和嚴(yán)重肝炎。而此時(shí)患者的細(xì)胞免疫功能較弱，無法迅速有效得清除病毒，可能導(dǎo)致慢性感染，進(jìn)而增加轉(zhuǎn)變成肝癌的風(fēng)險(xiǎn)[5]。

Hp由一條含有439個(gè)氨基酸殘基的單一多肽鏈組成。與免疫球蛋白的四肽鏈結(jié)構(gòu)相似的是，Hp也含有兩條輕鏈(α鏈)和兩條重鏈(β鏈)，輕鏈又分為α1和α2兩種，是使Hp具有基因多態(tài)性的主要原因。Hp有Hpl和Hp2兩種等位基因，位于常染色體16q22上。人類Hp的3種基因型的分布存在種族和地區(qū)的差異性。在我國(guó)漢族人中，Hp2-2型最多，占55%左右；其次為Hp2-1型，約占35%；Hp1-1型最少，約10%左右。臨床上針對(duì)Hp基因構(gòu)造、表達(dá)、基因多態(tài)性研究尚不完善，僅討論了等位基因Hp2在HBV-HCC中表達(dá)明顯增高[6]。鑒于等位基因Hp2與HBV感染的相關(guān)性，考慮Hp基因多態(tài)性可能與HBV-HCC存在一定的關(guān)聯(lián)，故將兩者進(jìn)行研究對(duì)比。而本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HBV-HCC患者組Hp1-1基因型頻率為18.37%；健康人組Hp1-1基因型頻率為7.69%。兩組間Hp1-1基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HBV-HCC組Hp1基因頻率為37.76%，Hp2基因頻率為62.24%；健康人組為25.00%，Hp2基因頻率為75.00%。等位基因Hp1的基因頻率升高明顯，且兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這意味著與健康人相比Hp1基因在HBV-HCC患者中更為聚集，而不是等位基因Hp2?？紤]可能有以下三種原因：(1)Hp1基因攜帶者對(duì)HBV-HCC有著更強(qiáng)的易感性；(2)在肝臟疾病中，癌前病變時(shí)Hp1基因就已經(jīng)發(fā)生了集聚現(xiàn)象，這需要進(jìn)一步研究來證實(shí)。(3)本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)大多來源于吉林省患者，有一定的局限性，需要更多的數(shù)據(jù)來證明這一結(jié)論。

綜上所述，等位基因Hp1與HBV-HCC有一定的關(guān)系，其存在可能更容易促使慢性乙型肝炎患者發(fā)展至肝癌階段，需要更進(jìn)一步的研究來完善這其中的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。