董保龍，韓彩文，史 明，鄭文學(xué)，楊曉軍*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 臨床學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省人民醫(yī)院 普外二科，甘肅 蘭州 730000)

2018年全球惡性腫瘤統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)示，肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)病率和病死率分別位居惡性腫瘤中的第6位和第3位[1]。在中國(guó)，其新發(fā)病率及病死率分別位居所有惡性腫瘤第4位及第3位[2]。HCC起病隱匿，病情進(jìn)展快，預(yù)后差，高侵襲性和轉(zhuǎn)移率是難以有效治療的主要原因。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)和表型改變的過(guò)程、腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)，與預(yù)后不良密切相關(guān)[3]。同時(shí)，EMT異常激活是HCC化療耐藥、免疫逃逸、侵襲轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)的重要機(jī)制[4]。EMT過(guò)程中上皮特征性細(xì)胞分子細(xì)胞黏附因子(E-cadherin，E-ca)表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)特異性VIM上調(diào)，且波形蛋白(vimentin，VIM)是EMT的標(biāo)志物和HCC侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子[5]。HCC血清中VIM水平明顯升高，聯(lián)合AFP診斷HCC時(shí)特異性和敏感性顯著提高[6]。

近年來(lái)，隨著對(duì)EMT研究熱潮的發(fā)現(xiàn)，其與腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs)、DNA甲基化和外泌體存在密切的關(guān)聯(lián)，促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展。而VIM作為EMT的標(biāo)志性分子參與或調(diào)控上述重要機(jī)制，且在HCC的早期診斷和治療發(fā)揮著重要作用。故深入研究VIM有望成為HCC潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

1 VIM生物結(jié)構(gòu)及其表達(dá)在HCC中的臨床意義

1.1 VIM生物結(jié)構(gòu)

VIM是高度保守一種Ⅲ型中間絲纖維蛋白，屬于中間絲蛋白家族中的一員，其變化使得細(xì)胞骨架發(fā)生重排、細(xì)胞外基質(zhì)重塑，從而獲得間質(zhì)細(xì)胞特征，細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)[5]。VIM有N端結(jié)構(gòu)域、中心桿狀結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域3部分組成，磷酸化和糖基化位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域主要位于N端和C端，主要調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)。中心桿狀結(jié)構(gòu)域具有α螺旋區(qū)域可抑制蛋白酶體降解，對(duì)VIM起保護(hù)作用[7]。

1.2 HCC中VIM的表達(dá)及臨床意義

VIM在表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞，其表達(dá)使得細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力。HCC組織中VIM表達(dá)顯著高于其癌旁組織，距癌組織越近VIM表達(dá)越高[8],且在肝炎病毒感染的HCC組織中VIM顯著增加[9]。HCC患者血清VIM水平顯著高于正常人水平，晚期HCC患者VIM水平顯著高于早期HCC患者[10]。此外，VIM陽(yáng)性表達(dá)者生存率明顯低于陰性表達(dá)者，與預(yù)后密切相關(guān)[10]。同時(shí)，血清中VIM水平升高在檢測(cè)小肝癌時(shí)，靈敏度為40.91%，特異性為87.50%，優(yōu)于血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)，且VIM與AFP (≥100 ng/mL)聯(lián)合檢測(cè)小肝癌時(shí)，靈敏度竟上升到58.77%，特異性為98.15%[6]。綜上所述，VIM表達(dá)在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

2 VIM參與調(diào)控EMT

表型的變化是復(fù)雜基因變化的結(jié)果，VIM在基因表達(dá)[11]、蛋白間相互作用[7]、磷酸化[12]3個(gè)層面上調(diào)控EMT，進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展，促進(jìn)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

2.1 VIM直接或間接誘導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控EMT

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)參與細(xì)胞多種生命活動(dòng)，在基因修飾過(guò)程中作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、轉(zhuǎn)錄后加工因子、染色質(zhì)重塑因子和剪接調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)或抑制惡性腫瘤進(jìn)展，在腫瘤的診斷和治療中發(fā)揮作用。lncRNA通過(guò)多種途徑調(diào)控EMT的發(fā)生[13]，介導(dǎo)腫瘤耐藥、侵襲和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[14]。 LncRNA GAS5在HCC細(xì)胞系及HCC組織中呈低表達(dá)，促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移，與HCC預(yù)后密切相關(guān)[11]。在HCC細(xì)胞系中使GAS5過(guò)表達(dá)[15]，結(jié)果顯示VIM表達(dá)降低，E-ca表達(dá)增加，顯著抑制細(xì)胞間質(zhì)表型和細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示GAS5負(fù)性調(diào)控VIM表達(dá)。且后續(xù)在過(guò)表達(dá)GAS5細(xì)胞系中沉默VIM后，細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力下降，且GAS5表達(dá)上調(diào)。因此推測(cè)，VIM可能是直接或者調(diào)控GAS5的表達(dá)，促進(jìn)或者抑制EMT從而介導(dǎo)HCC侵襲轉(zhuǎn)移。

2.2 VIM與其他蛋白相互作用抑制其降解調(diào)控EMT

骨橋蛋白(osteopontin, OPN)是一種多功能蛋白，參與機(jī)體多種病理生理過(guò)程。隨著對(duì)OPN深入研究，OPN是HCC發(fā)生的啟動(dòng)因子，其表達(dá)水平和侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[16]。為了探索OPN侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，篩選出4株穩(wěn)定低表達(dá)OPN的人源型HCC細(xì)胞，利用過(guò)表達(dá)和敲除模型，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)OPN細(xì)胞系具有典型間質(zhì)細(xì)胞表型，侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)，VIM和EMT轉(zhuǎn)錄因子Twist1表達(dá)增高、E-ca表達(dá)下降，發(fā)生典型的EMT效應(yīng)[7]。低表達(dá)的細(xì)胞系卻沒(méi)有明顯變化，從而確定OPN過(guò)表達(dá)能夠引起EMT效應(yīng)。用免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)篩選出相關(guān)蛋白-VIM，發(fā)現(xiàn)VIM α螺旋區(qū)域有OPN的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合后抑制了泛素-蛋白酶體降解途徑，抑制 VIM降解從而VIM穩(wěn)定性增加。此外，沉默VIM后細(xì)胞表型發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，且調(diào)控EMT的關(guān)鍵基因Axl表達(dá)也隨之下調(diào)，OPN引起的EMT征象被逆轉(zhuǎn)。

綜上，VIM與其他蛋白相互作用，抑制其降解，提高其穩(wěn)定性，發(fā)揮EMT效應(yīng)促進(jìn)HCC的進(jìn)展。

2.3 VIM磷酸化調(diào)控EMT

PI3K/AKT信號(hào)通路已在多種腫瘤發(fā)現(xiàn)，參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、增殖凋亡、EMT等多種細(xì)胞活動(dòng)[17]。AKT1、AKT2、AKT3是AKT的3個(gè)亞型，AKT1在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移已被廣泛研究，AKT1尾端與VIM頭端相互作用，VIM可被AKT1磷酸化，磷酸化可以保護(hù)其免受caspase誘導(dǎo)的蛋白水解作用，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，作為EMT效應(yīng)分子，促進(jìn)EMT[12]。

3 VIM甲基化、VIM參與腫瘤干細(xì)胞和外泌體介導(dǎo)的HCC侵襲和轉(zhuǎn)移

3.1 HCC中VIM甲基化

DNA甲基化是最為常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)方式之一，是非DNA序列改變所致的基因表達(dá)水平的變化，調(diào)控許多腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)[18]。目前認(rèn)為DNA甲基化可以作為腫瘤早期診斷的生物標(biāo)志物和預(yù)后評(píng)估指標(biāo)，對(duì)腫瘤的篩查和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、早期診斷、分期分型、預(yù)后判斷及治療檢測(cè)都有重要的意義[19-20]。采用定量甲基化特異性PCR檢測(cè)43例HCC組織和相應(yīng)的癌旁組織VIM基因甲基化狀態(tài)[20]，結(jié)果顯示43例中24例出現(xiàn)VIM基因的異常甲基化，且與TNM分期、血清中AFP水平和腫瘤大小密切相關(guān)。近來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的不斷提高，利用半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)42個(gè)法國(guó)HCC患者和42個(gè)健康人，以及來(lái)自泰國(guó)的42個(gè)HCC患者、26個(gè)慢性肝病患者和42個(gè)健康人進(jìn)測(cè)序評(píng)估VIM基因甲基化，結(jié)果表明,VIM基因甲基化水平在HCC患者中顯著增高，且VIM基因甲基化水平與HCC分期呈正相關(guān)[19]。

綜上，VIM基因甲基在HCC形成之前早已發(fā)生, 并且甲基化的不同水平出現(xiàn)HCC發(fā)展的各個(gè)相應(yīng)階段。VIM基因甲基化有望成為HCC生物標(biāo)志物。

3.2 HCC中VIM形成間質(zhì)表型腫瘤干細(xì)胞

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs)是一類具有自我更新、高致瘤性、多向分化潛能、高度耐藥等特性的細(xì)胞，是惡性腫瘤耐藥以及術(shù)后復(fù)發(fā)的根本原因。CSCs標(biāo)志物有CD133、醛脫氫酶(ALDH)、CD44、CD24、EGFR、HER2和EMT標(biāo)志性蛋白(VIM；E-ca)以及EMT轉(zhuǎn)錄因子(Snail、Slug、twist、Zeb1、Zeb2等)[21]。隨著CSCs標(biāo)志物分離技術(shù)的的提高，HCC中分離出了一類CD133-VIM+和CD133-VIM-的CSCs，由于VIM的表達(dá)，從而獲得EMT表型，且證實(shí)了CD133-VIM+是一類具有EMT表型的CSCs[22]。在兩種細(xì)胞中分別進(jìn)行了細(xì)胞周期分析、分化潛能和體內(nèi)外致瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有EMT表型的CSCs(CD133-VIM+)G1-S-G2期細(xì)胞數(shù)量明顯高于CD133-VIM-的CSCs；CD133-VIM+有著更高的分化潛能和致瘤能力。

因此，在HCC中VIM形成間質(zhì)表型腫瘤干細(xì)胞，獲得EMT表型，使HCC或者侵襲轉(zhuǎn)移能力增加。

3.3 外泌體直接或者間接分泌VIM

外泌體是大小為40～100 nm由多種細(xì)胞分泌的微小膜泡，攜有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、miRNA和循環(huán)DNA等多種活性物質(zhì)，是細(xì)胞間信息交流的功能載體，參與多種病理生理功能，不同細(xì)胞分泌的外泌體具有不同的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物。EMT由多種致癌因子或其他因素引起，外泌體亦是EMT的參與者。外泌體中的多種蛋白、miRNA參與了腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程，影響腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。此外，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體作為信息載體調(diào)控EMT，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[23]。結(jié)腸癌中纖維細(xì)胞分泌的外泌體攜帶的miR-92a-3p激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路從而激活EMT，VIM作為EMT的效應(yīng)分子高表達(dá)，促進(jìn)結(jié)腸侵襲轉(zhuǎn)移[24]。HCC分泌的外泌體中還有Rab27a，激活MAPK/ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)EMT發(fā)生，促進(jìn)HCC進(jìn)展[25]。HCC細(xì)胞分泌腫瘤外泌體，向周圍組織或血液等擴(kuò)散，誘導(dǎo)VIM表達(dá)使腫瘤細(xì)胞獲得EMT表型，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲準(zhǔn)備物質(zhì)基礎(chǔ)[8]。

4 問(wèn)題與展望

目前，HCC的早期診斷受限于發(fā)現(xiàn)時(shí)間太晚以及診斷過(guò)程的煩瑣、費(fèi)用昂貴等因素。因此，在人體體液內(nèi)尋找和檢測(cè)腫瘤細(xì)胞分泌的靶基因可能會(huì)是一種新穎的、無(wú)創(chuàng)的、高度可靠的診斷方式。而基因甲基化、循環(huán)腫瘤干細(xì)胞以及外泌體已成為“液體活檢”研究熱點(diǎn)。VIM作為EMT的標(biāo)志性分子，參與或調(diào)控上述研究熱點(diǎn)使其獲得EMT表型，促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展。故隨著基因檢測(cè)及分離技術(shù)突破，VIM有望成為液體活檢的熱點(diǎn)，為HCC患者提供潛在的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。