李 明，劉建恒，崔 翔，張里程，唐佩福

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 骨科，北京 100853

嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、腫瘤及骨骼肌肉系統(tǒng)先天性畸形所導(dǎo)致的骨缺損日趨增多，骨缺損后修復(fù)重建成為骨科醫(yī)生面臨的巨大挑戰(zhàn)。當(dāng)前治療的主要方法為骨移植，據(jù)統(tǒng)計美國每年因創(chuàng)傷及骨不連術(shù)后進(jìn)行骨移植治療的患者高達(dá)100 萬例[1]，我國每年因先天性疾病、交通傷及運動損傷等導(dǎo)致的骨缺損高達(dá)400 萬例[2]。作為治療金標(biāo)準(zhǔn)的自體骨移植，因其來源有限及供區(qū)并發(fā)癥因素，難以滿足當(dāng)前臨床的巨大需求[3]。應(yīng)用骨組織工程支架作為骨移植材料，為骨缺損的修復(fù)提供了新的方法。理想的骨移植物材料應(yīng)具備良好的生物相容性、骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性、可吸收性或可降解性，并具有一定的力學(xué)性能為骨缺損部位提供臨時支撐[4]。隨著合成方法的進(jìn)步和修飾手段的多樣化，高分子聚合物不但具備高度三維多孔的微觀結(jié)構(gòu)，而且修飾后可顯著增加生物相容性，為新生骨組織的生長和血管化提供了有力保障[5-7]。等離子體表面改性技術(shù)不僅通過蝕刻、化學(xué)反應(yīng)和離子輻射等方法改變了高分子聚合物表面的組成和微觀結(jié)構(gòu)，還可以通過涂層、嫁接和蛋白質(zhì)固定等手段制造仿生表面結(jié)構(gòu)，且不會影響高分子聚合物的內(nèi)在性質(zhì)[8]。因此，本文就等離子體表面改性技術(shù)及其改性效果，促進(jìn)高分子聚合物在骨組織工程中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，為骨移植材料促進(jìn)骨缺損修復(fù)重建提供借鑒。

1 等離子體簡介

等離子體(plasma)由Langmuir 于1928 年首次提出，用來描述多組分相互作用的氣體在放電管里的物質(zhì)形態(tài)[9]。等離子體是借電場或磁場的高動能將外層的電子擊出，將原子轉(zhuǎn)化為帶電荷的離子，成為高位能、高動能的一種電離氣體團[10]。等離子體常被稱作為物質(zhì)的第四種形態(tài)，主要由電子、帶正電或負(fù)電的離子、自由基、電磁輻射、分子及分子碎片等組成。因此，等離子體是集能量和反應(yīng)物質(zhì)共存的混合物，其重要的特征是處于帶電平衡狀態(tài)，即等離子體的總帶電量為中性[11-12]。因此，為了獲得氣體的等離子體狀態(tài)，必須要在電離過程中傳輸能量，以獲得足夠的動能激發(fā)電離。產(chǎn)生等離子體需具備三個要素，即電離的能量、維持等離子體狀態(tài)的真空系統(tǒng)和離子體反應(yīng)室[13]。氣體源性的等離子體產(chǎn)生是將氣體置于真空的等離子體反應(yīng)器中，通過施以低電流、高壓放電的方式激發(fā)電離原子和分子級聯(lián)，進(jìn)而產(chǎn)生非熱性的等離子體，如射頻輝光放電、電暈放電和大氣電弧等[14]。因其技術(shù)成熟，效果顯著且操作簡便，在生物、物理和化學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，成為近年來醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的研究熱點。

2 應(yīng)用等離子體技術(shù)進(jìn)行表面改性修飾

高分子聚合物表面的親水性差，缺乏自然識別位點，限制了其在骨組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用。表面修飾技術(shù)可有效改變材料的表面性質(zhì)如粗糙度、形貌、電荷、化學(xué)成分、表面能和濕潤性，進(jìn)而有效地促進(jìn)高分子聚合物與組織的相互作用[15-17]。等離子體中的活性物質(zhì)如自由基、離子、受激發(fā)的原子、分子和電磁輻射等，在不對材料本身進(jìn)行損害的基礎(chǔ)上滅活微生物和病毒，并可以在不使用化學(xué)溶劑或產(chǎn)生有毒廢物的情況下活化材料表面進(jìn)而增加其生物相容性。此外改性的材料表面在受到更高的能量時會發(fā)生鏈斷裂反應(yīng)，通過共價鍵形成新的化學(xué)構(gòu)型和化學(xué)功能，進(jìn)一步促進(jìn)材料與宿主之間相互作用，增強細(xì)胞的黏附增殖，提高材料的生物活性[18]。

根據(jù)等離子體表面反應(yīng)類型，主要分為以下四類：1)濺射蝕刻效應(yīng)；2)功能化活性位點的引入；3)自由基的嫁接和聚合反應(yīng)；4)沉積涂層[19-20]。濺射蝕刻效應(yīng)通過原子、分子和受激發(fā)物質(zhì)的物理轟擊于材料表面進(jìn)行蝕刻，侵蝕程度主要取決于等離子源的輸入功率、反應(yīng)時間和施加電壓等。材料表面形態(tài)通常是納米級的改變，表面形態(tài)的改變會增加材料的表面積，從而影響生物界面反應(yīng)，增強生物相容性[21]。引入功能化活性位點分為兩種形式，一種是以惰性氣體通過自由基形式引入活性位點，另一種是以強氧化氣體和高反應(yīng)性氣體通過官能基團形式引入化學(xué)功能位點。功能化活性位點既可以改變材料表面親水性能，又可以基于此進(jìn)一步修飾改性[22]。自由基和官能基團接觸液相或氣相單體時引發(fā)聚合反應(yīng)，新形成的嫁接表面為化學(xué)共價修飾提供了反應(yīng)位點，如化學(xué)交聯(lián)、大分子與生物分子靜電相互作用等[23]。沉積涂層通常采用化學(xué)氣相沉積法在材料表面形成一層納米級厚度的涂層，其性質(zhì)、厚度、強度、光滑度和親水性均會改善聚合物材料的生物相容性[24]。

3 高分子聚合物的表面性能在生物反應(yīng)中的重要性

生物材料暴露于生物體內(nèi)時，材料表面與體液或血液接觸后吸附蛋白質(zhì)與細(xì)胞受體相結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞的黏附、增殖和分化。因此材料表面的組成、結(jié)構(gòu)及吸附蛋白的成分決定了與之接觸細(xì)胞的生物學(xué)行為[25]。通常細(xì)胞與材料的相互作用分為非特異性和特異性兩類[26]。非特異性相互作用是通過對材料表面化學(xué)成分、表面能量、粗糙度和形態(tài)進(jìn)行修飾，增加非特異性蛋白的吸附并保持吸附蛋白的生物活性，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞行為。但非特異性作用在促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的同時可能損害細(xì)胞活性導(dǎo)致細(xì)胞死亡。以炎癥反應(yīng)為例，當(dāng)生物材料被植入體內(nèi)幾秒后便會在表面吸附一層蛋白，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等黏附并發(fā)出細(xì)胞因子召集成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白，最終在生物材料周圍形成一層纖維組織[27]。特異性相互作用通過在材料表面直接固定特異性配體蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生特異性的反應(yīng)。骨組織工程中常在材料表面負(fù)載骨形態(tài)發(fā)生蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化促進(jìn)骨形成[28]。

4 等離子體修飾提高高分子聚合物的生物相容性

等離子體修飾提高聚合物生物相容性主要有兩種方式：一是通過等離子體修飾技術(shù)提高材料表面親水性、引入活性基團、增加材料表面粗糙度、改變表面電荷；二是在等離子體修飾基礎(chǔ)上固定生物反應(yīng)活性分子，增強生物識別能力。材料界面自由能決定了親/疏水性能，低表面能的材料上細(xì)胞的黏附性較差且數(shù)量相對較少。Rattier等[29]發(fā)現(xiàn)生物材料表面能為20 ～ 30 mJ/m2時無黏附性能，在40 ～ 70 mJ/m2時具有良好的黏附特征。等離子體通過在聚合物表面引入羧基(-COOH)、過氧化物(-O-O-)、羥基(-OH)、氨基(-NH3)基團和極性物質(zhì)，引起極性基團重新排列和非極性基團表面遷移，增加材料表面能，促進(jìn)體液血液的接觸反應(yīng)和細(xì)胞的黏附固定。高分子聚合物材料經(jīng)等離子體蝕刻后形成微米至納米級的溝槽樣粗糙表面，細(xì)胞接觸后沿粗糙面擴散、排列和遷移。該現(xiàn)象被稱為“接觸引導(dǎo)作用”，即細(xì)胞整合素受體根據(jù)所接觸的不同表面形態(tài)，將張力或壓力的變化轉(zhuǎn)移至細(xì)胞骨架，細(xì)胞牽張感受器承受力量變化后激活重組細(xì)胞骨架，從而引起系列生物學(xué)效應(yīng)，同時由于材料表面區(qū)域結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致表面自由能的變化，協(xié)同影響了細(xì)胞的黏附遷移[30]。不同的粗糙表面對細(xì)胞的影響也取決于細(xì)胞類型、材料組成及兩者間的相互作用。研究證實表面溝壑(深度0.5 ～ 1μm，寬度1 ～ 10μm)可有效增強大鼠骨髓細(xì)胞堿性磷酸酶活性并加速細(xì)胞外基質(zhì)礦化[31]。此外，等離子體處理后材料表面可產(chǎn)生廣泛分布的陰陽離子、官能團、自由基等。陽離子通過靜電相互作用促進(jìn)蛋白的黏附，陰離子與鈣離子結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)礦化[32]。為了進(jìn)一步增加反應(yīng)的特異性，材料表面引入羥基、羧基、氨基等反應(yīng)基團作為偶聯(lián)位點，通過化學(xué)接枝和涂層技術(shù)共價連接蛋白，如黏附蛋白可通過配體受體相互作用促進(jìn)細(xì)胞黏附，生長因子調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化。引入親水性高分子和生物大分子進(jìn)行非共價改性，并基于帶相反電荷的聚陰離子和聚陽離子交替沉積形成靜電自組裝涂層，通過聚電解質(zhì)多層膜控制細(xì)胞黏附。此外，羥基磷灰石作為骨基質(zhì)的主要礦物成分，在骨修復(fù)過程中對骨組織再生具有重要作用，將高分子聚合物經(jīng)等離子體表面改性后浸潤至模擬體液，引發(fā)磷酸鈣沉積，形成的仿生磷灰石涂層被證實可提供良好的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性[33]。

5 等離子體修飾的高分子聚合物在骨組織工程研究中的應(yīng)用

高分子聚合物如聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物和聚己內(nèi)酯等，在體內(nèi)分解成乳酸和乙醇酸后排出體外。因其獨特的結(jié)構(gòu)、可控性、可降解性和可重復(fù)生產(chǎn)等優(yōu)勢，在骨組織工程領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，并獲得FDA 的批準(zhǔn)[34-35]。Wang 等[36]3D 打印了聚乳酸支架并進(jìn)行空氣等離子體修飾，發(fā)現(xiàn)支架表面粗糙、親水性增加，并證實其有效促進(jìn)成骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的附著和增殖。Castillo-Dali 等[37]制備了氧氣等離子體修飾復(fù)合二氧化鈦納米顆粒的聚乳酸-羥基乙酸功能化膜，將其用于兔顱骨缺損中，證實該功能化膜有效促進(jìn)了新骨形成和骨基質(zhì)礦化。Kook 等[38]證實隨著氧氣等離子體刻蝕時間的增加，聚己內(nèi)酯支架表面的粗糙度和親水性也隨之增加，進(jìn)而有效提高了成骨前細(xì)胞分化并促進(jìn)兔顱骨缺損處新骨形成。Domingos 等[39]3D 打印了聚己內(nèi)酯多孔支架并采用混合乙烯/氮氣進(jìn)行等離子處理，將形成含氮基涂層的支架與Saos-2 成骨細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞均勻定植于多孔材料且具有顯著的黏附和增殖能力。Declercq 等[40]將聚己內(nèi)酯支架經(jīng)氧氣等離子修飾后嫁接明膠和纖連蛋白，有效促進(jìn)人脂肪組織來源干細(xì)胞的增殖和成骨分化。Roh 等[41]構(gòu)建了負(fù)載氧化鎂納米顆粒的聚己內(nèi)酯和羥基磷灰石復(fù)合材料，并用氧氣和氮氣等離子體處理后與成骨前體細(xì)胞共培養(yǎng)，證實等離子體處理結(jié)合氧化鎂及羥基磷灰石后增強了支架中細(xì)胞的黏附、增殖和分化。但是當(dāng)前研究多為體外驗證，針對其體內(nèi)修復(fù)效果，特別是大段骨缺損的重建還有待研究。隨著技術(shù)的進(jìn)一步改進(jìn)，基于等離子體修飾的復(fù)合仿生高分子聚合物將成為治療骨缺損簡單有效的手段。