陳立偉，翟性友，黃邦清，劉宸箐，張永俠，趙建東，劉明波

1解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，海南三亞 572013；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100853

喉癌是最常見的呼吸道腫瘤之一，過去幾十年中，喉癌的治療取得了較大的進展，雖然手術(shù)治療依然是喉癌治療的主要手段，但放療及全身綜合治療也漸成為喉癌治療的方式之一[1]。因此，尋找調(diào)節(jié)喉癌侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，成為喉癌基礎(chǔ)研究的重點之一。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移離不開侵襲前緣細胞外基質(zhì)廣泛的蛋白水解作用?；啄さ钠茐暮图毎饣|(zhì)的降解被認為是腫瘤得以發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，這個過程離不開許多蛋白水解酶的分泌和表達，這些蛋白降解酶使基底膜產(chǎn)生局部缺損，為腫瘤細胞的移動形成通道[2]。根據(jù)酶催化的底物和pH 不同，蛋白降解酶可分為絲氨酸蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶四大類。各種蛋白降解酶具有與腫瘤相關(guān)的多種生物學(xué)功能，在腫瘤的啟動、侵襲、血管生成及轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮一定作用。組織蛋白酶(Cathepsin)是存在于溶酶體的細胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶，在蛋白的降解和加工中發(fā)揮重要作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。正常情況，組織蛋白酶與其內(nèi)源性抑制劑含量保持平衡，在腫瘤中，組織蛋白酶與其抑制劑平衡被破壞，導(dǎo)致組織蛋白酶表達量或活性增高，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-7]。我們前期研究中發(fā)現(xiàn)無論在喉癌組織還是患者血清中，組織蛋白酶Cathepsin B 含量均顯著高于正常對照組，提示Cathepsin B 在喉癌發(fā)生、發(fā)展中可能起到關(guān)鍵作用[8-9]。本研究通過體外試驗，應(yīng)用Cathepsin B 特異性抑制劑CA-074Me 處理喉癌Hep-2 喉癌細胞后，分析喉癌細胞活性的變化，從而推測Cathepsin B 在喉癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

材料和方法

1 細胞培養(yǎng)及處理 喉癌Hep-2 細胞購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，在含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM 培養(yǎng)基中于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待60 mm 培養(yǎng)皿中Hep-2 細胞融合度達70%時，應(yīng)用環(huán)氧酶琥珀酰肽甲基酯CA-074Me 按10μmol/L 的濃度處理細胞12 h、24 h(實驗組)。對照組為正常培養(yǎng)Hep-2 細胞，不加CA-074Me 處理。

2 Western blot 蛋白檢測實驗 CA-074Me 處理細胞12 h、24 h 后，分別收集實驗組和對照組腫瘤細胞，提取細胞總蛋白，考馬斯亮藍法定量后按每孔80 mg 上樣電泳，12%分離膠，120 V 電泳2.5 h后，在100 V、1.5 h 條件下將蛋白轉(zhuǎn)移到NC 膜上，膜用10%脫脂奶粉TBST 溶液4℃封閉過夜，Cathepsin B 兔多克隆抗體(Abcam Hong Kong Ltd，1 ∶1 ∶250 稀釋)37℃孵育1 h，TBST 洗3 遍后用HRP 標記的二抗1 ∶4 000 稀釋與膜孵育40 min，再洗3 遍后，用超敏發(fā)光液(ECL)發(fā)光檢測蛋白表達水平的變化。

3 Transwell 細胞侵襲和遷移實驗 細胞侵襲實驗：用Matrigel(Becton Dickinson and Company，1 mg/ml)膠包被Transwell 小室(Corning Incorporation 孔徑8mm)，放于24 孔板中，將溶解于100 ml DMEM培養(yǎng)基中約1×105個細胞培養(yǎng)于小室上層，小室下層加入1 ml 含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 后，取出Transwell 小室，用蘸有PBS 的棉簽擦去小室上層的細胞，取下Transwell膜，75%甲醇固定細胞30 min 后，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，清水洗凈，放在載破片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡下隨機選取5 個視野照相、計數(shù)穿過濾膜細胞。細胞遷移實驗步驟同侵襲實驗，區(qū)別是Transwell小室不鋪Matrigel膠，接種細胞數(shù)減半，培養(yǎng)12 h 后染色計數(shù)。實驗組及對照組均每組接種5 孔。

4 MTT 細胞增殖實驗 實驗組在接種前應(yīng)用10μmol/L 的CA074Me 處理Hep-2 細胞24 h。收集細胞，然后按103/孔密度接種細胞于96 孔板中，在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別于第1、2、3、4、5、6、7 天加入20 μl MTT(5 mg/ml Sigma-Aldrich Corp)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，加入150 ml DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，490 nm 酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔光吸收值。以時間為橫軸，光吸收值為縱軸，繪制細胞增殖曲線。對照組為正常培養(yǎng)Hep-2 細胞。

5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Stata 軟件進行統(tǒng)計分析。觀測數(shù)據(jù)均為計量資料，以±s 表示，兩組間比較用t 檢驗，三組間比較用單因素方差分析+多重比較LSD-t 檢驗，依時間變化數(shù)據(jù)組間比較采用重復(fù)測量方差分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CA-074Me 抑 制Hep-2 細 胞Cathepsin B 蛋 白表達 應(yīng)用CA-074Me 按10 mmol/L 的濃度處理Hep-2 細胞12 h 后，Western blot 試驗檢測Hep-2細胞Cathepsin B 蛋白表達水平出現(xiàn)明顯降低，處理24 h 后，Cathepsin B 蛋白表達的降低更加顯著，達到抑制其表達、進行功能研究的目的。見圖1。

2 CA-074Me 抑制Hep-2 細胞侵襲、遷移能力 CA-074Me 處理24 h Hep-2 細胞后，Cathepsin B 蛋白表達被抑制，此時，Transwell 試驗顯示，Hep-2細胞降解Matrigel 膠穿過Transwell 小室的侵襲能力顯著低于對照組：34.8±4.6/field vs 83.6±4.5/field (P ＜0.01)。Hep-2 細胞穿過Transwell 小室的遷移能力也顯著降低：33.4±3.8/field vs 82.0±4.2/field (P ＜0.01)。見圖2。

3 CA-074Me 抑制Hep-2 細胞增殖能力 將Hep-2 細胞和CA-074Me 處理24 h 后的Hep-2 細胞連續(xù)培養(yǎng)7 d，經(jīng)重復(fù)測量方差分析發(fā)現(xiàn)CA-074Me 處理后的Hep-2 細胞增殖能力從第3 天開始顯著低于對照組，說明抑制了Cathepsin B 蛋白表達后，喉癌細胞的增殖能力被顯著抑制。見圖3。

圖 1 Western blot檢測Hep-2細胞中Cathepsin B水平。 Hep-2:正常培養(yǎng)Hep-2細胞; Hep-2-CA-074Me(12 h): CA-074Me處理Hep-2細胞12 h；Hep-2-CA-074Me(24 h): CA-074Me處理Hep-2細胞24 h； aP ＜0.01Fig. 1 Western blot was used to detect the level of cathepsinB in Hep-2 cells. Hep-2: Hep-2 cells were cultured normally; Hep-2-CA-074Me (12 h): CA-074Me Hep-2 cells were treated with CA-074Me for 12 hours; CA-074Me (24 h): Hep-2 cells were treated with Hep-2-CA-074Me for 24 hours. aP ＜0.01

討 論

圖 3 MTT試驗Hep-2細胞增殖能力檢測(Hep-2:正常培養(yǎng)Hep-2細胞; Hep-2-CA-074Me：CA-074Me處理Hep-2細胞； aP ＜0.01)Fig. 3 MTT assay was used to detect the proliferation of Hep-2 cells (Hep-2: Hep-2 cells cultured normally; Hep-2-CA-074Me: Hep-2 cells were treated with CA-074Me； aP ＜0.01)

頭頸鱗癌是全球范圍內(nèi)第六大常見腫瘤[10]。早期發(fā)現(xiàn)治療效果較好，晚期患者治療效果欠佳。據(jù)報道，T1、T2 期的喉癌治愈率達80% ～ 90%，而臨床Ⅳ期喉癌患者，5 年生存率僅約40%，2/3患者確診時已為晚期[11-12]。95%的原發(fā)性喉癌為鱗狀細胞癌。近年來無論國內(nèi)外報道，喉癌的治療效果均沒有明顯提高，因此尋找調(diào)控喉癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子，有利于探索喉癌的分子靶向治療。

組織蛋白酶Cathepsin B 是存在于溶酶體內(nèi)的一種蛋白酶，在溶酶體的酸性環(huán)境下進行自催化活化，形成活性組織蛋白酶。在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，Cathepsin B 與細胞增殖、血管生成、炎癥、侵襲、轉(zhuǎn)移及細胞凋亡相關(guān)[13]。文獻報道其高表達與乳腺癌、黑色素瘤、結(jié)直腸癌等多種腫瘤密切相關(guān)[5,14-17]。Cathepsin B 在腫瘤組織中活性增加，既是由于Cathepsin B 內(nèi)在表達的增加，又與內(nèi)源性低分子量的半胱氨酸蛋白酶抑制劑調(diào)控下降相關(guān)。組織蛋白酶的抑制物大致包括Stefin A(Cystatin A)、Cystatin C 和Kininogens。抑制Cathepsin B 后能降低其對膠原蛋白的降解能力，抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力[18-19]。既然Cathepsin B 在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中起到重要作用，那么對于晚期腫瘤，Cathepsin B 的特異性抑制劑對于腫瘤意義更大。研究發(fā)現(xiàn)，在具有自發(fā)性骨轉(zhuǎn)移乳腺癌的免疫活性模型中，腹膜內(nèi)施用高選擇性Cathepsin B 抑制劑CA-074，而不是廣譜半胱氨酸組織蛋白酶抑制劑JPMOEt，減少了腫瘤的轉(zhuǎn)移[20]。本研究中，我們應(yīng)用Cathepsin B 選擇性抑制劑CA-074Me 體外處理喉癌Hep-2 細胞24 h，Cathepsin B 的表達量顯著下降后，Hep-2 細胞體外侵襲、遷移能力明顯下降。體外增殖試驗顯示，Cathepsin B 低表達后腫瘤細胞體外增殖能力也顯著降低。提示Cathepsin B 的過表達促進喉癌細胞的增殖，并且增強了腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。更加明確了Cathepsin B 基因在喉癌侵襲和轉(zhuǎn)移中起到的重要作用。綜上，Cathepsin B 在喉癌侵襲轉(zhuǎn)移中起到重要作用，通過抑制其表達，有望降低喉癌患者腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。Cathepsin B 或可成為喉癌治療的新靶標。

Fig. 2 Transwell test was used to detect the invasive ability (A, B, C) and the migration ability (D, E, F) of Hep-2 cells (Hep-2: Hep-2 cells were cultured normally; Hep-2-CA-074Me：Hep-2 cells were treted with CA-074Me; aP ＜0.01)