王景雙，劉宏偉，于曉梅，曲義坤（通訊作者）

（1.佳木斯大學(xué)研究生院，黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002）

0 引言

CCA威脅著全世界人民的健康和幸福。CCA是最常見的原發(fā)性肝惡性腫瘤之一。根據(jù)腫瘤的不同位置，可分為肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌。目前CCA的主要治療方法仍然局限于治療性手術(shù)和肝移植。盡管手術(shù)和化療對該疾病的治療取得了很大進(jìn)展，但CCA患者的預(yù)后仍不理想[1]。因此，有必要為CCA尋找更多的治療目標(biāo)。

長于200nt的長鏈非編碼RNA（lncRNAs）作為細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。據(jù)報道lncRNAs在人類癌癥中可以作為腫瘤抑制劑或促進(jìn)劑[2-3]。lncRNAs在癌細(xì)胞中最顯著的功能是調(diào)節(jié)基因表達(dá)。且調(diào)控不良的lncRNA會影響疾病的進(jìn)程。本研究假設(shè)調(diào)控不當(dāng)?shù)腁SPA1-IT1阻礙CCA細(xì)胞的增值和遷移，目前l(fā)ncRNA-ASPA1-IT1在CCA中的作用和機(jī)制尚不清楚。但在CCA組織和細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)ASAP1-IT1失調(diào)。ASAP1-IT1的高表達(dá)可預(yù)測CCA患者的不良預(yù)后。本研究在兩組CCA細(xì)胞中進(jìn)行功能喪失分析，以證明ASAP1-IT1在CCA細(xì)胞中的特殊功能。探討ASAP1-IT1在CCA細(xì)胞中的增值和遷移的作用。根據(jù)實驗結(jié)果，得出結(jié)論：沉默的ASAP1-IT1抑制細(xì)胞遷移和EMT進(jìn)展。

1 實驗材料與方法

1.1 組織樣本。本研究收集了68對人體CCA組織及其鄰近的正常組織，對臨床確診為CCA的患者進(jìn)行了分析。（佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院，普外科。研究前，從每個病人得到倫理同意。本研究已獲得了道德委員會第一事務(wù)所批準(zhǔn)。）

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染。本研究使用的細(xì)胞株購自美國培養(yǎng)并保存。包括一個正常細(xì)胞株（kmbc）和五個CCA細(xì)胞株（huh-28、qbc939、hucct1、cclp1、rbe）。將CCA細(xì) 胞保存在DMEM培養(yǎng)基中，混合10%FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/mL鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)在37℃的潮濕空氣中，5%的二氧化碳。為了降低CCA細(xì)胞中ASAP1-IT1的表達(dá)水平，我們從Santa Cruz Biotechnology Inc.（美國德克薩斯州達(dá)拉斯市）獲得了特定的shRNAs和nc shRNA。所有輸血均使用Lipofectamine?2000進(jìn)行。

1.3 RNA提取及QRT-PCR分析。根據(jù)說明，Trizol試劑（Invitrogen，CA，USA）用Nanodrop 2000（Wilmington，de，USA）測定RNA質(zhì)量。瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA的完整性，然后用高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（應(yīng)用生物系統(tǒng)，福斯特城，CA，美國）反向轉(zhuǎn)錄總RNA（1μg）。所有反應(yīng)均是在Bio-Rad CFX96實時PCR系統(tǒng)上進(jìn)行，采用Taqman分析法（Bio-Rad，美國加利福尼亞州福斯特市）。 GAPDH作為內(nèi)部參考。用2-ΔΔCt方法計算基因的表達(dá)水平，并歸一化到對照組。

1.4 細(xì)胞增殖測定。MTT法有效地測定細(xì)胞的存活率。細(xì)胞（5000/孔），將細(xì)胞接種在96孔平板中24小時。根據(jù)需要將細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，保存在正常培養(yǎng)基中。在不同的時間點（0、24、48、72和96 h）將每個孔加入MTT溶液（5 mg/ml，20μl），培養(yǎng)4 h后從培養(yǎng)基中取出，加入100μl DMSO，測量560 nm下細(xì)胞溶解物的光密度（OD），評估存活細(xì)胞的相對數(shù)量。為了進(jìn)行菌落形成分析，細(xì)胞被放置在6個孔板上。每孔3000個細(xì)胞的密度。然后在DMEM中培養(yǎng)。（含10%FBS）37℃。兩周后，用PBS洗滌細(xì)胞并用甲醇固定0.5小時。用1%結(jié)晶紫染色固定點后，手工計算菌落數(shù)。

1.5 細(xì)胞遷移分析。采用跨井法測定細(xì)胞遷移能力。轉(zhuǎn)染48小時后，從無血清細(xì)胞中取出細(xì)胞（5×104）。介質(zhì)進(jìn)入插入物的上腔（8μm孔徑；微孔），同時向下腔中加入介質(zhì)（含10%FBS）。培養(yǎng)24小時后，細(xì)胞停留在上膜上用棉絨去除。然而，遷移到下膜的細(xì)胞用甲醇和0.1%結(jié)晶紫染色。移植細(xì)胞用IX71倒置顯微鏡（日本東京奧林巴斯）成像計算。

1.6 蛋白質(zhì)印跡分析。轉(zhuǎn)染2天后，用胰蛋白酶（Beyotime，中國北京）消化CCA細(xì)胞。經(jīng)添加蛋白酶抑制劑的Ripa-Lysis bu-ffer（Beyotime，中國北京）裂解，SDS-PAGE垂直電泳分離等量提取蛋白。接下來，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到0.45μm的pvdf膜上（美國新澤西州皮斯卡塔韋，GE Healthcare）。然后，用5%脫脂牛奶堵塞膜，并在室溫下用三步鹽水（含0.05%吐溫-20）稀釋1.5小時。接下來，將膜與主要抗體（E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白、SMO和GLI1）（美國ABCAM）混合培養(yǎng)12小時。經(jīng)洗滌后，用二級抗體進(jìn)行培育，最后用Beyoecl Plus試劑盒（北京貝奧蒂）進(jìn)行印跡成像。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式顯示。依賴性分析。使用prism5（graphpad，美國）軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用學(xué)生t檢驗或單因素方差分析分析組間差異。用Kaplan-Meier法（對數(shù)檢驗）生成生存曲線。通過多變量生存分析，建立Cox比例風(fēng)險模型，以確定與CCA患者總生存率相關(guān)的臨床病理因素。只有當(dāng)P＜0.05時，數(shù)據(jù)才被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 主要結(jié)果

2.1 失調(diào)的ASAP1-IT1是CCA患者的預(yù)后因素。為了解ASAP1-IT1在CCA中的基本作用，進(jìn)行QRT-PCR分析，以檢測不同組織和細(xì)胞株中ASAP1-IT1的表達(dá)水平。首先，在CCA組織及其鄰近正常組織中分別檢測ASAP1-IT1的表達(dá)（圖1a）。可見在CCA組織中ASAP1-IT1的表達(dá)明顯高于正常組織。同樣，在一個正常細(xì)胞株和五個CCA細(xì)胞株中分別檢測ASAP1-IT1的表達(dá)水平進(jìn)行對比（圖1b）。可見在CCA細(xì)胞中ASAP1-IT1的表達(dá)高于正常細(xì)胞。其中在CCLP1和RBE細(xì)胞中表達(dá)水平最高。故選擇這兩個細(xì)胞株進(jìn)行下一步分析。檢測所有癌組織中ASAP1 -IT1表達(dá)水平后，計算平均值。作為閾值，將樣品分為兩組：ASAP1-IT1高表達(dá)組（n=37）和低表達(dá)組（n=31）。分析ASAP1-IT1表達(dá)與CCA患者臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果表明，ASAP1-IT1表達(dá)水平與腫瘤壞死、術(shù)后復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與年齡、性別等因素?zé)o關(guān)（表1）。比例危險性分析證實ASAP1-IT1高水平表達(dá)是CCA患者的預(yù)后因素（P=0.028＊，表2）。Kaplan-Meier方法證實高表達(dá)ASAP1-IT1的CCA患者總生存率低于低表達(dá)組（圖1c）。

圖1 對CCA患者的預(yù)后影響因素是調(diào)節(jié)不良的ASAP1-IT1

表1 CCA患者ASAP1-IT1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n=68)

2.2 ASAP1-IT1基因敲除抑制CCA細(xì)胞增殖.根據(jù)上述結(jié)果，確定ASAP1-IT1在CCA中的預(yù)后價值。但需進(jìn)一步確定在CCA中的生物學(xué)功能。為了解ASAP1-IT1對CCA細(xì)胞增殖的影響，使用特定shRNA干擾CCA細(xì)胞中ASAP1-IT1的表達(dá)（圖2a）。在ASAP1-IT1下調(diào)的CCA細(xì)胞中進(jìn)行MTT和集落形成分析。MTT分析表明，Sh-ASAP1-IT1降低細(xì)胞活力（圖2b）。集落形成分析表明，ASAP1-IT1的敲除降低CCA細(xì)胞的集落數(shù)（圖2c）。證實ASAP1-IT1對CCA細(xì)胞增殖有一定的影響。

2.3 沉默ASAP1-IT1對細(xì)胞遷移和EMT進(jìn)展的影響。為進(jìn)一步研究沉默的ASAP1-IT1對CCA細(xì)胞遷移和EMT形成的影響，在兩組CCA細(xì)胞中進(jìn)行了transwell分析和Westernblot分 析。 可 見， 與SHNC組 相 比，SH-ASAP1-IT1組CCA細(xì)胞的遷移能力受到抑制（圖3a）。Westernblot分析表明，SH-ASAP1-IT1可顯著提高上皮標(biāo)記物的蛋白質(zhì)水平，而沉默的ASAP1-IT1則可降低間充質(zhì)標(biāo)記物的蛋白質(zhì)水平（圖3b）。結(jié)論：沉默的ASAP1-IT1抑制細(xì)胞遷移和EMT進(jìn)展。

表2 CCA患者預(yù)后參數(shù)的cox回歸多變量分析

圖2 ASAP1-IT1的減少阻礙了CCA細(xì)胞增殖。

圖3 沉默ASAP1-IT1對細(xì)胞遷移和EMT干擾的影響。

3 討論

在過去幾十年中，許多l(xiāng)ncRNA在惡性腫瘤中ASAPIT1被發(fā)現(xiàn)失調(diào)。并證明了lncRNAs在腫瘤發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用[4-5]。本研究將ASAP1-IT1作為一種新的CCA調(diào)節(jié)因子。采用生物信息學(xué)分析方法，分析ASAP1-IT1對CCA的預(yù)后。ASAP1-IT1的高表達(dá)水平與CCA患者的總生存率呈負(fù)相關(guān)。針對ASAP1-IT1高表達(dá)，在CCA細(xì)胞中進(jìn)行功能喪失分析。結(jié)果如預(yù)期，抑制ASAP1-IT1的表達(dá)對細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和EMT進(jìn)展有負(fù)作用。因此，確定了ASAP1-IT1在CCA進(jìn)展中的作用。雖然本研究僅發(fā)現(xiàn)ASAP1-IT1在CCA進(jìn)展中的作用，但研究結(jié)果仍有助于開發(fā)新的CCA治療途徑。我們將在未來尋找更多的ASAP1-IT1上游機(jī)制。