葉挺章

（廣東省肇慶市畜牧良種示范推廣中心 526040）

對于球囊菌的相關(guān)研究在近些年才逐漸推廣起來，但是在研究的過程中，主要受到測序技術(shù)以及組裝軟件的制約，導(dǎo)致對其基因組信息的信息補(bǔ)充始終不夠完整。 本文所采用的RNAseq 技術(shù)能夠有效地利用高精度、高靈敏度的形式來對其進(jìn)行測序等研究，并對其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面的優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 供試球囊菌菌株

長期以來，所采用的球囊菌菌株，一直在某高校的密封保護(hù)實(shí)驗(yàn)室中所存儲。

1.2 測序樣品準(zhǔn)備

首先需要對球囊菌進(jìn)行活化處理，在操作上，首先需要將球囊菌菌株從實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中取出， 之后再將其接種到馬鈴薯的葡萄糖瓊脂所制的培養(yǎng)基之上， 并將其放置在36℃的生化恒溫箱當(dāng)中，進(jìn)行10d 左右的培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基，直到出現(xiàn)了黑色孢子囊以及白色的菌絲。 這個時候?qū)⑴囵B(yǎng)基轉(zhuǎn)移到超凈臺當(dāng)中，讓其孢子囊以及產(chǎn)生的菌絲都轉(zhuǎn)移到RNA-Free 的EP 試管當(dāng)中，并馬上進(jìn)行液氮的冷凍降溫，將其進(jìn)行備用。 這樣的操作便可以有效的對球囊菌當(dāng)中已經(jīng)注釋的基因進(jìn)行預(yù)測， 同時也能起到對新基因的檢測。

1.3 基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化

需要使用SOAP 軟件， 對于還沒有得到映射的核糖體當(dāng)中的讀段，將其映射到球囊菌的參考基因組之上，之后再利用Cufflink 來對其進(jìn)行準(zhǔn)確的讀段，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本的拼接，之后再將出現(xiàn)的重構(gòu)結(jié)果，同已經(jīng)得知的轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行詳細(xì)的對比，但是在一部分的重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本之上，一些序列會有一定程度的延長，進(jìn)而就會實(shí)現(xiàn)蜜蜂球囊菌當(dāng)中， 對已經(jīng)得到注釋的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面的優(yōu)化。

1.4 新基因的生物信息學(xué)預(yù)測

首先需要利用軟件讓重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本，同作為參考的基因組進(jìn)行詳細(xì)的比較，一般來說采用的是Cuffcompare 軟件。 之后便可以在參考的基因組上對其位置進(jìn)行分類。 其中，一旦在classcode當(dāng)中出現(xiàn)了“u”，則可以表示為出現(xiàn)了新基因組。

1.5 新基因的RT-PCR 的相關(guān)驗(yàn)證

首先需要從實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中，取出一定量的進(jìn)行超低溫保存下的球囊菌菌絲以及孢子的試驗(yàn)樣品， 之后再將其加入一定量的液氮，并進(jìn)行充分的攪拌和研磨。 在此之后，需要利用RNA 抽提試劑盒對其研磨液的進(jìn)行RNA 的提取，從而合成了cDNA 的首鏈。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA-seq 數(shù)據(jù)質(zhì)控以及評估

本試驗(yàn)當(dāng)中主要對其樣品當(dāng)中的有效讀段， 同球囊菌當(dāng)中的參考基因組進(jìn)行一一的對比，在最后的結(jié)果上表明，其樣品上的有效讀段同作為參考的基因組占比一般為60%上下。 同時，在進(jìn)行的測序飽和度的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中， 其數(shù)據(jù)表明對樣品的測序深度實(shí)驗(yàn)的不斷增加， 使得其能夠檢測到的基因數(shù)越發(fā)的呈現(xiàn)飽和的趨勢，這就表明該實(shí)驗(yàn)下，選取的測序深度能夠?qū)η蚰揖蜻M(jìn)行全面的覆蓋，從而表明選用的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較為良好，可以進(jìn)行下一步的分析[1]。

2.2 球囊菌基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化

首先需將測序數(shù)據(jù)同球囊菌的基因組進(jìn)行比較， 這樣便可以對已經(jīng)注釋的基因當(dāng)中的結(jié)構(gòu)進(jìn)行明確以及優(yōu)化處理， 本實(shí)驗(yàn)當(dāng)中已經(jīng)對101 個球囊菌當(dāng)中的已注釋基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面的優(yōu)化處理，能夠比較高效率的完成優(yōu)化分析。

2.3 球囊菌新基因的GO 數(shù)據(jù)庫注釋

在實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，已經(jīng)將球囊菌當(dāng)中出現(xiàn)的84 個新基因組收入到了GO 數(shù)據(jù)庫當(dāng)中，這些新基因主要是對生物進(jìn)程、細(xì)胞過程以及分子功能進(jìn)行注釋。 其數(shù)據(jù)庫當(dāng)中能夠涉及到29 個左右的GO 條目，同時得到了最多的注釋基因的領(lǐng)域，主要是關(guān)于代謝進(jìn)程、催化活性等方面。

3 結(jié)論以及討論

在采用了Sanger 雙脫氧鏈末端的終止法，來對球囊菌進(jìn)行了全面的基因組測序工作， 之后再使用軟件來對其基因組進(jìn)行全面的組裝以及相關(guān)的注釋操作， 這樣便可以讓其球囊菌當(dāng)中的基因組的組裝，滿足scafford 的水平之上，同時對于N50 來說，也能夠達(dá)到44 063 的bp。 但是由于在試驗(yàn)的過程中，還是會受到測序技術(shù)以及所使用的各種軟件的影響， 使得容易出現(xiàn)對球囊菌基因組當(dāng)中的各種功能注釋不夠全面的情況， 使得測序的質(zhì)量性比較低，這樣就會嚴(yán)重制約對球囊菌的研究和分析。 但是隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展， 使得在對于各種物種的基因進(jìn)行基因組的測序?qū)嶒?yàn)分析越發(fā)的高效且準(zhǔn)確，能夠逐漸完善注釋信息。 本試驗(yàn)當(dāng)中成功的預(yù)測出了新基因的出現(xiàn)，其中有著67 個假定的蛋白編碼基因，并且在進(jìn)行功能注釋信息的完善過程中，主要是依靠著分子的克隆，從而獲取到基因的全長序列組，這樣便可以完成對新基因以及其具體功能性的研究。

4 結(jié)語

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，在對蜜蜂球囊菌基因結(jié)構(gòu)的研究過程中，進(jìn)一步確定和補(bǔ)充基因組序列，以及功能知識信息，使得其能夠幫助相關(guān)研究人員實(shí)現(xiàn)對球囊菌基因組的分析和研究，并逐漸完善球囊菌的基因組序列， 對其基因功能進(jìn)行注釋信息的補(bǔ)充，促進(jìn)了對新基因功能性的深入研究。