梅兆玲， 周文輝， 馮 景

（1.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽 淮南 232001；2.安徽理工大學(xué)附屬奉賢醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201499）

乳腺癌是女性最為常見(jiàn)的惡性腫瘤，居我國(guó)女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位[1]。乳腺癌的早期診斷與治療能夠顯著改善乳腺癌患者的生存質(zhì)量，并延長(zhǎng)其生存時(shí)間。乳腺癌的常規(guī)治療方式主要為外科手術(shù)、放化療及生物靶向治療。雖然基于眾多腫瘤標(biāo)志物的新型靶向抗腫瘤藥物逐漸被應(yīng)用于臨床，但乳腺癌的早期轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)仍是威脅乳腺癌患者生存的主要原因[2]。近年來(lái)，由于外泌體具有良好的生物相容性、固有循環(huán)屬性、膜蛋白靶向性以及強(qiáng)大的物質(zhì)攜載屬性，在腫瘤的診療中備受矚目。本文就外泌體在乳腺癌診療中的研究進(jìn)展作一概述，旨在進(jìn)一步探討外泌體作為乳腺癌早期診斷指標(biāo)和治療載體的可行性。

1 外泌體的形成及功能

外泌體是由大多數(shù)細(xì)胞分泌產(chǎn)生的直徑為30～100 nm的脂質(zhì)雙層小囊泡，囊泡內(nèi)含有豐富的核酸[DNA、微小RNA（microRNA，miRNA）、環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）、信使RNA等]、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)等物質(zhì)[3]。外泌體廣泛存在于體液（血液、尿液、唾液、腦脊液、乳汁等）中，其內(nèi)容物的確切成分主要取決于分泌細(xì)胞[4]。通過(guò)特異性內(nèi)容物的靶向遞送，外泌體在改變細(xì)胞行為、介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)交流中發(fā)揮重要作用[5]。在乳腺癌中，腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體在乳腺癌細(xì)胞增殖、自我更新、干性維持、腫瘤耐藥、微環(huán)境調(diào)控以及腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要的驅(qū)動(dòng)作用[6]。

2 外泌體在乳腺癌早期診斷中的作用

乳腺癌的診斷主要依賴于體格檢查、影像學(xué)檢查、病理檢查及血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)，但這些診斷方法受瘤體大小、病理分型及特異性的限制，而且還可能會(huì)對(duì)患者的身體產(chǎn)生不良影響。因此，尋找無(wú)創(chuàng)、敏感性與特異性更好的乳腺癌早期診斷新型生物標(biāo)志物成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。乳腺癌患者發(fā)病后，機(jī)體會(huì)大量合成并分泌外泌體，外泌體中包含多種具有乳腺癌細(xì)胞特異性的蛋白質(zhì)、miRNA及長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）等物質(zhì)，并且廣泛存在于患者的血液、尿液、唾液、腦脊液、乳汁等體液中。因此，乳腺癌外泌體可以作為乳腺癌早期診斷的有效標(biāo)志物。在蛋白水平，除發(fā)揮正常生物學(xué)功能的熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）70和HSP90外，外泌體所攜帶的腫瘤抗原[人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）、癌胚抗原、gp100蛋白等]及死亡受體蛋白（FasL、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體等）對(duì)于乳腺癌的診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)均具有重要的參考價(jià)值[7-11]。在核酸水平，與健康女性比較，乳腺癌患者體液來(lái)源的外泌體中，miRNA-21、miRNA-155、miRNA-1246、miRNA-101、miRNA-372的表達(dá)量明顯升高，且與乳腺癌不良預(yù)后顯著相關(guān)[12-13]?！叭幮浴比橄侔┗颊適iRNA-373表達(dá)量明顯高于雌激素受體陽(yáng)性的Luminal型乳腺癌患者[13]。此外，還有研究結(jié)果表明，miRNA-105、miRNA-122、miRNA-141參與了乳腺癌腦轉(zhuǎn)移，與乳腺癌的復(fù)發(fā)相關(guān)，因此可將外周血miRNA-105、miRNA-122、miRNA-141作為診斷乳腺癌腦轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的潛在生物標(biāo)志物[14]。由于外泌體中的lncRNA表達(dá)量相對(duì)較低，且檢測(cè)難度大，目前相關(guān)研究較少。

外泌體miRNA作為乳腺癌重要的診斷指標(biāo)已被廣泛認(rèn)可，但是目前檢測(cè)外泌體miRNA的方法仍存在耗時(shí)、回收效率低的問(wèn)題。此外，提取miRNA時(shí)還需破壞外泌體，易造成miRNA損失并影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，目前亟需建立一種可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)外泌體內(nèi)miRNA的方法。有學(xué)者制備了一種仿病毒融合囊泡，該囊泡可以通過(guò)與外泌體膜的融合將分子信標(biāo)主動(dòng)遞送到外泌體內(nèi)部，從而實(shí)現(xiàn)外泌體內(nèi)特異miRNA的準(zhǔn)確、快速、原位檢測(cè)；在此基礎(chǔ)上，他們又進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了一類高效、多指標(biāo)檢測(cè)的膜融合囊泡，通過(guò)融合蛋白和多肽的篩選，提高囊泡的融合效率；通過(guò)多種核酸分子信標(biāo)的同時(shí)包載，實(shí)現(xiàn)多種腫瘤特異外泌體miRNA的同步檢測(cè)，獲得更豐富的腫瘤診斷信息[15]。

3 外泌體在乳腺癌治療中的作用

侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥是腫瘤治療失敗的主要原因。外泌體作為細(xì)胞間核酸及蛋白質(zhì)等物質(zhì)傳遞的主要方式，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[16-17]。外泌體除了作為液體活檢的目標(biāo)待測(cè)物用于乳腺癌的診斷外，在乳腺癌治療上也發(fā)揮著日益重要的作用，包括調(diào)控外泌體的表達(dá)、將外泌體作為藥物運(yùn)輸載體、將外泌體進(jìn)行工程化修飾用于靶向治療等。

3.1 通過(guò)調(diào)控外泌體的表達(dá)來(lái)治療乳腺癌

近年來(lái)，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)有多種藥物可通過(guò)抑制外泌體的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用，如抗菌藥物磺胺異噁唑可通過(guò)降低外泌體分泌的內(nèi)皮素受體A的表達(dá)來(lái)抑制乳腺癌外泌體的產(chǎn)生，在乳腺癌移植瘤模型中顯示出抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移作用[18]；鹵夫酮可顯著降低乳腺癌細(xì)胞外泌體的釋放，減少miRNA-31的傳遞，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[19]；紫草素能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞外泌體的分泌，從而改變腫瘤微環(huán)境，并抑制乳腺癌細(xì)胞進(jìn)一步增殖[20]。盡管通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體用于乳腺癌治療這一想法在很久之前就已經(jīng)出現(xiàn)，但實(shí)際進(jìn)展并不理想。

3.2 將外泌體作為藥物運(yùn)輸載體治療乳腺癌

常規(guī)化療藥物（紫杉醇、他莫昔芬、常春新堿等）由于具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性及較弱的組織選擇能力，在用于乳腺癌治療時(shí)常會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用。細(xì)胞來(lái)源的外泌體除具有良好的生物兼容性外，還具備強(qiáng)大的生物運(yùn)載能力。因此，外泌體正逐步成為乳腺癌化療藥物遞送的載體。目前，外泌體藥物裝載的主要方式有轉(zhuǎn)染試劑法[21]、超聲法[22]、凍融循環(huán)法[23]、電穿孔法[24]等。MILANO等[25]的研究結(jié)果顯示，在大鼠模型中，間充質(zhì)祖細(xì)胞來(lái)源的外泌體包載的多柔比星/曲妥珠單抗能夠顯著改善其心臟毒性，并增強(qiáng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。KALIMUTHU等[26]利用間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體包載紫杉醇，顯示出更好的體內(nèi)外抗腫瘤效果。

外泌體除作為化療藥物理想的載體外，對(duì)小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）及miRNA等人工合成的核酸類物質(zhì)也有非常好的傳遞作用。LIMONI等[27]通過(guò)特異性改造，將siRNA裝載于HEK293細(xì)胞來(lái)源的外泌體中，改造后的外泌體顯示出顯著的HER-2靶向性，并成功敲低乳腺癌細(xì)胞TPD52基因的表達(dá)。ALVAREZ-ERVITI等[28]通過(guò)電穿孔法將siRNA裝載至樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)源的外泌體中，可有效降低小鼠腦細(xì)胞中BACE1基因的表達(dá)。LIANG等[29]將抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶和miRNA-21寡核苷酸拮抗片段一同包裹在外泌體中，成功實(shí)現(xiàn)了HER-2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的靶向治療。

3.3 通過(guò)外泌體的工程化修飾來(lái)進(jìn)行乳腺癌的靶向治療

相對(duì)于直接裝載治療藥物的外泌體而言，工程化的外泌體修飾因方式多樣、生物學(xué)功能眾多而更加受青睞。外泌體表面定向性修飾是增強(qiáng)外泌體靶向性的一種有效方式。YU等[30]通過(guò)修飾改造，將化療藥物Erastin成功裝載于葉酸標(biāo)記的外泌體中，實(shí)現(xiàn)了乳腺癌的靶向治療。XIONG等[31]通過(guò)計(jì)算機(jī)建模，設(shè)計(jì)并采用巨噬細(xì)胞制備了一種NPs/Rex外泌體，該工程化外泌體在體內(nèi)顯示出更長(zhǎng)的血液循環(huán)半衰期、更強(qiáng)的靶向性、更好的生物相容性，對(duì)原位乳腺癌肺轉(zhuǎn)移病灶具有更好的靶向化療作用。LI等[32]通過(guò)對(duì)巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體做c-Met修飾，成功實(shí)現(xiàn)了外泌體攜帶多西他濱對(duì)乳腺癌的靶向治療。

通過(guò)制備工程化修飾的外泌體用以激活機(jī)體免疫，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的免疫治療是外泌體工程化修飾用于腫瘤治療的另一種有效方式。有學(xué)者利用外泌體錨定肽CP05將高遷移率族核小體結(jié)合域蛋白1（high mobility group nucleosome binding domain protein 1，HMGN1）的功能短肽N1ND負(fù)載于不同腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體表面，修飾后的外泌體在被運(yùn)輸?shù)綐?shù)突狀細(xì)胞中后，成功活化機(jī)體免疫功能，實(shí)現(xiàn)了中晚期肝癌、胰腺癌和乳腺癌的免疫治療[33-34]。SHI等[35]通過(guò)修飾改造，在外泌體的表面同時(shí)表達(dá)T細(xì)胞CD3抗體和HER-2抗體，借助2個(gè)抗體的作用將HER-2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞呈遞給CD3+T細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)乳腺癌的免疫治療。

4 小結(jié)與展望

在過(guò)去的幾十年中，隨著外泌體相關(guān)研究的不斷深入，人們對(duì)外泌體有了更全面的認(rèn)識(shí)，同時(shí)不斷探索基于外泌體的乳腺癌診療方式。當(dāng)前，制約外泌體用于腫瘤診療的因素主要有以下3點(diǎn)：（1）外泌體的提取、鑒定方式并不統(tǒng)一。相對(duì)于品種繁多的商品化提取試劑，傳統(tǒng)的超速離心法更具權(quán)威性，但也是最繁瑣、要求最高的分離方式；外泌體的鑒定除電子顯微鏡外，并不能進(jìn)行有效的定量分析。因此，建立行之有效的、統(tǒng)一的外泌體分離及鑒定方法顯得尤為緊迫。（2）外泌體的基礎(chǔ)生物學(xué)知識(shí)仍需要進(jìn)一步深入探索，如外泌體在體內(nèi)分布的行為方式，只有明確了這一點(diǎn)，才能有效避免外泌體藥物在肝臟中的富集和清除。（3）更為有效、精準(zhǔn)的外泌體改造方式仍需進(jìn)一步研究。

雖然到目前為止還沒(méi)有一種基于外泌體的抗腫瘤藥物獲批上市，但得益于外泌體的天然屬性及其強(qiáng)大的物質(zhì)運(yùn)載能力，外泌體依然有成為腫瘤靶向藥物的巨大潛力。外泌體的工程化修飾用于腫瘤的靶向治療及免疫治療，將是未來(lái)外泌體抗腫瘤藥物研發(fā)的關(guān)鍵所在。