,*

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢 430023;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院,湖北武漢 430020)

丙烯酰胺(Acrylamid,AA)是一種白色晶體物質(zhì),室溫下穩(wěn)定,作為重要的化工原料在熔融或暴露在紫外光以及氧化條件下易發(fā)生聚合反應(yīng)產(chǎn)生聚丙烯酰胺。聚丙烯酰胺具有較好的穩(wěn)定、絮凝作用,在污水處理、石油開采、造紙工業(yè)等行業(yè)都有十分廣泛的應(yīng)用,素有“百業(yè)助劑”之稱[1-2]。AA于1994年被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)劃分為“2A類可能致癌物”[3]。2002年瑞典研究人員發(fā)現(xiàn)富含碳水化合物低蛋白質(zhì)的植物性食物在油炸及焙烤等高溫(>120 ℃)烹飪處理下容易產(chǎn)生AA[4-5]。在特定條件下,羰基化合物(還原糖)和氨基化合物(蛋白質(zhì)、氨基酸)發(fā)生非酶褐變的美拉德反應(yīng)過程中也會(huì)產(chǎn)生AA[6-7]。食品中AA的產(chǎn)生引起了國際社會(huì)和各國政府的高度關(guān)注。大量研究表明,AA具有生殖毒性[8]、遺傳毒性[9]和致癌性[10]。世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)聯(lián)合食品添加劑專家委員會(huì)(JECFA)對(duì)食品中AA的危害進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估,警示其對(duì)人類健康存在潛在性危害,根據(jù)各國居民AA攝入量,將人均攝入量控制為0.001 mg/(kg·d)[11]。

食品中AA的形成是一個(gè)多級(jí)反應(yīng)過程,目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為美拉德反應(yīng)中天冬酰胺和還原糖是形成AA的關(guān)鍵因素[12]。美拉德反應(yīng)賦予了食品特定的色、香、味,是提升食用品質(zhì)的重要途徑,富含碳水化合物的食品在熱處理過程中不可避免會(huì)產(chǎn)生AA。國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)調(diào)整加工工藝,例如溫水或檸檬酸溶液浸泡原料能降低油炸薯?xiàng)l中的AA含量[13]。降低加工溫度和減少加熱時(shí)間也可減少AA生成量[14]。在加工過程中,添加抑制劑,例如天冬酰胺酶[15]、NaCl[16]、氨基酸[17]、黃酮類物質(zhì)[18],能明顯抑制食物中AA含量。人體可通過消化道、呼吸道、皮膚黏膜等多種途徑接觸AA,但目前還未有飲食中暴露評(píng)估和流行病學(xué)調(diào)查研究表明AA與人類健康存在直接關(guān)系。

鑒于AA的毒性以及在食品中存在的普遍性,為了保護(hù)消費(fèi)者安全,準(zhǔn)確分析食品中AA含量,降低食品安全風(fēng)險(xiǎn)顯得尤為重要。隨著科技的發(fā)展,尤其是新型納米材料的發(fā)展,目前已有大量AA新型檢測方法被報(bào)道[19-20],本文對(duì)國內(nèi)外用于食品中AA的傳統(tǒng)和新型檢測方法進(jìn)行總結(jié)和分析,分析其優(yōu)缺點(diǎn),針對(duì)當(dāng)前準(zhǔn)確、快速的檢測需求,為開發(fā)良好選擇性、高靈敏度、抗干擾能力強(qiáng)的準(zhǔn)確、快速檢測方法提供新的思路。

1 食品中丙烯酰胺的前處理方法

食品中的AA分子量低、極性高、水溶性好,且缺乏明顯的發(fā)色團(tuán)(芳香環(huán)、共軛雙鍵、三鍵)等性質(zhì),很難直接定量檢測,需要對(duì)食品樣品進(jìn)行前處理。包括物理方式,如粉碎、研磨、均質(zhì)、玻璃棉過濾、離心、高速離心和超濾等,其可除去一些大顆粒物質(zhì)、淀粉基質(zhì)和非極性的大分子物質(zhì);化學(xué)方式,如石油醚等非極性溶劑的液-液萃取除油脂,Carrez試劑(鐵氰化鉀/硫酸鋅)、甲醇等除去蛋白質(zhì)等。AA為極性小分子化合物,水溶性好,一般采用極性強(qiáng)的溶劑作為提取劑,如水、鹽溶液、有機(jī)溶劑(甲酸、丙酮、乙腈等)。大多數(shù)食品樣品中的AA在水中能夠被完全提取,因此水是使用最廣泛的提取劑,可最大程度地去除食品中非極性物質(zhì)的干擾。然而,用水做提取劑時(shí),食品基質(zhì)中的其他極性物質(zhì)也會(huì)保留于提取液中,因此需在后續(xù)的步驟中將這些極性干擾物除去。相較于水來說,有機(jī)溶劑提取體系可將包埋在脂肪微粒中的AA充分提取出來,尤其適用于高脂食品,且溶劑易蒸發(fā)便于濃縮。研究報(bào)道顯示,將水(或鹽溶液)與有機(jī)溶劑混合可有效提高AA的提取效率[21]。

除去AA提取液中的干擾物,通常采用固相微萃取(Solid phase microextraction,SPME)技術(shù)來純化提取液。該方法簡單、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可重復(fù)性好,已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、分析化學(xué)等領(lǐng)域。根據(jù)填料保留機(jī)理的不同,SPME柱可分成兩類。第一類是填料保留AA,SPME柱內(nèi)的填料通過氫鍵、π-π作用、陽離子交換作用將AA保留在SPME柱上,再用極性溶劑洗脫并收集,如Oasis HLB和Bond Elut-Accucat柱等[22]。針對(duì)AA開發(fā)出特異性吸附材料作為填料能提高吸附效率,如Arabi等[23]合成仿生分子印跡功能化二氧化硅納米材料作為分散劑,其回收率達(dá)91%,而無印跡二氧化硅納米填料萃取回收率為39%～60%。另一類是填料保留雜質(zhì)從而到純化的目的,如C18柱等[24]。經(jīng)過純化后的提取液進(jìn)行后續(xù)檢測,在靈敏度和準(zhǔn)確性上將大幅提高。

2 丙烯酰胺的傳統(tǒng)檢測方法

目前用于食品中AA的標(biāo)準(zhǔn)/傳統(tǒng)檢測方法主要有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS),高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,HPLC-MS/MS)和毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis,CE)。

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)

運(yùn)用GC-MS檢測AA已被廣泛認(rèn)可,國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)頒布《GB 5009.204-2014食品中丙烯酰胺的測定 穩(wěn)定性同位素稀釋的氣相色譜-質(zhì)譜法》作為檢測AA的第二法[25],學(xué)者對(duì)于GC-MS檢測AA也有大量研究[26-27]。GC-MS法要求被分析物必須具有一定的熱穩(wěn)定性和揮發(fā)性,但AA屬熱不穩(wěn)定性的化合物,遇熱易分解,不能直接用于檢測,一般先通過衍生化處理以提高穩(wěn)定性,進(jìn)而提高檢測的準(zhǔn)確度和靈敏度。溴化衍生是常用的衍生方法,AA溴化衍生產(chǎn)物主要有2,3-二溴丙酰胺或2-溴AA,測定2,3-二溴丙酰胺應(yīng)用最為廣泛[28]。常用溴化試劑有兩類,一種采用飽和溴水和溴化氫作為衍生化試劑[29],此種衍生方法不僅需要較長時(shí)間,而且飽和溴水較難制備,操作相對(duì)危險(xiǎn);另一種采用溴化鉀與溴酸鉀反應(yīng)生成的新生態(tài)溴參與衍生化反應(yīng),在安全性方面提高很多,所需衍生時(shí)間相對(duì)較短,我國國標(biāo)中推薦使用這種衍生方法[30]。

采用GC-MS檢測AA時(shí)一般采用穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù),在試樣中加入13C3標(biāo)記的AA作為內(nèi)標(biāo)物,進(jìn)行多反應(yīng)離子監(jiān)測或選擇離子監(jiān)測定量。羅蘭等[31]利用d3-AA作內(nèi)標(biāo),用占噸醇做衍生試劑,建立測定不同種類熱加工食品中AA的GC-MS法。該方法檢出限為0.7 μg/kg(S/N=3),線性范圍為0.005～4 μg/mL,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)小于6.1%,回收率為95%～112%。程劼等[32]建立氣相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(GC-MS/MS)檢測餐廚廢棄物中的AA。樣品經(jīng)去離子水提取結(jié)合C18-SPEM柱凈化或者經(jīng)甲酸溶液提取/Carrez試劑預(yù)處理,MCX柱凈化的兩種前處理方法進(jìn)行前處理,結(jié)果該方法在3.0～30 ng/L濃度中呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,檢測限(limit of detection,LOD)為1.0 ng/g(S/N=3),回收率為95.3%～108.1%,RSD均小于4.3%。該方法穩(wěn)定、靈敏度高,可用于餐廚廢棄物中AA的測定。采用GC-MS方法靈敏度高,專一性好,檢測限低,但溴化衍生所需時(shí)間較長,反應(yīng)條件也較為苛刻[27]。不經(jīng)衍生AA的GC-MS測定方法通常需要高靈敏氣相色譜檢測器如高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜、氮磷檢測器、串級(jí)質(zhì)譜等,這類檢測器具有高選擇性和高靈敏度的特點(diǎn),但存在檢測費(fèi)用昂貴的不足。

2.2 高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)

采用液相色譜方法在樣品預(yù)處理后無需對(duì)AA進(jìn)行衍生,可直接測定,簡化了分析過程,應(yīng)用更為廣泛。AA經(jīng)過LC分離后,進(jìn)入檢測器,最常使用的檢測方法是串聯(lián)質(zhì)譜儀,較少使用紫外光(ultra violet,UV)或者單獨(dú)使用MS(一級(jí)色譜的單離子監(jiān)控模式,SIM)[33]。郝亞楠等[34]將樣品液反相C18萃取柱純化后利用紫外分光光度法快速測定油炸食品中AA的含量,線性范圍為0.25～6.0 μg/L,回收率為90.07%～104.8%,RSD為0.5%。UV檢測器一般在200 nm左右,檢測AA不飽和羰基的紫外吸收,UV檢測缺乏選擇性,復(fù)雜食品基質(zhì)干擾檢測結(jié)果導(dǎo)致靈敏度不高,線性范圍在mg/L范圍內(nèi)[33]。更多的研究是使用串聯(lián)質(zhì)譜MS/MS的SRM或MRM模式進(jìn)行檢測[35-36]。我國《GB 5009.204-2014食品中丙烯酰胺的測定 穩(wěn)定性同位素稀釋的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》推薦使用該模式作為檢測AA的第一法。HPLC-MS/MS是檢測AA可靠手段之一。王浩等[37]建立了HPLC-MS/MS測定嬰幼兒營養(yǎng)米粉中AA殘留的檢測方法,以MGⅢ-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)分離,流動(dòng)相為甲醇和水(梯度洗脫),流速0.20 mL/min,同位素內(nèi)標(biāo)定量,LOD為10 μg/kg,回收率為90.2%～103.1%,RSD為3.80%～4.87%。該方法前處理簡單,靈敏度高,適合于嬰幼兒營養(yǎng)米粉中AA殘留快速檢測。Wang等[38]利用HPLC-ESI-MS/MS檢測嬰兒配方奶粉中AA,線性范圍為1～200 ng/mL,LOD為4.0 μg/kg,方法回收率為90%～110%,RSD<6.20%。Faraji等[39]利用超聲輔助液-液萃取AA后用2-萘硫醇衍生,利用HPLC檢測面包和餅干中的AA,線性范圍為10～1000 μg/L,LOD為3 μg/L,RSD為2.3%～8.2%,回收率90%～96%。相比之下,超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)常使用反相色譜柱BEH C18(150 mm×2.1 mm,1.7 μm),兩者的分離原理相同,UPLC管路和色譜柱較HPLC更細(xì),柱效更高,分離效果更好,靈敏度更高。李月歡等[40]建立超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS/MS)技術(shù)檢測薯片、方便面、米線中AA的方法,線性范圍為1.4～200 μg/L,加標(biāo)回收率為80%～115%,RSD為1.6%～2.9%。Galuch等[36]利用UPLC-MS/MS檢測滴濾咖啡中AA,線性范圍為3～100 μg/L,LOD為0.9 μg/L,加標(biāo)回收率為97%～106%,RSD為3%～9%。UPLC方法準(zhǔn)確、靈敏,適用于食品中痕量、超痕量AA的檢測。

2.3 毛細(xì)管電泳法(CE)

CE是以熔融石英毛細(xì)管為分離通道,其內(nèi)壁作為分離載體,以高壓直流電場產(chǎn)生的電滲流做為驅(qū)動(dòng)力,基于雙電層的電泳和電滲,各組分由于電泳、電滲以及分子擴(kuò)散等作用,在流動(dòng)相與固定相之間沿管軸方向運(yùn)動(dòng)的速度差異進(jìn)行分離,即利用差速運(yùn)動(dòng)進(jìn)行分離。一般先利用CE進(jìn)行高效分離,然后進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測[41]。由于AA不帶電,要實(shí)現(xiàn)CE法高效分析需要先使其帶上電荷,如采用表面活性劑包裹,衍生連接上易電離的物質(zhì)。殷斌等[42]利用C18及弗羅里硅土混合作為萃取劑,丙酮-二氯甲烷作為洗脫劑,用基質(zhì)固相分散萃取-毛細(xì)管電泳對(duì)樣品提取、凈化、富集,用二極管陣列檢測器檢測米制品中AA,該方法的線性范圍為10～200 μg/mL,LOD為0.62 μg/mL,回收率為85.7%～96.4%,RSD為1.5%。Yang等[43]利用半胱氨酸通過巰基雙鍵點(diǎn)擊衍生AA,CE分離后結(jié)合電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測馬鈴薯制品中的AA,線性范圍為7～200 μmol/L,LOD為0.16 μmol/L。此外,還有結(jié)合超聲波輔助離子液體富集AA從而提高CE分離效率[44],利用量子點(diǎn)調(diào)制提高CE中激光誘導(dǎo)熒光檢測器靈敏度[45]。CE法檢測食品中AA主要優(yōu)點(diǎn)是快速、進(jìn)樣量小、設(shè)備相對(duì)簡單,不需要復(fù)雜的前處理,同時(shí)能實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測。

3 丙烯酰胺的新型檢測方法

3.1 酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)

酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是利用抗原和抗體高特異性結(jié)合的免疫學(xué)反應(yīng)與酶催化反應(yīng)相結(jié)合,對(duì)分析物進(jìn)行快速定量檢測。而丙烯酰胺屬于半抗原小分子,不具有抗原決定簇,無免疫原性,因此其必須與大分子的免疫載體蛋白連接獲得耦合物完全抗原,通過復(fù)合物刺激動(dòng)物機(jī)體后產(chǎn)生抗體[46]。ELISA一般有直接競爭和間接競爭兩種方法:直接競爭法是將AA抗體固定在基板上,樣品中的AA和AA-酶復(fù)合物競爭與抗體結(jié)合;間接競爭法是將AA-載體蛋白固定在基板上,基板上和樣品中的AA與抗體競爭結(jié)合,然后標(biāo)記酶的第二抗體與吸附在基板上的抗體結(jié)合。隨后加入酶催化底物,產(chǎn)生顏色反應(yīng),檢測吸光度,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線測定AA濃度。

付云潔等[47]用戊二醛交聯(lián)AA-牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BAS)合成免疫抗原,注入兔體內(nèi)以產(chǎn)生抗AA多克隆抗體,采用間接競爭ELISA法檢測土豆泥中AA。在優(yōu)化條件下,間接ELISA法的線性檢測范圍為50～1280 μg/L,LOD為50 μg/L,回收率為92.6%～95.5%。為了提高AA抗體的靈敏度,采用N-丙烯酸琥珀酰亞胺酯(N-acryloxysuccinimide,NAS)[48]和3-巰基苯甲酸衍生AA[49]作為半抗原來合成具有高結(jié)合常數(shù)的完全抗原。例如Quan等[50]利用NAS-血藍(lán)蛋白復(fù)合物產(chǎn)生抗體,采用直接ELISA結(jié)合增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光方法檢測食品樣品中的AA,魯米諾-H2O2-辣根過氧化物酶的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)比傳統(tǒng)的3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺-H2O2-辣根過氧化物酶的可見光比色系統(tǒng)在靈敏度方面提升2～3個(gè)數(shù)量級(jí),線性檢測范圍為26.3～221.1 ng/mL,LOD為18.6 ng/mL,回收率為74.4%～98.1%。Singh等[51]利用3-巰基苯甲酸-AA-BSA復(fù)合物產(chǎn)生抗體,采用間接競爭ELISA檢測食品中的AA,LOD為5.0 ng/g,回收率為95%～100%,與傳統(tǒng)LC-MS/MS檢測結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.15)上相似,可用于食品基質(zhì)中AA的篩選和半定量檢測。相比于傳統(tǒng)檢測方法,ELISA方法有可比擬的靈敏度、成本低、簡單、快速,不需要昂貴的設(shè)備和復(fù)雜的樣品準(zhǔn)備。目前,ELISA試劑盒已有大量商業(yè)化產(chǎn)品[52],具有較高的回收率,有望作為現(xiàn)場快速檢測方法,檢測結(jié)果有直接參考價(jià)值;然而,如何獲得特異性強(qiáng)、親合力高、穩(wěn)定好的抗體是該方法需要解決的問題。

3.2 生物傳感方法

隨著技術(shù)的進(jìn)步,很多新型的生物傳感方法被開發(fā)用于檢測AA。生物傳感器具有專一性好、特異性強(qiáng)、檢測速度快、靈敏度高、成本低、操作簡單、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)分析等優(yōu)點(diǎn),廣泛用于食品、環(huán)境、臨床的分析和檢測中[53]。生物傳感器是一種以生物敏感材料為識(shí)別元件(包括酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì))結(jié)合適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器及信號(hào)放大裝置的分析工具或系統(tǒng)。其基本原理為:當(dāng)目標(biāo)物與識(shí)別元件特異性結(jié)合后,可通過信號(hào)轉(zhuǎn)換器將檢測信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào),經(jīng)過儀表放大和輸出從而達(dá)到檢測目標(biāo)物的目的。目前在AA檢測中使用較多的有電化學(xué)生物傳感器和熒光傳感器。

3.2.1 電化學(xué)生物傳感器 電化學(xué)生物傳感器檢測AA大多數(shù)采用血紅蛋白(hemoglobin,Hb)作為識(shí)別元件,AA與Hb中N-端纈氨酸的α-NH2之間相互作用,結(jié)合伏安法構(gòu)建電化學(xué)傳感器?；驹硎菍b固定在電極表面,AA與Hb發(fā)生Michael親核加成反應(yīng)生成聚合物,增大Hb內(nèi)氧化還原對(duì)(Hb-Fe(Ⅲ)/Hb-Fe(Ⅱ))與電極之間的距離,阻礙電子傳遞,引起電極鈍化,AA濃度不同,鈍化程度也不同,可以快速測定AA含量[54-55]。提高Hb在電極上的固定效率(包括固定量和Hb的活性)和電子轉(zhuǎn)移效率是構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器檢測AA的關(guān)鍵。由于Hb的氧化還原中心位于絕緣的肽鏈中,將Hb直接修飾于電極上會(huì)抑制其活性。因此,通常用納米材料(碳納米管、石墨烯、納米金等)來增加Hb的固定效率和電子的轉(zhuǎn)移效率[56-58]。Krajewska等[59]用Hb/單臂碳納米管修飾的玻碳電極檢測薯片提取液中的AA,該方法的線性范圍7.1×10-4～7.1×10-2μg/kg,LOD為0.071 μg/kg。Garabagiu等[60]用Hb-納米金修飾氧化銦錫玻璃電極檢測食品中的AA,線性檢測范圍為0.71～7.1×102μg/kg,LOD為2.84 μg/kg。Asnaashari等[61]將單鏈SH-ssDNA1通過金-S鍵修飾絲網(wǎng)印刷金電極表面,Hb修飾的互補(bǔ)ssDNA2與ssDNA1配對(duì),將Hb固定在金電極上,采用方波伏安法檢測薯?xiàng)l水提取液中的AA。該方法的線性范圍為2.0×10-6～5.0×10-2mol/L,LOD為1.58×10-7mol/L,具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。景俊賢等[62]采用介孔材料/金納米粒子/血紅蛋白(CMK-Au-Hb)修飾電極,對(duì)AA實(shí)現(xiàn)快速檢測。采用試劑分散和滴涂技術(shù)制備介孔材料敏感膜并修飾在電極上,同時(shí)采用循環(huán)伏安法和電化學(xué)交流阻抗法研究AA在所制備傳感器上的電化學(xué)行為,發(fā)現(xiàn)AA濃度在1.0×10-11～1.0×10-4mol/L范圍內(nèi),峰電流與濃度的負(fù)對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系,LOD為3.3×10-12mol/L。

除了利用Hb-AA反應(yīng)設(shè)計(jì)電化學(xué)傳感器方法以外,Kleefisch等[63]采用石英晶體微天平方法來測量AA,首先利用四個(gè)大環(huán)分子四內(nèi)酰胺合成超分子,超分子內(nèi)部的空穴位點(diǎn)對(duì)AA具有親和性,可特異性識(shí)別AA。將此超分子作為識(shí)別元件固定于石英晶體芯片上,AA結(jié)合到芯片上會(huì)引起共振頻率變化,從而產(chǎn)生響應(yīng)信號(hào)。以此原理構(gòu)建的壓電傳感器的LOD為10 ng/kg,同時(shí)具有良好的特異性,但僅適用于有限種類食品中AA的檢測,對(duì)于不同來源AA的交互性待進(jìn)一步驗(yàn)證。分子印跡技術(shù)是一種分子識(shí)別技術(shù),合成的印記模板可作為識(shí)別元件用于開發(fā)食品分析檢測方法[64]。例如,毛祿剛等[65]將AA溶膠凝膠分子印跡膜沉積在多壁碳納米管-殼聚糖修飾的電極表面構(gòu)建電化學(xué)傳感器檢測AA,該方法的線性范圍為0.2～10 μg/mL,LOD為0.079 μg/mL。該方法簡便,準(zhǔn)確,但構(gòu)建的傳感器使用時(shí)間相對(duì)較短,在4 ℃下傳感器有效期只有9 d,需要進(jìn)一步優(yōu)化。還有直接利用AA電化學(xué)特性進(jìn)行直接檢測,Zargar等[66]將鈷離子加入AA溶液中,在方波伏安法下產(chǎn)生催化峰電流,電流信號(hào)正比于AA濃度,該方法的線性范圍為200～800 ng/mL,LOD為3.52 ng/mL。該方法簡單、快速,但在高濃度的堿土金屬例子溶液中,尤其是Na+存在時(shí)不靈敏,Na+在食品中廣泛存在,這限制了該方法的使用。

電化學(xué)生物傳感檢測AA不需要復(fù)雜的樣品前處理,Hb-AA反應(yīng)的特異性、氧化還原電位高靈敏度以及基質(zhì)成分引起的干擾低,使得基于此原理的電化學(xué)生物傳感器可應(yīng)用于檢測薯片中的AA。具有良好生物相容性的納米材料不僅可以增加電極上Hb的固定量且保持Hb的生物活性,從而提高電化學(xué)生物傳感器的靈敏度。然而,Hb和AA之間不可逆的相互作用導(dǎo)致工作電極很難重復(fù)使用,在今后的研究中,需要開發(fā)可重復(fù)使用的修飾方法,并在不同食品樣品中驗(yàn)證方法的通用性,有望替代傳統(tǒng)的HPLC-MS、GC-MS。

3.2.2 熒光傳感器法 熒光檢測法因其快速、高靈敏度應(yīng)用于食品樣品中AA的檢測[67]。Liu等[68]利用AA通過霍夫曼反應(yīng)降解生成乙烯胺,乙烯胺再與熒光物質(zhì)反應(yīng)生成吡咯啉酮,吡咯啉酮在480 nm波長下發(fā)射強(qiáng)熒光,隨著AA的濃度增加,熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。用此方法構(gòu)建熒光傳感器測定食品中AA的含量,線性范圍為0.05～20 μg/mL,LOD為0.015 μg/mL。該方法簡單、快速,但只能檢測能發(fā)射紫外光的物質(zhì)。Hu等[69]將類AA物質(zhì)修飾在量子點(diǎn)(quantum dot,QDs)表面,功能化QDs表面的碳碳雙鍵在紫外光和光引發(fā)劑的共同作用下發(fā)生光聚合反應(yīng),引起QDs間距縮小,導(dǎo)致熒光強(qiáng)度減弱。當(dāng)AA存在時(shí),AA與QDs表面的雙鍵均參與光聚合反應(yīng),使得間距QDs增大,熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。該方法對(duì)AA的線性檢測范圍為0.5～5.0×104μmol/L,LOD為0.5 μmol/L。但L-天冬酰胺(生成AA的前體物)對(duì)該方法存在嚴(yán)重干擾,檢測食品樣品時(shí),需要加入L-天冬酰胺酶降解,以降低L-天冬酰胺的干擾。Liu等[70]利用分析印記技術(shù)將Mn2+摻雜ZnS QDs固定在氧化石墨烯表面,洗去AA后形成AA印跡模板,ZnS QDs作為熒光源。當(dāng)AA存在,AA與嵌入印跡模板中淬滅ZnS QDs的熒光,根據(jù)熒光淬滅強(qiáng)度檢測樣品中的AA,該方法的線性范圍為0.5～60 μmol/L,LOD為0.17 μmol/L,水樣品中加標(biāo)回收率為100.2%～104.5%,RSD為1.9%～3.9%。Asnaashari等[71]利用納米金和FAM標(biāo)記的單鏈DNA構(gòu)建簡單熒光傳感器,AA存在時(shí),AA與互補(bǔ)DNA相互作用形成加成物,FAM標(biāo)記的單鏈DNA游離在溶液中從而吸附在納米金表面,FAM的熒光被納米金淬滅。該方法的線性范圍為1×10-7～0.05 mol/L,LOD為1×10-8mol/L。以上開發(fā)的熒光傳感法簡單快速,但存在明顯的缺陷,如針對(duì)AA中不飽和雙鍵特異性差、AA與DNA相互作用力弱,容易受到食品基質(zhì)干擾的缺點(diǎn),在檢測實(shí)際樣品中需要結(jié)合高效的AA分離富集方法,以除去雜質(zhì)干擾,來保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確度。

3.3 光譜法

對(duì)于AA的檢測常用分子光譜法中除了紫外-可見分光光度法之外,還有比色法、拉曼光譜、紅外光譜法等。

比色法具有快速、簡便、直接觀察顏色結(jié)果的優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于食品檢測。Hu等[72]利用石英晶體微天平篩選出對(duì)AA特異性識(shí)別的適配體作為識(shí)別元件,AA存在時(shí),適配體與AA結(jié)合,溶液中納米金加入高濃度鹽溶液,引起納米金聚集,顏色由紅變藍(lán),不存在AA時(shí),適配體吸附在納米金表面,加入高濃度鹽溶液后紅色納米金顏色不變。該方法的檢測線性范圍為0.5～10 μmol/L,LOD為0.390 μmol/L。Hu等[73]還利用親核試劑引發(fā)的硫醇-烯-邁克爾加成法構(gòu)建了納米金比色傳感器檢測AA,AA存在時(shí),與谷胱甘肽上的巰基發(fā)生邁克爾加成生成谷胱甘肽-AA復(fù)合物,由于巰基被消耗,加入納米金后顏色不變;不存在AA時(shí),谷胱甘肽上的巰基與納米金反應(yīng),使得納米金聚集,顏色由紅變藍(lán)。此方法有較高的靈敏度,線性范圍為0.1～80 μmol/L,LOD為28.6 nmol/L。與HPLC法相比,該法具有簡便、快速、準(zhǔn)確、樣品預(yù)處理簡單、無需衍生化等優(yōu)點(diǎn)。

基于表面拉曼散射增強(qiáng)傳感器(surface enhanced raman scattering,SERS),具有分子特異性、高分辨率、高靈敏度等獨(dú)特優(yōu)勢,其原理是用通常的拉曼光譜法測定吸附在膠質(zhì)金屬顆粒(如金、銀或銅)表面的樣品,或直接吸附在金屬片粗糙表面的樣品,拉曼光譜信號(hào)受表面等離子共振從而得到增強(qiáng)。Gezer等[74]用此方法實(shí)現(xiàn)了食品中AA的檢測,其拉曼光譜特征峰在1447 cm-1處,線性范圍為10 μg/mL～10 ng/mL,LOD為10 μg/mL。Cheng等[75]結(jié)合分散固相微萃取和拉曼光譜,在還原石墨烯上沉積納米金顆粒進(jìn)行拉曼光譜信號(hào)增強(qiáng),所構(gòu)建的方法線性范圍為5～100 μg/kg,LOD為2 μg/kg。拉曼光譜檢測快速、簡單,但是極少數(shù)貴金屬粗糙面才具有強(qiáng)SERS效應(yīng),其制作工藝難以統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化導(dǎo)致其重復(fù)性較差,應(yīng)用受到限制。

Ayvaz等[76]應(yīng)用便攜式手持紅外光譜儀對(duì)薯片進(jìn)行了快速篩選和AA含量的測定,在206～510 μg/L范圍內(nèi)建立偏最小二乘回歸模型,預(yù)測相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.91,預(yù)測誤差在22.1～28.9 μg/L內(nèi),可用于高通量AA的快速檢測。近紅外光譜法分析簡便快速、不會(huì)破壞待分析樣品,可用于AA在線檢測。此外,趙琛[77]對(duì)油炸食品中的AA經(jīng)提取后,利用魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系的增強(qiáng)作用,建立了AA的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光新的分析方法。該法簡便快捷、成本低廉、實(shí)用性強(qiáng),適用于測定油炸食品中的AA。

3.4 機(jī)器視覺方法

美拉德反應(yīng)中還原糖和天冬酰胺反應(yīng)生成AA,常伴隨著顏色的變化。G?kmen[78]課題組早期采用L*a*b體系來測定食品的顏色對(duì)AA進(jìn)行定量。隨后采用機(jī)器視覺法將食品樣品圖像進(jìn)行顏色分區(qū),用多種算法對(duì)圖像進(jìn)行分析處理,建立褐變比率與AA濃度之間的關(guān)系來定量分析食品中AA的含量[79]。王成琳[80]探討了計(jì)算機(jī)視覺技術(shù)檢測熏烤肉中AA含量,發(fā)現(xiàn)熏烤肉中AA含量值與烤肉圖像兩個(gè)表面的a*分量的平均值有很強(qiáng)的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)達(dá)0.971,與國標(biāo)方法相比,最大相對(duì)誤差為5.04%?；谑称奉伾肿兊臋z測方法快速、簡單、易操作、且無需樣品前處理步驟,機(jī)器視覺方法可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線監(jiān)測食品加工過程中AA的含量,但這種基于褐變的檢測方法不夠準(zhǔn)確,受物料、加工方式等因素影響,適合于AA的初步篩查。

4 結(jié)論與展望

目前國際上已研究開發(fā)了多種AA的檢測方法,傳統(tǒng)的氣相色譜、液相色譜及與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是當(dāng)今國際常用來檢測AA含量的標(biāo)準(zhǔn)方法,這些方法選擇性好、結(jié)果可靠,但是往往需要較昂貴的儀器及專業(yè)操作,且樣品前處理通常比較復(fù)雜,檢測費(fèi)用高,因此難以進(jìn)行大范圍的樣品監(jiān)測。

隨著消費(fèi)者對(duì)食品健康消費(fèi)需求越來越高,各國對(duì)食品中AA的安全性越來越重視,越來越多的快速檢測方法被開發(fā)出來。這些方法具有簡便、靈敏、準(zhǔn)確、成本低的優(yōu)點(diǎn),具有很大應(yīng)用潛力,為準(zhǔn)確、快速檢測AA提供了更多的選擇。于此同時(shí),為保證食品快速檢測方法評(píng)價(jià)工作科學(xué)合理、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一,2017年國家食品藥品監(jiān)管總局組織制定了《食品快速檢測方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》,為開發(fā)AA快速檢測方法提供的標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù),表明快速檢測方法已經(jīng)成為可選擇檢測方法之一。通過本文綜述發(fā)現(xiàn),在這些快速檢測方法中,免疫檢測技術(shù)在微量及痕量、準(zhǔn)確、快速檢測方面具有很大優(yōu)勢,具有良好的應(yīng)用前景。如何獲得特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好的抗體是目前急需解決的問題,因此目前尚未能進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用。生物傳感技術(shù)基本不受食品體系中其他成分的干擾,具有高靈敏度和選擇性,在分析食品中AA的研究表現(xiàn)出巨大的發(fā)展?jié)摿?但在傳感器的穩(wěn)定性和重復(fù)性需要進(jìn)一步優(yōu)化。光譜法能實(shí)現(xiàn)AA含量的現(xiàn)場快速檢測,其中近紅外光譜和機(jī)器視覺方法可用于AA的在線快速篩查,具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力。不同的檢測分析方法各有其利弊,需要根據(jù)食品樣品特點(diǎn)和應(yīng)用需求合適選擇分析檢測方法。其次樣品的前處理,分析物的分離與富集仍然需開發(fā)簡便、高效的方法,其中自動(dòng)化和微量化是今后發(fā)展趨勢。結(jié)合新技術(shù)和新材料的發(fā)展,開發(fā)的AA新型檢測技術(shù)應(yīng)往簡單、快速、成本低、靈敏度高、操作簡單、現(xiàn)場分析等方面發(fā)展。