張明軍，羅俊一，楊毅寧

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心臟中心冠心病一科，烏魯木齊 830000)

自噬是真核細胞生物的生理功能，可以降解細胞內(nèi)容物，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。通過自噬，細胞內(nèi)的氨基酸和脂肪酸等物質(zhì)被回收利用，產(chǎn)生的腺嘌呤核苷三磷酸能夠參與細胞的信號轉(zhuǎn)導、能量代謝等多種細胞活動。自噬目前被分為巨自噬、微自噬以及分子伴侶介導的自噬，巨自噬的特征在于形成自噬體，雙膜結(jié)構(gòu)的自噬體能夠吞噬細胞器并與溶酶體融合；微自噬是通過膜表面的內(nèi)陷將胞質(zhì)內(nèi)容物直接吞入溶酶體中；分子伴侶介導的自噬以熱激蛋白70介導的方式將蛋白質(zhì)直接轉(zhuǎn)運到溶酶體中[1-3]。自噬也可以分為選擇性自噬和非選擇性自噬，通過選擇性自噬，細胞能夠?qū)€粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等細胞器進行選擇性降解[1,4-5]。Lemasters[6]在2005年首次引入“線粒體自噬”來描述線粒體的選擇性自噬。線粒體自噬屬于巨自噬的一種，通過自噬能夠維持線粒體的穩(wěn)態(tài)，保證供能細胞器的正常功能，對于細胞的新陳代謝及細胞凋亡等過程具有重要作用。線粒體自噬主要分為兩種：一種是PTEN誘導的假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1，PINK1)-Parkin依賴性線粒體自噬；另一種是PINK1-Parkin非依賴性線粒體自噬，包括FUNDC1(FUN14 domain containing 1)參與的線粒體自噬和Bnip3L/Nix(Bcl2 interacting protein 3 like/NIP3-like protein X)介導的線粒體自噬。近些年的研究表明，PINK1、Parkin以及泛素協(xié)同調(diào)控線粒體自噬對于線粒體的質(zhì)量控制及正常功能的維持起到重要作用[7-9]?，F(xiàn)就PINK1、Parkin與泛素協(xié)同調(diào)控線粒體自噬的研究進展予以綜述。

1 PINK1、Parkin及泛素的結(jié)構(gòu)和功能

PINK1、Parkin及泛素是線粒體自噬中的關(guān)鍵作用因子，在線粒體自噬的啟動及發(fā)生過程中均起到重要的作用。PINK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，由581個氨基酸組成，分為N端的線粒體定位序列、跨膜序列、絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域以及C端結(jié)構(gòu)域[10]。在正常線粒體中，線粒體的跨膜電位通過線粒體外膜轉(zhuǎn)運酶和內(nèi)膜轉(zhuǎn)運酶將PINK1轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)膜，在線粒體內(nèi)膜中，線粒體加工肽酶去除PINK1的N端線粒體靶向信號后，早老素相關(guān)菱形蛋白在PINK1疏水結(jié)構(gòu)域中的氨基酸A103和F104之間切割PINK1，產(chǎn)生分子量為52 000含有激酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)片段，并將其釋放到細胞質(zhì)中，而泛素連接酶靶向PINK1被切割后的該蛋白質(zhì)片段使其泛素化，并通過蛋白酶降解[11-12]。在受損的線粒體中，跨膜電位被破壞，線粒體外膜轉(zhuǎn)運酶和內(nèi)膜轉(zhuǎn)運酶無法正常作用，造成PINK1的轉(zhuǎn)位和降解被阻斷，使PINK1聚集在線粒體外膜表面，從而通過介導Parkin的激活及泛素磷酸化啟動線粒體自噬[13-15]。因此，PINK1在線粒體外膜的聚集也可以反映線粒體的損傷。

Parkin是一種E3泛素連接酶，它含有N端泛素樣結(jié)構(gòu)域(ubiquitin-like，UBL)、特異性Parkin結(jié)構(gòu)域(unique parkin domain，UPD)、結(jié)合E2酶的結(jié)構(gòu)域RING1、RING中間結(jié)構(gòu)域(in-between RING，IBR)、抑制性成分(repressive，REP)以及C端含催化性Cys431結(jié)構(gòu)域的RING2[16]。在正常狀態(tài)下，Parkin通過以下幾種機制以自動抑制的形式存在于細胞質(zhì)中，防止自身轉(zhuǎn)化為活性酶。Parkin的UBL拮抗RING1內(nèi)的核心α-螺旋元件，阻斷E2泛素偶聯(lián)酶的進入；REP同時與UBL結(jié)構(gòu)域和RING1對接，進一步阻斷RING1與E2泛素偶聯(lián)酶的結(jié)合位點；RING2中的Cys431殘基被UBL結(jié)構(gòu)域和RING1之間的UPD掩蓋，從而阻斷泛素與Cys431的結(jié)合[17-18]。當線粒體損傷后，Parkin的構(gòu)象發(fā)生變化，并由抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)化為有活性的E3泛素連接酶，Parkin激活后，在線粒體自噬過程中起到促進PINK1介導的泛素磷酸化、放大泛素磷酸化信號等重要作用[16,19-21]。

泛素是一種含76個氨基酸的蛋白質(zhì)，位于細胞質(zhì)中，可與其他蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基共價結(jié)合，從而產(chǎn)生不同反應(yīng)；泛素一般通過泛素系統(tǒng)進行加載和轉(zhuǎn)移組成泛素鏈而在線粒體自噬中起作用，泛素鏈的形態(tài)多樣，有線型、分支型或是混合型，不同泛素鏈產(chǎn)生的反應(yīng)不同，可以通過特定的泛素結(jié)合域來區(qū)分[18]。泛素鏈通過泛素結(jié)合域與PINK1及Parkin相互作用，可以促進線粒體外膜底物的提取，參與信號的轉(zhuǎn)導及自噬受體的募集，從而在線粒體自噬中起到正向作用[16,22-26]。

2 PINK1在線粒體自噬中的作用

PINK1目前被認為是線粒體損傷的主要探測器，當線粒體受損時，線粒體膜失去保持跨膜電位的能力，PINK1在線粒體外膜上聚集并與線粒體外膜轉(zhuǎn)運酶結(jié)合，而線粒體外膜轉(zhuǎn)運酶中的亞基Tom7進一步促進PINK1在粒體外膜的橫向釋放及聚集[27]，并避免了PINK1的降解[28]。聚集的PINK1結(jié)合泛素鏈或Parkin啟動線粒體自噬[29]，因此通過對PINK1的檢測也能反映出線粒體自噬的發(fā)生。PINK1主要通過兩種方式參與線粒體自噬。一方面，PINK1介導Parkin的磷酸化，Parkin的UBL氨基酸序列約30%與泛素相同(約50%與泛素相似)[30]；另外，UBL中的Ser65與泛素中的Ser65一致，這一特點使PINK1可以同時磷酸化UBL中的Ser65，并產(chǎn)生Ser65磷酸化的Parkin(phosphorylation of Parkin at Ser65，pSer65-Parkin)[29,31-32]。另一方面，PINK1介導泛素的磷酸化，通過納米抗體發(fā)現(xiàn)，PINK1的N端包含有不存在于其他蛋白激酶中的氨基酸序列(稱為插入序列)，PINK1中的Ser202和Ser204自動磷酸化后形成插入構(gòu)象，從而識別泛素；當泛素與PINK1結(jié)合后，會產(chǎn)生一種獨特的C端回縮構(gòu)象，這種構(gòu)象中泛素的Ser65殘基能夠更加靠近PINK1的催化中心并被其磷酸化，產(chǎn)生Ser65磷酸化的泛素(phosphorylation of ubiquitin at Ser65，pSer65-Ub)[33]。pSer65-Parkin結(jié)合pSer65-Ub能夠增強泛素鏈的組裝活性，使其能夠更加迅速地包圍受損線粒體，引起線粒體的泛素化；此外，PINK1能夠募集自噬受體至線粒體膜表面參與自噬體的形成[34-35]。

3 Parkin在線粒體自噬中的作用

Parkin在正常狀態(tài)下處于抑制形式，在線粒體受損后Parkin的E3泛素連接酶活性被激活。目前認為線粒體可以通過兩種機制激活Parkin：PINK1直接激活Parkin，當線粒體損傷后，PINK1聚集在線粒體外膜，能夠直接介導Parkin UBL中的Ser65磷酸化，UBL構(gòu)象改變，并引起REP構(gòu)象的微小變化，多次的構(gòu)象變化使Parkin被激活；泛素磷酸化介導的Parkin激活，PINK1介導泛素磷酸化并在泛素表面產(chǎn)生Parkin的結(jié)合位點[22,32]，與此同時，Parkin中的K151(UPD內(nèi))和H302、R305以及Y312(IBR與RING1結(jié)構(gòu)域內(nèi))組成泛素結(jié)合口袋，當泛素和Parkin結(jié)合后使Parkin的構(gòu)象發(fā)生改變，從而使Parkin被激活[22,25-26]。在Parkin的激活過程中，泛素能夠與RING2的Cys413結(jié)合并形成硫酯鍵，而這種形成硫酯鍵的能力被認為是監(jiān)測Parkin活性狀態(tài)的指標[16]。當Parkin被激活后，能夠?qū)⒔?jīng)過E1泛素激活酶及E2泛素偶聯(lián)酶活化的泛素轉(zhuǎn)移至線粒體外膜蛋白的賴氨酸殘基上，使其與PINK1相互作用[18]。目前認為，除了泛素，Parkin的底物還包括多種線粒體蛋白，如電壓依賴性陰離子通道、線粒體融合蛋白(mitofusin gene，Mfn)1/2、線粒體外膜轉(zhuǎn)運蛋白、線粒體動力相關(guān)蛋白、Miro 1/2和線粒體己糖激酶等[36-38]。

4 泛素在線粒體自噬中的作用

泛素在線粒體自噬中主要通過泛素鏈的形式產(chǎn)生作用，泛素鏈能夠結(jié)合線粒體膜表面蛋白，從而產(chǎn)生不同的生理作用。線粒體的泛素化是指在線粒體受損后，PINK1介導泛素和Parkin的磷酸化，并形成正反饋，引起泛素鏈在線粒體外膜表面的快速聚合，同時結(jié)合膜表面的蛋白，從而使受損線粒體被泛素鏈包繞的過程[16]。相對于Parkin，泛素鏈與底物結(jié)合的特異性更高，能夠結(jié)合特定的自噬受體，從而介導線粒體自噬，但目前對于泛素鏈和線粒體膜表面底物特異性結(jié)合的研究較少。線粒體泛素鏈連接類型的定量分析表明，PINK1-Parkin線粒體自噬過程中主要形成Lys48和Lys63連接型的泛素鏈，此外，還發(fā)現(xiàn)了大量非典型的泛素鏈，包括Lys6和Lys11連接型的泛素鏈；Parkin與Lys48連接型的泛素鏈相互作用，可以促進線粒體外膜的底物提取和蛋白酶體降解，從而在線粒體自噬中發(fā)揮正向作用，而Lys63連接型的泛素鏈通過募集自噬受體在PINK1-Parkin依賴性線粒體自噬中起作用[18]。用精氨酸替代泛素鏈中的Lys6或Lys63會降低線粒體自噬水平[35,39]，表明在線粒體自噬中Lys63類型的泛素鏈起到更重要的作用。同時，磷酸化的泛素可以募集unc-51樣自噬激活激酶1(unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)、DFCP1(double FYVE domain-containing protein)、WD重復(fù)域磷酸肌醇結(jié)合蛋白1(WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 1，WIPI1)和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)至線粒體膜上，促進線粒體自噬[9]。

5 PINK1、Parkin協(xié)同泛素調(diào)控線粒體自噬的發(fā)生

線粒體損傷后引起線粒體外膜上PINK1堆積，介導Parkin及泛素的磷酸化，通過正反饋過程，使線粒體泛素化，并募集自噬受體至線粒體外膜進一步形成自噬體，自噬體與溶酶體融合導致自噬體內(nèi)容物的降解[9,11,14,16]。在線粒體自噬過程中，PINK1、Parkin及泛素既能獨立作用，又可以相互作用影響線粒體自噬的發(fā)生、發(fā)展。

有研究認為，泛素的Ser65被PINK1磷酸化不僅是線粒體自噬的關(guān)鍵因素，也是Parkin被激活的一種重要機制[16]。除此之外，PINK1還能磷酸化Mfn2，并使Mfn2作為心肌細胞內(nèi)Parkin的線粒體膜受體[40]。Mfn1和Mfn2在PINK1及Parkin激活后迅速降解，從而防止受損線粒體與正常線粒體融合，在缺乏Mfn1和Mfn2小鼠的胚胎成纖維細胞中，仍然可以觀察到Parkin向線粒體轉(zhuǎn)位，表明存在一種替代或補償機制用于募集Parkin[41]。而線粒體外膜上PINK1的穩(wěn)定表達可以募集Parkin并誘導線粒體自噬的發(fā)生[13]。這些結(jié)果都說明PINK1在Parkin的上游起作用。當PINK1在線粒體膜表面缺失時，只有1%的野生型細胞還存在線粒體自噬活動，而使用雷帕霉素誘導PINK1至線粒體后，線粒體自噬的水平增加了約7倍[16]。除了協(xié)同Parkin介導的線粒體自噬外，PINK1還具有其他功能，包括介導腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白1的磷酸化以防止細胞凋亡[42]。

Parkin通過泛素化以及對Mfn1和Mfn2的降解促進線粒體分裂，進而導致線粒體自噬增加，還通過標記線粒體轉(zhuǎn)運蛋白Miro使Miro降解來進一步促進受損線粒體的分離[43]。Parkin的表達增加會顯著增加細胞中線粒體自噬的水平，在Parkin剔除的細胞中，PINK1能通過磷酸化泛素恢復(fù)線粒體自噬的發(fā)生，但雷帕霉素無法增強Parkin剔除細胞線粒體的自噬作用[17,32,44]；Parkin剔除的小鼠雖然會有Parkin非依賴性線粒體自噬的補償作用，但其心肌細胞的線粒體失去正常的組織形態(tài)，同時伴有或不伴有線粒體功能障礙[45-46]；Parkin的剔除在果蠅的心臟中也會造成線粒體自噬的缺陷，從而引起顯著的收縮功能障礙[47]。此外，研究表明，p53通過隔離細胞質(zhì)中的Parkin抑制線粒體自噬，而在線粒體外膜上Bcl-2家族蛋白通過抑制Parkin轉(zhuǎn)位至線粒體膜表面來抑制線粒體自噬[48]。這些也都表明了Parkin在線粒體自噬中的重要作用。

泛素鏈的組成對于線粒體自噬是必需的，通過調(diào)控泛素鏈的合成，可以調(diào)控線粒體自噬的水平。在泛素化過程中，pSer65-Ub與pSer65-Parkin結(jié)合能夠達到泛素鏈組裝的最大活性，約是與Parkin結(jié)合的20倍，比泛素與Parkin結(jié)合的泛素鏈合成活性高出約4 400倍[13,29,31]。Parkin-pSer65-Ub復(fù)合物形成的關(guān)鍵是Parkin中的殘基簇(Lys151和His302)與pSer65-Ub中磷酸的結(jié)合，使Parkin與泛素能夠相互作用[23,25-26]。這種復(fù)合物的形成使Parkin的泛素連接酶活性增加了約1 000倍，從而促成線粒體外膜上的泛素鏈組裝，并且極大地增加了PINK1磷酸化Parkin的UBL結(jié)構(gòu)域的速度[9]。泛素特異性蛋白酶30(ubiquitin-specific protease 30，USP30)是一種去泛素化酶，能夠去除線粒體外膜Parkin結(jié)合的泛素鏈，減少線粒體外膜對Parkin的募集，從而抑制線粒體自噬的發(fā)生[49-50]。而Parkin靶向USP30并促進其蛋白酶體的降解，可能是為了消除USP30在Parkin依賴性線粒體泛素化過程中的負向作用[51]。但USP30在Parkin或PINK1功能降低的細胞中能夠增強線粒體自噬的水平，其具體機制尚不清楚[52]。

線粒體泛素化后，PINK1、Parkin協(xié)同泛素鏈募集自噬受體至線粒體外膜上，從而促進自噬體形成并包圍受損線粒體，自噬體與溶酶體融合并將受損線粒體降解為氨基酸等小物質(zhì)分子回收利用[9,11,16,48]。目前發(fā)現(xiàn)主要有5個自噬受體在PINK1-Parkin依賴性線粒體自噬中起作用，包括NBR1(neighbor of BRCA1 gene 1)、OPTN(optineurin)、NDP52(nuclear protein database 52)、TAX1BP1(Tax1-binding protein 1)以及SQSTM1(sequestosome 1)/p62[26]。自噬受體被募集至線粒體后，通過UBD與泛素結(jié)合，同時通過LC3相互作用區(qū)域與LC3/γ-氨基丁酸及其A型受體相關(guān)蛋白結(jié)合，以促進受損線粒體被自噬體吞噬[53]。在NBR1、OPTN、NDP52、TAX1BP1以及SQSTM1/p62這5種自噬性受體中，OPTN和NDP52是主要的受體，可以有效地結(jié)合到Lys63泛素鏈上[26-27]。有研究表明，OPTN優(yōu)先與pSer65-Ub結(jié)合，在Parkin剔除的細胞中，NBR1、TAX1BP1以及SQSTM1/p62均無法被募集至線粒體膜表面，而通過PINK1的磷酸化及泛素鏈的泛素結(jié)合域可以募集OPTN和NDP52以進行線粒體自噬，但PINK1剔除后，自噬受體的募集明顯受到抑制[9]。這些均表明，PINK1、Parkin及泛素在自噬受體的募集過程中也扮演著重要的角色。

6 小 結(jié)

PINK1除了起到線粒體損傷傳感器的作用外，還能介導Parkin及泛素的磷酸化，此外，在自噬受體的募集中PINK1也不可缺少。Parkin除了放大PINK1磷酸化泛素的信號，同樣也可以募集泛素至線粒體表面。泛素能夠組成多種泛素鏈，包繞受損線粒體使其泛素化，并結(jié)合自噬受體至線粒體表面形成自噬體。除Parkin外，PINK1能否激活其他泛素連接酶目前尚不可知，而泛素鏈類型和自噬性受體識別間存在的特異性也未知。另外，其他線粒體質(zhì)量控制途徑與PINK1及Parkin的相互作用方式也不明確。因此，雖然線粒體自噬對于線粒體的氧化磷酸化功能至關(guān)重要，但仍需進一步研究。