瞿曉梅，國大亮，劉洋，趙宇，劉玉璇

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，天津 300112)

美國哥倫比亞大學(xué)的Karl Meyer和John W.Palmer于1934年最先從牛眼玻璃體(hyaloid)中提取分離出透明質(zhì)酸，由于其基本結(jié)構(gòu)為糖醛酸(uronic acid)，因此命名為透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)。1937年Kendall等又從細(xì)菌體中提取得到了透明質(zhì)酸。隨著有關(guān)HA的研究逐漸深入，人們發(fā)現(xiàn)HA具有良好的保濕、潤滑、促進(jìn)組織創(chuàng)傷愈合等生理學(xué)功能，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、美容等多個(gè)領(lǐng)域。作為具有較高商業(yè)價(jià)值的醫(yī)藥、化妝品的重要組成部分，HA的工業(yè)化制備一直是人們的研究重點(diǎn)。HA的制備方法有組織提取法、發(fā)酵法和化學(xué)合成法等，但目前HA的大規(guī)模生產(chǎn)仍以動(dòng)物組織提取和微生物發(fā)酵為主，對(duì)化學(xué)合成方法的研究較少。本文對(duì)HA制備方法的發(fā)展歷程及近期研究熱點(diǎn)、常用的檢測(cè)HA分子量的方法進(jìn)行綜述，希望對(duì)透明質(zhì)酸產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展提供幫助。

1 組織提取法

組織提取法一般來源于動(dòng)物組織，提取工藝由勻漿、提取、沉淀和除雜幾步組成，工藝流程簡單，但研磨、酸處理和有機(jī)溶劑重復(fù)萃取等苛刻的萃取條件也導(dǎo)致了該方法存在技術(shù)局限性，且通過動(dòng)物組織提取得到的HA往往容易含有病菌或影響免疫應(yīng)答[1]。由于這些技術(shù)和安全問題以及較高的生產(chǎn)成本，在工業(yè)化生產(chǎn)中組織提取法逐漸被發(fā)酵法所取代。

李寶璋等[2]綜述了20世紀(jì)90年代之前HA的制備方法進(jìn)展，闡明了從動(dòng)物組織提取到酶工程和基因工程的演變過程。1934年，Meyer教授首次從牛眼玻璃體中提取得到HA，并在1936年改進(jìn)了純化方法。之后，人們通過對(duì)比當(dāng)時(shí)有限的提取來源發(fā)現(xiàn)人臍帶HA含量最高，最適用作HA的原料，并從中獲得了高黏度的HA。20世紀(jì)40年代有學(xué)者通過改變提取劑提高所得HA的純度，并發(fā)現(xiàn)了加鹽可使HA的黏度明顯下降。到了20世紀(jì)50年代，關(guān)于HA提取工藝的研究顯著增多，多數(shù)集中于探索使用不同沉淀劑從人臍帶中提取HA。1960年，GV St-aponor通過對(duì)前人方法進(jìn)行總結(jié)，得出完整的一條從臍帶中得到HA的路線。20世紀(jì)60年代，提取原料不再局限于人臍帶，有學(xué)者從人體滑液和豬氣管中成功分離出高純度HA，并開始使用電泳法、酶解法等分離方法。1973年，Lee Sheng-San改進(jìn)工藝，選用低濃度鹽較好地分離開HA與硫酸軟骨素等糖胺聚糖類物質(zhì)。1980年之后，經(jīng)過國內(nèi)外學(xué)者不斷探索，已經(jīng)形成了完整的從人臍帶、玻璃體或雞冠中提取HA的制備工藝，方法趨于完善。從20世紀(jì)80年代到21世紀(jì)初，最常用的組織提取原料有雞冠、人臍帶和牛、羊等動(dòng)物的玻璃體，但這些原料來源有限、成本高，于是近年來一些學(xué)者致力于研究從畜牧業(yè)、漁業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢棄物，如魚眼、雞蛋殼膜中提取HA，為HA的綠色工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)基礎(chǔ)。

易喻等[3]以金槍魚眼為原料，通過比較酶解法、醇沉法、CPC法除蛋白效率，確定了金槍魚眼提取HA的工藝路線，并對(duì)CPC法純化透明質(zhì)酸的工藝進(jìn)行優(yōu)化，著重于CPC反應(yīng)時(shí)鹽離子濃度對(duì)HA和CPC的絡(luò)合以及HA-CPC絡(luò)合物解離的影響。于?；鄣萚4]研究了酶解法從大鯢體表黏液中提取HA的最佳工藝條件，使大鯢黏液成了HA的潛在來源之一。朱文婷等[5]對(duì)酶解法提取雞蛋殼膜中HA的工藝進(jìn)行優(yōu)化，考察了殼膜預(yù)處理過程對(duì)HA提取的影響，結(jié)果表明熱處理和加NaCl處理有利于HA提取和減少雜質(zhì)含量；確定了從蛋殼膜中提取HA的最佳工藝條件。除魚眼、大鯢黏液、雞蛋殼膜之外，有學(xué)者從高原鼢鼠組織、林蛙皮等材料中提取得到了HA。

2 發(fā)酵法

發(fā)酵法是由細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生HA，與提取法相比，該法不受來源的限制，產(chǎn)量高、成本低，無動(dòng)物來源的致病病毒的感染，但該法設(shè)備要求高、前期投入大、分離難度高[6]且鏈球菌等部分細(xì)菌生產(chǎn)得到的HA易受細(xì)菌內(nèi)毒素污染。

Kendall等于1937年便已發(fā)現(xiàn)鏈球菌可產(chǎn)生HA。然而，早期關(guān)于鏈球菌產(chǎn)生HA的研究并不以發(fā)酵生產(chǎn)HA為目的，只是為了說明鏈球菌的這一特性及其與HA組成的莢膜與透明質(zhì)酸酶的關(guān)系等[7]。20世紀(jì)80年代初，日本資生堂首次建立了以獸疫鏈球菌為原株，經(jīng)發(fā)酵法大量生產(chǎn)HA的技術(shù)，價(jià)格比提純法降低一半左右[8]。由于資生堂最初采用分批法制造的產(chǎn)品仍具有成本較高、產(chǎn)量有限的缺點(diǎn)，于是發(fā)展出了高收率的連續(xù)發(fā)酵法。到了20世紀(jì)90年代，我國HA的工業(yè)制備仍以動(dòng)物組織提取為主，但已有學(xué)者開始研究利用誘變選育高產(chǎn)菌株生產(chǎn)HA。2000年之后，我國關(guān)于HA制備方法的研究方向逐步由組織提取法向微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)換。早期大量關(guān)于發(fā)酵法生產(chǎn)HA的研究通過優(yōu)化發(fā)酵條件以提高HA產(chǎn)量，而近年來研究重點(diǎn)已從提高產(chǎn)量轉(zhuǎn)向提升其質(zhì)量和應(yīng)用價(jià)值。

HA發(fā)酵液常因含有一定量的蛋白質(zhì)雜質(zhì)而具有分離難度較大的問題，阻礙了醫(yī)藥級(jí)HA的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。牛全鳳等[9]確定了HA發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的最優(yōu)去除條件，將蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低了約15%，經(jīng)硅藻土處理后蛋白質(zhì)去除率高達(dá)99%以上，達(dá)到醫(yī)藥級(jí)HA標(biāo)準(zhǔn)。該研究表明酶解法可以有效地去除HA發(fā)酵液中的蛋白雜質(zhì)。

鏈球菌是一種潛在病原體，生產(chǎn)HA的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌內(nèi)毒素，限制了HA的應(yīng)用。出于安全考慮，利用重組細(xì)菌來生產(chǎn)HA成了一種正在探索的可行替代方法。革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均可作為宿主，包括芽孢桿菌、乳桿菌、農(nóng)桿菌、大腸桿菌[10]。Hmar等[11]通過定點(diǎn)、雙同源重組培養(yǎng)菌株VRJ2AB和VRJ3ABC將鏈球菌HA合成酶操縱子產(chǎn)生的HA合成基因整合到乳球菌的染色體中，不僅解決了重組細(xì)菌質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)不穩(wěn)定的問題，還產(chǎn)生了高分子量HA(3.5～4 MDa)，為重組菌株獲得高分子量HA提供了一種優(yōu)化方法。

不同分子量的HA具有不同的理化特性，高分子量的HA可用于眼科、骨科和組織工程，而低分子量HA可用于產(chǎn)生促進(jìn)血管生成、抑制腫瘤進(jìn)展或誘導(dǎo)促炎介質(zhì)表達(dá)的物質(zhì)[1]。因此分子量是評(píng)價(jià)HA功能和決定其最終應(yīng)用類型的重要參數(shù)之一，如何獲得目標(biāo)分子量的HA亟待深入研究。影響HA分子量的因素包括營養(yǎng)介質(zhì)的組成、發(fā)酵條件的物理和化學(xué)變量、兩種前體糖核苷酸的濃度以及HA合成酶[12]。高分子量HA的生產(chǎn)方法主要包括誘變篩選、改善發(fā)酵培養(yǎng)條件、異源宿主和加入不同添加劑[13]。Pourzardosht等[14]敲除透明質(zhì)酸酶基因后發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸酶基因的缺失對(duì)HA的產(chǎn)量和高分子量HA的生產(chǎn)有積極影響。而陸劍飛[15]則通過重組獸疫鏈球菌基因并對(duì)其進(jìn)行誘變篩選、優(yōu)化其發(fā)酵條件，最終獲得了能生產(chǎn)低分子量HA的優(yōu)質(zhì)工程菌株及一套高效、低成本的低分子量HA的制備方法。Wu[16]采用臭氧降解天然HA的方法制備了低分子量HA。

3 HA分子量檢測(cè)

HA為非均一性物質(zhì)，其分子量通常是多分散的，可通過確定平均分子量或表征分子量的分布來表征HA分子量，平均值的類型取決于所使用的檢測(cè)方法，不同檢測(cè)方法具有不同特點(diǎn)，其中較常用的方法有特性黏度法、電泳法、光散射結(jié)合凝膠滲透色譜法。

黏度法使用的儀器廉價(jià)、操作流程簡單、耗時(shí)短，目前國家關(guān)于HA相關(guān)產(chǎn)品的分子量的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)便采用此法測(cè)量，但該法只能測(cè)得樣品的平均黏度分子量(接近重均分子量)，且測(cè)量原理的客觀因素、烏氏黏度計(jì)的自身因素、控溫精度等均對(duì)測(cè)量結(jié)果有影響[17]。李國鳳等[18]發(fā)現(xiàn)不同內(nèi)徑的儀器測(cè)得的透明質(zhì)酸鈉分子量有差距，內(nèi)徑小的烏式黏度計(jì)測(cè)得的分子量高，內(nèi)徑大的測(cè)得的分子量低。

HA是由氨基己糖和己糖醛酸構(gòu)成的雙糖單元重復(fù)連接而成的線性多糖，不論分子量大小，其質(zhì)荷比恒定。采用電泳法測(cè)量HA分子量分布時(shí)，可通過加入適量添加劑形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以實(shí)現(xiàn)不同大小分子的分離。常用凝膠基質(zhì)作為篩選和穩(wěn)定分離的介質(zhì)，孔徑較小的凝膠可用于低聚糖和HA片段的分離，孔徑較大的凝膠可用于高分子量HA的分離。

體積排阻色譜(size exclusion chromatography，SEC)測(cè)定分子量分布時(shí)一般需要用不同分子量大小的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，但由于HA標(biāo)準(zhǔn)品或與HA具有相同黏彈特性的標(biāo)準(zhǔn)品較難得到，因此采用SEC測(cè)定HA分子量分布時(shí)一般使用結(jié)構(gòu)相近的其他多聚糖做標(biāo)準(zhǔn)品，這影響了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。Shanmuga Doss等[19]考察發(fā)現(xiàn)使用非HA為基礎(chǔ)的校準(zhǔn)和注入SEC柱的樣品濃度是導(dǎo)致的分子量估算誤差的主要因素。劉莉莉等[20]采用多角度激光光散射儀與體積排阻色譜法聯(lián)用(MALLS-GPC)建立了醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠的絕對(duì)分子量及其分布的測(cè)定方法，該法不需標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)，并可同步測(cè)定透明質(zhì)酸鈉含量，為醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠的質(zhì)量控制和應(yīng)用研究提供了科學(xué)基礎(chǔ)。

常用檢測(cè)方法均是對(duì)已有的HA成品進(jìn)行檢測(cè)，董芹[21]基于近紅外光譜分析技術(shù)建立了HA精品分子量模型和發(fā)酵液中HA含量模型，可在發(fā)酵生產(chǎn)過程中進(jìn)行測(cè)定，對(duì)實(shí)現(xiàn)HA生產(chǎn)中的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和優(yōu)化HA發(fā)酵工藝有重要意義。

目前國內(nèi)頒布有透明質(zhì)酸鈉的食品及其他工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和組織工程醫(yī)療產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)、醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠的醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，并未制定HA及相關(guān)上下游藥品的藥典標(biāo)準(zhǔn)。其中食品工業(yè)用和其他工業(yè)用(醫(yī)藥工業(yè)用除外)透明質(zhì)酸鈉要求分子量為8×104～2×106，但未規(guī)定檢測(cè)方法；外科植入和組織工程醫(yī)療用透明質(zhì)酸鈉規(guī)定采用特性黏數(shù)表征分子量，但由于產(chǎn)品用途不同，并未規(guī)定分子量標(biāo)準(zhǔn)，只要求不低于其自身規(guī)定的標(biāo)示值；醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠要求特性黏數(shù)不小于1 500 cm3·g-1。不同分子量的HA具有不同的理化特性，建議對(duì)HA分子量的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定根據(jù)其具體使用類型進(jìn)行細(xì)分，以實(shí)現(xiàn)HA行業(yè)質(zhì)量的提升，更好地與國際接軌。因此對(duì)HA分子量測(cè)定方法的研究還有待繼續(xù)深入，以建立一種方便快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)HA分子量的方法，這將對(duì)HA制備工藝的優(yōu)化有指導(dǎo)意義。

4 展望

HA的制備方法主要有組織提取法和發(fā)酵法。發(fā)酵法制備HA產(chǎn)量較高，逐漸在HA的工業(yè)化生產(chǎn)中占主導(dǎo)地位。其目前難點(diǎn)在于產(chǎn)生的HA分子量難以掌握，且易受細(xì)菌內(nèi)毒素污染，影響了HA的進(jìn)一步應(yīng)用。有關(guān)發(fā)酵法的研究已由提高HA產(chǎn)量轉(zhuǎn)向生產(chǎn)出符合人們不同需求的特定分子量的HA。通過基因工程對(duì)菌株進(jìn)行重組改造和誘變篩選以獲得能生產(chǎn)目標(biāo)分子量HA的優(yōu)質(zhì)工程菌株將成為未來發(fā)展方向之一。

提取法最初以牛眼玻璃體、人臍帶和雞冠等為原料，這些原料來源不穩(wěn)定且成本較高，限制了HA的產(chǎn)量。近年來有關(guān)提取法的研究側(cè)重于探索從畜牧業(yè)、漁業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢棄物里提取HA，為HA的綠色生產(chǎn)拓展原料市場(chǎng)。我國是畜牧業(yè)、漁業(yè)大國，如魚頭、魚眼、蛋殼膜等常因無法綜合利用而作為垃圾處理。以這些廢棄物為原料提取HA，不僅可以降低HA的提取成本、滿足市場(chǎng)需求，又可避免污染環(huán)境、節(jié)約資源，并能為一些低附加值的產(chǎn)業(yè)提供更多選擇、實(shí)現(xiàn)價(jià)值提升。因此提取法生產(chǎn)HA的產(chǎn)量雖低于發(fā)酵法，但若完全拋棄該制備方法將造成大量的資源浪費(fèi)。相關(guān)行業(yè)應(yīng)加大該方面的研究投入，實(shí)現(xiàn)廢棄物的科學(xué)綜合利用和行業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)；政府有關(guān)部門應(yīng)與相關(guān)行業(yè)密切配合，加大政策扶持力度，著力于推進(jìn)廢棄物循環(huán)利用提取HA的工業(yè)化，以實(shí)現(xiàn)降低HA成本、環(huán)保和行業(yè)可持續(xù)發(fā)展多重目的，帶來較大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。