郭蕊，王冰清，王悅，章慶國

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院整形四科，北京 100144)

脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)由Zuk等[1]于2001年首次通過免疫熒光技術(shù)和流式細胞技術(shù)從脂肪組織中分離并提取出來，是一類能夠自我更新、具有多向分化潛能的成體間充質(zhì)干細胞。300 mL脂肪組織中可獲得(2～3)×108個ADSCs，較骨髓來源的間充質(zhì)干細胞多100～1 000倍[2]。人體脂肪組織具有含量高、來源廣、取材容易、干細胞含量高、易于分離純化、切取后對供區(qū)損傷小、能自體移植且倫理問題少等優(yōu)點。ADSCs具有增殖速度快、多項分化潛能、免疫調(diào)節(jié)作用、新生血管生成和修復(fù)機制等特點，非常適合臨床應(yīng)用。再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，特別是ADSCs、骨髓間充質(zhì)干細胞及臍帶間充質(zhì)干細胞等的發(fā)現(xiàn)，為將自體干細胞移植作為再生療法的應(yīng)用創(chuàng)造了更多機會[3]。除減少皺紋形成和補充軟組織容量外，ADSCs及其治療可能是抵抗衰老的又一研究方向。自2008起，ADSCs不僅在體外顯示出生物細胞的再生潛力，在臨床病例中也可顯著改善皮膚質(zhì)量[4]。衰老是人體自然衰變的過程，皮膚老化是其外部表現(xiàn)，分為自然老化與光老化，可表現(xiàn)為皮膚失去彈性、皺紋形成、皮脂腺汗腺分泌減少、膠原合成減少、皮膚中活性氧自由基沉積等[5]，這一過程主要由內(nèi)在因素(基因、激素)和外在因素(紫外線、吸煙)造成[6]。而隨著生活水平的提高，人們對美的追求也隨之提高。其中，面部抗衰老分為預(yù)防性延緩衰老和治療性改善衰老，后者稱為“年輕化”。目前，隨著再生醫(yī)學(xué)在臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的加速，許多再生醫(yī)學(xué)技術(shù)，如ADSCs、富血小板血漿和自體成纖維細胞等在面部年輕化的治療方面取得了良好療效，包括改善黑眼圈、頰袋及輔助重瞼術(shù)[7]?，F(xiàn)就ADSCs在面部年輕化中的研究進展予以綜述。

1 ADSCs的生理特性

ADSCs具有異質(zhì)性，其形態(tài)類似于成纖維細胞，由一個大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞核組成。目前雖尚未能鑒定出其具有的特殊標記，但其表達的抗原與骨髓間充質(zhì)干細胞類似，如CD10、CD13、CD29、CD34、CD44、CD54、CD71、CD49B、CD90、CD105、CD117和STRO-1。同時，ADSCs在脂肪組織中的位置也難以確定。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)ADSCs位于血管周圍，但不表達造血標志物，如CD14、CD16、CD31、CD45、CD56、CD61、CD62E、CD104、CD106、CD144，以及內(nèi)皮細胞標志物(CD31、CD144和血管假性血友病因子)[8-10]。此外，ADSCs也是免疫原性降低的特許細胞，即無人類白細胞DR抗原的表達[11]。

在適當條件下，ADSCs也可分化為軟骨細胞、心肌細胞、成骨細胞、神經(jīng)元細胞、成纖維細胞以及上皮細胞等。特別是某些生長因子可作用于ADSCs，使其刺激周圍細胞，分化為特定細胞[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs對皮膚表皮干細胞的激活是必需的[15]，且外源性給予ADSCs也可動員其他干細胞，如毛囊隆起區(qū)域的表皮干細胞，此激活作用是基于各種生長因子的分泌，如表皮生長因子、成纖維細胞生長因子-β、肝細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質(zhì)細胞衍生因子-1α和多種細胞因子[白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8、IL-11、IL-12和TGF-α][9,12，14]。同時，上述生長因子也可控制ADSCs周邊細胞的生存、凋亡，促進血管生成，增生遷移成纖維細胞，合成膠原蛋白，從而有效保護真皮內(nèi)成纖維細胞，減少紫外線及化學(xué)因素等引起的氧自由基[16-17]。

2 ADSCs在面部年輕化中的作用機制

面部年輕化是面部美學(xué)中迅速發(fā)展的一個領(lǐng)域，主要目的是糾正衰老容顏所呈現(xiàn)的組織松弛、移位。除通過手術(shù)或非手術(shù)等方法補充面部丟失的體積，撫平皺紋，改善色素沉著和毛孔粗大等外，人們更希望能從根本上修復(fù)和替換有病變和缺陷的細胞或組織，而ADSCs可能在其中發(fā)揮重要作用。在動物實驗中，研究發(fā)現(xiàn)將ADSCs注射于無毛小鼠背部皮下后，皮膚組織中的CD31、周細胞神經(jīng)元-膠質(zhì)抗原2含量增加，表明血管生成較前增加，證實ADSCs具有抗衰老作用。同時還觀察到，小鼠背部皮膚的真皮層厚度增加，成纖維細胞的數(shù)量以及Ⅰ型膠原蛋白的合成增多[18-19]。Xie等[20]發(fā)現(xiàn)，過表達VEGF的ADSCs不僅可促進與ADSCs自身相關(guān)的衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶、p21和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)1表達下調(diào)，促進紫外線照射后損傷創(chuàng)面的愈合及上調(diào)成纖維細胞和創(chuàng)面中Ⅰ型膠原蛋白的表達，還可抑制由紫外線損傷造成的成纖維細胞的細胞周期停滯，防止紫外線照射引起皮膚光老化。

目前，在ADSCs促進衰老皮膚血管新生方面存在兩大不同學(xué)說：①ADSCs通過分泌一些細胞生長因子(VEGF、肝細胞生長因子等)促進血管新生；②可直接分化為血管內(nèi)皮細胞發(fā)揮作用，但具體機制尚未闡明[21]。

為了逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激，ADSCs能減少與凋亡相關(guān)成纖維細胞的凋亡，而抗氧化劑可抑制氧化反應(yīng)，減少黑色素形成，發(fā)揮美白效應(yīng)[22]。研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs可分泌TGF-β，TGF-β能抑制黑色素瘤細胞產(chǎn)生黑色素酶，降低酪氨酸酶活性，從而減少黑色素生成，且IL-6在抑制黑色素細胞中起關(guān)鍵作用，從而驗證了ADSCs具有美白效應(yīng)[23-24]。

已知過量的紫外線輻射可損傷皮膚角質(zhì)層，降低皮膚原本的屏障功能，造成其脫水干燥。同時紫外線也能穿透皮膚，改變細胞結(jié)構(gòu)，深入真皮層，通過增加真皮細胞內(nèi)MMP-2和MMP-13的表達，使細胞外基質(zhì)降解，引起組織損傷和膠原蛋白變性，形成皺紋[25]。研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs可抑制紫外線誘導(dǎo)的MMP-2、MMP-13過表達和多種炎癥因子的釋放，并增加Ⅰ型膠原蛋白的生成[26]。同時，ADSCs也可通過調(diào)節(jié)TGF-β2的表達，在細胞和結(jié)構(gòu)水平上恢復(fù)皮膚屏障功能，增強毛囊干細胞的活性，預(yù)防并改善光老化造成的皺紋[26]。

3 ADSCs在面部年輕化中的應(yīng)用

3.1ADSCs單純注射 目前，已有學(xué)者將ADSCs應(yīng)用于面部年輕化中，通過抽取脂肪組織，優(yōu)良制造標準實驗室分離培養(yǎng)ADSCs后，將在體外培養(yǎng)的ADSCs以1×106/mL的細胞濃度注入患者皺紋處的真皮淺層內(nèi)，如頸紋、鼻唇溝、魚尾紋和眉間紋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)皺紋較前明顯減輕[27]。同時組織學(xué)發(fā)現(xiàn)，接受ADSCs注射患者的皮膚真皮層厚度、膠原纖維及毛細血管增加[28]。動物實驗中，Jeong等[29]將BALB/c裸鼠暴露于紫外線-B輻射下誘導(dǎo)光老化皺紋，然后將從人體組織中分離并培養(yǎng)的ADSCs和成纖維細胞(對照組)注射于皺紋內(nèi)，均觀察到皺紋明顯減少。同時他們發(fā)現(xiàn)，ADSCs可刺激表達更多的膠原蛋白并減少MMP，雖然成纖維細胞較ADSCs可刺激更多的膠原蛋白表達，但同時也增加了MMP。以上結(jié)果表明，ADSCs移植不僅可改善面部輪廓，同時因其含有多種活性成分，并具有多種分化潛能，故能根據(jù)組織需要自身分化并激活成纖維細胞等，刺激膠原蛋白合成，改善皮膚光澤度，修復(fù)受損肌膚達到抗皺效果。

3.2ADSCs輔助脂肪移植 近年來，脂肪填充技術(shù)已廣泛應(yīng)用于面部填充和面部年輕化。目前認為，面部除皺術(shù)和脂肪填充幾乎密不可分。除皺在于解決面部下垂，脂肪填充則關(guān)注于容積的減少。臨床上在未使用ADSCs聯(lián)合脂肪移植前，各學(xué)者主要通過單純移植自體脂肪填充軟組織。自體脂肪移植面部年輕化是將身體其他部位的脂肪組織，如大腿、臀部或腹部等，通過負壓吸引技術(shù)獲得脂肪顆粒，然后經(jīng)過漂洗、過濾或離心等處理后再填充至皺紋或溝壑處。因其沒有排斥反應(yīng)，移植后組織質(zhì)地柔軟且存活后可以長期存在，所以廣受歡迎。但移植后組織的血管重建在移植48 h后，在此期間，由于成熟脂肪細胞極易受局部組織創(chuàng)傷和缺血缺氧等影響，導(dǎo)致存活率較低，手術(shù)失敗——這也解釋了移植后有20%～70%的可能出現(xiàn)脂肪組織體積減小[30-31]。目前，對于脂肪移植及ADSCs在整形外科中的應(yīng)用，提出最多的為復(fù)合移植，即自體細胞輔助脂肪移植技術(shù)。該技術(shù)通過將ADSCs與脂肪細胞混合后注射移植。此操作可使移植后的脂肪細胞存活率平均提高35%[32]。Harris等[33]證實，在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后的ADSCs具有內(nèi)皮表型的功能，可刺激新生血管生成，顯著減少早期組織壞死，從而更好地保留移植物體積。在新移植的脂肪組織中，Eto等[34]描述了三個區(qū)域：中心壞死區(qū)、中間再生區(qū)和外部存活區(qū)。移植后的第1天，中心壞死區(qū)域內(nèi)成熟脂肪細胞因缺血而退化壞死，巨噬細胞和多核中性粒細胞聚集并吞噬細胞碎片。而在中間和外部區(qū)域內(nèi)的ADSCs則維持其活力，通過增殖分化，替換壞死區(qū)內(nèi)的脂肪細胞并開始血運重建。血管生成從移植物周邊開始，隨后新形成的血管使整個移植物血管化[35]。ADSCs不僅可以顯著改善組織血運重建、生存率和手術(shù)效果，還能減少脂肪移植后纖維化、囊腫形成和鈣化，同時對膚色也有改善作用[36]。

移植后的ADSCs較普通脂肪組織耐受缺氧能力更強，Mylotte等[37]發(fā)現(xiàn)，ADSCs在缺氧情況下可聚集在血管周圍，釋放胰島素樣生長因子1、VEGF等多種細胞因子；既促進了血管在脂肪組織內(nèi)的再生，也可提高脂肪組織的缺氧耐受力，減少凋亡[38-40]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)體外培養(yǎng)相比，低氧培養(yǎng)可提高ADSCs的增殖能力、多能性和分化能力，且低氧主要通過低氧誘導(dǎo)因子-1α、堿性成纖維細胞生長因子和VEGF的相互作用促進ADSCs的增殖，并促進其變?yōu)橛字蔂顟B(tài)的誘導(dǎo)性多能干細胞[41]。然而有證據(jù)表明，ADSCs的相關(guān)治療作用由其衍生的細胞外囊泡介導(dǎo)，且缺氧條件可顯著增加細胞外囊泡誘導(dǎo)血管內(nèi)皮形成的能力[42]。

Yoshimura等[43]于2010年首次將從吸脂抽吸物中獲得并提取的富含ADSCs的血管基質(zhì)成分，添入待移植的顆粒脂肪組織內(nèi)，從而使脂肪移植獲得穩(wěn)定的治療效果。Park等[44]將含有純化ADSCs的脂肪細胞移植于面部除皺患者，2個月后可見皮膚紋理及真皮層厚度具有明顯改變。田雅光等[7]對單純接受面部小切口除皺術(shù)和手術(shù)聯(lián)合ADSCs行面部年輕化治療的患者進行隨訪，隨訪3～15個月后發(fā)現(xiàn)，兩種術(shù)式的除皺效果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但聯(lián)合ADSCs治療能更明顯改善皮膚毛孔和斑點。

3.3ADSCs聯(lián)合透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)注射 在軟組織填充方面，已知HA是一種天然高分子多糖，作為細胞基質(zhì)成分，其不具有抗原性、致敏性等，是目前應(yīng)用最廣的軟組織填充劑。動物實驗發(fā)現(xiàn)，與單純注射ADSCs及HA相比，ADSCs聯(lián)合HA注射于裸鼠背部皮下可產(chǎn)生新生軟組織；且Masson三色染色發(fā)現(xiàn)，注射ADSCs聯(lián)合HA較單純注射ADSCs新生膠原蛋白排列規(guī)律，故推斷ADSCs在體內(nèi)的分泌分化與局部HA有關(guān)[45]。臨床應(yīng)用方面，高倩倩等[46]將ADSCs聯(lián)合HA通過水光針注射方式，注入皮膚真皮層內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單純注射HA相比，ADSCs聯(lián)合HA注射治療3個月后，患者面部皮膚在斑點、皺紋、皮膚紋理、紫外線色斑等方面的改善更明顯，表明ADSCs聯(lián)合HA注射能更好地改善皮膚老化。同時，由于此方式僅局限于真皮層，對機體的正常組織結(jié)構(gòu)創(chuàng)傷小，并發(fā)癥少，故被更多人接受。

4 ADSCs應(yīng)用于臨床存在的問題

ADSCs已被證實具有抑制細胞衰老、修復(fù)損傷、促進再生等多種抗衰老的生物學(xué)性能，且其取材容易、組織損傷小、體內(nèi)含量多，同時可在離體環(huán)境下穩(wěn)定增殖。因此，ADSCs已成為面部年輕化領(lǐng)域研究的熱點，但仍存在一些問題亟待解決。

目前，在ADSCs使用劑量方面尚無統(tǒng)一標準。但有研究發(fā)現(xiàn)，高劑量注射效果優(yōu)于低劑量效果[17-18]。Kim等[18]發(fā)現(xiàn)，5×105個細胞的注射效果優(yōu)于1×105個細胞。動物實驗發(fā)現(xiàn)，與注射1×105個ADSCs治療光老化皮膚相比，1×104和1×105個細胞不僅可增加真皮層厚度，還可增加膠原蛋白含量，并可觀察到表皮皺紋改變[17]。同時，在提取方法上，目前尚無統(tǒng)一標準。但應(yīng)注意提取方法會影響ADSCs的質(zhì)和量[47]。另有研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs在體外培養(yǎng)可能出現(xiàn)染色體畸變，促進惡變細胞生長[3]。由于ADSCs是祖細胞，所以既往有腫瘤病史可能是應(yīng)用ADSCs的禁忌證。已有研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs與小鼠前列腺癌細胞聯(lián)合注射促進了腫瘤進展[48]。而另一項關(guān)于乳腺癌模型的研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs能加快活性腫瘤細胞(非靜止期腫瘤細胞)的增殖，表明只有在沒有活動性疾病的證據(jù)時才應(yīng)進行ADSCs治療[49]。因此，若將多能干細胞植入已知有致癌風(fēng)險的部位，可能會出現(xiàn)細胞轉(zhuǎn)化。此外，進入人體內(nèi)的ADSCs，能否繼續(xù)發(fā)揮旁分泌功能，抵抗衰老，其如何按需調(diào)控其分泌的細胞因子的種類和濃度，仍需進一步試驗驗證。

然而，ADCSc應(yīng)用于臨床的并發(fā)癥尚不清楚，可能存在一些類似于脂肪移植的并發(fā)癥，如液化壞死、紅腫、刺痛、體積丟失等[50]。有文獻報道，補充ADSCs的脂肪移植物可導(dǎo)致長達4周的皮下出血和腫脹[51]。

5 小 結(jié)

隨著生活物質(zhì)水平的提高，人們對面部抗衰老的需求日益增加，且各類面部年輕化手術(shù)具有創(chuàng)傷極小、手術(shù)時間短、恢復(fù)快、療效顯著的特點。而探索ADSCs于面部抗衰老中的臨床應(yīng)用，可在極大提高患者認可度的同時，降低醫(yī)師操作的復(fù)雜性。此外，ADSCs可以從脂肪組織中提取，其含量豐富并具有多向分化能力，因此在軟組織的修復(fù)和再生方面具有巨大應(yīng)用前景。目前雖然歐洲、亞洲等已發(fā)表了成功使用ADSCs及其衍生產(chǎn)品治療面部衰老的病例報道，但仍有必要在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床環(huán)境中進一步研究ADSCs，以確保其以安全有效的方式進行治療。與多種傳統(tǒng)治療方案相比，對ADSCs移植后結(jié)果的可預(yù)測性、移植物存活率、操作簡便性、成本和美觀效果等指標的長期研究也有必要，以增加ADSCs的推薦等級。未來相信隨著ADSCs的提取和使用技術(shù)的逐漸成熟，其在面部年輕化領(lǐng)域?qū)⒕哂懈玫膽?yīng)用前景。