袁海銘，何永文

(昆明醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，昆明 650106)

我國惡性腫瘤的病死率在世界上處于較高水平[1]，每年新發(fā)癌癥病例達429萬例，死亡281萬例[2]，嚴重威脅人類的健康。目前手術切除及放化療作為傳統(tǒng)的腫瘤治療方法，雖能延長患者的生命，但也存在較大不足。在腫瘤進展過程中，腫瘤免疫逃逸是其生存的主要原因之一，可通過各種機制避免免疫系統(tǒng)的識別和攻擊[3]。腫瘤免疫逃逸的機制主要包括下調(diào)相關抗原表達、抵抗細胞介導的裂解作用以及免疫抑制分子的表達等。隨著“種子和土壤”學說的提出，腫瘤免疫逃逸受腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)調(diào)控的觀點被廣泛接受，成為近年來的研究熱點。TME中的細胞成分和物理因素的改變可導致免疫抑制狀態(tài)形成。與正常組織中的成纖維細胞相比，作為大多數(shù)實體瘤TME的重要組成成分，癌相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)處于活化狀態(tài)，由于表型和功能的改變使得CAFs可調(diào)控TME中先天和獲得性免疫反應以及腫瘤自身的免疫反應，因此CAFs是介導TME免疫抑制狀態(tài)形成的重要原因之一。通過研究CAFs介導的免疫抑制機制，能夠更好地了解腫瘤的生長環(huán)境，以期為腫瘤治療尋找新的靶點?，F(xiàn)就CAFs介導TME免疫抑制作用的研究進展予以綜述。

1 TME與CAFs

TME于1889年被首次提出[4]，包含細胞外基質、成纖維細胞、免疫細胞、脂肪細胞、上皮細胞、神經(jīng)膠質細胞、血管與淋巴管內(nèi)皮細胞以及周細胞等[5-6]。TME參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉移的整個過程[7]。

與正常成纖維細胞相比，TME中的成纖維細胞處于活化狀態(tài)，表現(xiàn)出與肌成纖維細胞相似的特征，稱為CAFs[8-9]。在TME中活化的CAFs是具有不同起源的異質細胞群體，骨髓來源的成纖維細胞和局部浸潤的成纖維細胞被認為是CAFs的來源，內(nèi)皮細胞或腫瘤細胞本身也被認為能在特定條件下轉變?yōu)镃AFs[9-11]，其他如間充質干細胞、周細胞、脂肪細胞以及內(nèi)皮細胞也有轉變?yōu)镃AFs的功能[11]?？筛鶕?jù)CAFs的形態(tài)和特定的標志加以鑒別，CAFs通常表現(xiàn)為類似于平滑肌細胞的大型紡錘形細胞[12]，α-平滑肌肌動蛋白被認為是鑒別CAFs應用最廣泛的生物學標志[13]，而成纖維活化蛋白(fibroblast activation protein，F(xiàn)AP)由活化的成纖維細胞在多種類型的上皮癌中表達[14]。此外，還有成纖維細胞特異性蛋白-1以及血小板衍生生長因子受體在CAFs中特異性表達[15]。

CAFs是TME的重要組成部分，通過分泌多種生長因子、細胞因子和蛋白酶等已知腫瘤進展的關鍵效應因子，促進癌細胞的生長、侵襲和血管生成。CAFs可通過重塑細胞外基質、誘導腫瘤血管生成以及介導腫瘤炎癥反應，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究顯示，CAFs通過在TME中分泌免疫抑制相關細胞因子等相關介質，參與抗腫瘤免疫應答，作為影響TME免疫狀態(tài)的重要參與者，CAFs通過多種途徑促進腫瘤的免疫逃逸，包括分泌多種細胞因子和趨化因子、與TME中的其他細胞相互作用，這些相互作用介導先天和獲得性免疫細胞的募集和功能分化以及對腫瘤細胞本身的免疫調(diào)控[16-17]。

2 CAFs調(diào)控TME的免疫反應

免疫系統(tǒng)可以根據(jù)腫瘤特異性抗原或應激誘導的分子表達識別和消滅腫瘤細胞[18]，這一過程稱為免疫監(jiān)視。盡管免疫系統(tǒng)有腫瘤免疫監(jiān)視的功能，但腫瘤仍會在免疫系統(tǒng)正常運作的情況下發(fā)生、發(fā)展。腫瘤不僅與免疫細胞存在相互作用，與其他基質細胞之間也存在相互作用，如CAFs與免疫細胞相互作用。在TME中，CAFs與腫瘤細胞及其他類型的細胞相互作用，并分泌多種細胞因子(如細胞外基質蛋白、細胞外基質重塑酶、蛋白聚糖、趨化因子、血管促進因子以及其他影響腫瘤細胞增殖、侵襲和新陳代謝的因子)，參與抗腫瘤免疫應答的調(diào)節(jié)[19-23]。

2.1CAFs介導的TME中先天免疫反應的調(diào)節(jié) 基因簽名和質譜分析表明，CAFs可分泌免疫調(diào)節(jié)相關的蛋白質，該分泌物可作為TME的成分之一，在腫瘤進展中發(fā)揮多種作用，另外，這種與CAFs相關的分泌物還可通過多種方式調(diào)節(jié)先天免疫反應[24-25]。

TME中最常見的抗原呈遞細胞是巨噬細胞。巨噬細胞又分為M1型和M2型。M1型是在γ干擾素存在的情況下通過Toll樣受體刺激誘導產(chǎn)生，可分泌促炎細胞因子和活性氧類，并具有協(xié)調(diào)輔助性T細胞(helper T cell，Th細胞)1抗腫瘤免疫反應的能力；M2型是由CD4+Th細胞分泌的白細胞介素(interleukin，IL)-4和IL-13誘導產(chǎn)生[26]，在腫瘤進展、促進組織修復和血管生成中起重要作用[27]。M2型巨噬細胞與精氨酸酶1和IL-10的產(chǎn)生有關，精氨酸酶1可將精氨酸轉化為鳥氨酸和尿素，使精氨酸不可用于一氧化氮介導的細胞殺傷[28]；精氨酸酶1還可下調(diào)T細胞受體的ζ鏈，從而抑制T細胞活化[29]。腫瘤相關巨噬細胞在原發(fā)和轉移部位具有促腫瘤作用，通過刺激細胞增殖、存活、血管生成、侵襲轉移以及抑制細胞毒性T細胞的作用在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮支持作用[30-31]。有研究發(fā)現(xiàn)，從肝硬化肝中提取的CAFs和肝硬化肝成纖維細胞在功能上能夠使腫瘤相關巨噬細胞分化為M2型，并為癌細胞提供惡性潛能，從而調(diào)節(jié)有利于肝癌發(fā)展的微環(huán)境[32]。Takahashi等[33]在頭頸部鱗狀細胞癌患者組織中分離CAFs，并收集CAFs上清和健康供體上外周血單核細胞進行共培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)的CD14+細胞中CD68、CD163、CD14、CD80、CD86以及白細胞表面抗原G的表達水平均上調(diào)；此外，精氨酸酶1、IL-6、IL-10和轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的基因表達也有增加，說明與對照細胞相比，CAFs共培養(yǎng)的細胞抑制T細胞增殖的能力更強；同時該研究還發(fā)現(xiàn)，CAFs可以誘導巨噬細胞免疫抑制表型(即M2型)的出現(xiàn)，導致頭頸部鱗狀細胞癌患者的預后不良。Comito等[34]發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌中，CAFs通過分泌基質衍生生長因子-1促使巨噬細胞向M2型轉化，而M2型巨噬細胞又能夠反過來影響成纖維細胞的上皮-間充質轉化，從而協(xié)同促進癌細胞的侵襲和轉移。有研究在結直腸癌和胰腺導管癌中發(fā)現(xiàn)，CAFs可通過分泌IL-8募集單核細胞，并促進巨噬細胞的M2極化，而后CAFs與M2型巨噬細胞協(xié)同作用抑制自然殺傷細胞的功能[35-36]。

中性粒細胞是TME中含量豐富的免疫細胞。腫瘤相關中性粒細胞(tumor-associated neutrophils，TAN)也具有促腫瘤的效應。CAFs可能參與中性粒細胞向TME的募集，特別是通過分泌CXC趨化因子配體[chemokine(C-X-C motif) ligand，CXCL]1、CXCL2、CXCL5、CXCL6、CXCL8和CC趨化因子配體2，而且TAN與腎癌和胰腺癌患者的預后較差有關[37]。在肝細胞癌中，CAFs通過IL-6/信號轉導及轉錄激活因子3/程序性細胞死亡配體1(programmed cell death ligand-1，PD-L1)信號通路調(diào)節(jié)肝細胞癌中中性粒細胞的存活、激活以及功能的行使[38]。然而，TAN的募集是否參與CAFs的免疫抑制目前尚不清楚，需要進一步研究加以明確。

另一個細胞群也涉及復雜的CAFs-TME相互作用。源自CD34+/CD117+多能造血干細胞的肥大細胞是組織駐留的前哨細胞，在激活后可釋放廣譜趨化因子和細胞因子[39]。但在胰腺腫瘤中證實，肥大細胞和星狀細胞(通常稱為CAFs前體)之間的復雜相互作用能夠激活肥大細胞，進而分泌IL-13和類胰蛋白酶，促進CAFs增殖，從而有利于腫瘤生長[40]。激活的肥大細胞不僅可以加快腫瘤的進程，而且可以改變抗腫瘤免疫反應，如由肥大細胞分泌的自由腺苷可分別抑制T細胞功能，促進M2極化[41]。然而，CAFs與肥大細胞的相互作用是否與CAFs的免疫抑制能力有關目前尚不清楚，需進一步研究。由此可見，CAFs能夠分泌多種細胞因子，從而募集多種先天免疫相關的細胞，并獲得免疫抑制和促腫瘤表型。

2.2CAFs介導的TME中獲得性免疫反應的調(diào)節(jié) CAFs也能夠參與調(diào)節(jié)獲得性免疫反應，但研究CAFs與獲得性免疫細胞之間的相互作用尚缺乏復雜的相關細胞體外測定方法，且體內(nèi)實驗多將免疫缺陷動物作為模型，不利于觀測CAFs對T細胞以及B細胞的影響。

TME中的腫瘤浸潤淋巴細胞參與了抗腫瘤免疫反應[42]。腫瘤浸潤淋巴細胞中調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)通過調(diào)節(jié)免疫破壞和預防自身免疫性疾病在正常生理過程中發(fā)揮重要作用。Treg細胞通常存在于實體瘤中，并通過募集機制促進腫瘤的免疫，包括分泌免疫抑制相關的細胞因子、與效應T細胞競爭激活趨化因子以及直接與浸潤的效應T細胞接觸[43-44]。Treg細胞與TME中TGF-β水平的升高相關，TGF-β是免疫抑制的介質之一，TGF-β可通過限制樹突狀細胞的遷移和壽命擾亂T細胞的激活，并可促進Treg細胞的活化[45-46]。因此，與CAFs共存的叉頭框轉錄因子3(+)Treg與肺腺癌的不良預后相關[47]。此外，CAFs在肺癌中表達的環(huán)加氧酶2會導致其分泌前列腺素E2，而前列腺素E2可誘導叉頭框轉錄因子3的表達，在Treg細胞功能中發(fā)揮重要作用[48]。CAFs還具有影響CD4+Th細胞的潛在能力，使CD4+Th細胞從抗腫瘤細胞轉變?yōu)榇倌[瘤細胞。CD4+Th細胞可分化為具有不同功能和細胞因子分泌特征的多個亞系，進而誘導、維持或調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應。幼稚的CD4+Th細胞可分化為Th17細胞，特點是能夠產(chǎn)生IL-17和IL-22，可能在TME中具有促腫瘤和免疫抑制作用，但目前仍存在爭議[49]。

位于腫瘤邊緣的免疫抑制性白細胞和CAFs可通過細胞外基質蛋白物理排除T細胞，或通過趨化因子和其他不明機制阻止T細胞向腫瘤中心遷移[50-51]。CAFs可以調(diào)節(jié)腫瘤內(nèi)T細胞的分布，肺癌患者腫瘤組織切片的活細胞成像顯示，在松散的纖連蛋白和膠原蛋白區(qū)域中有活躍的T細胞運動，而T細胞在癌巢周圍的密集基質區(qū)域中遷移受限，從而抑制了T細胞與腫瘤的接觸[50,52]。Lakins等[53]對CAFs、T細胞以及腫瘤細胞進行共培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)，正常的成纖維細胞對腫瘤細胞并無保護作用，而CAFs細胞能夠通過調(diào)節(jié)T細胞，提高腫瘤細胞的存活率，由于僅在CAFs暴露于抗原卵清蛋白時才觀察到腫瘤細胞活力的增強，因此這種CAFs介導的OT-Ⅰ小鼠中T細胞毒性抑制是抗原特異性及抗原依賴性的；進一步研究表明，CAFs可能通過PD-L2和凋亡相關因子配體參與誘導T細胞凋亡，意味著CAFs利用腫瘤抗原交叉呈遞和關鍵免疫檢查點配體的重合上調(diào)，致使抗原特異性T細胞死亡以及剩余細胞毒性T細胞的功能損傷，以保護腫瘤細胞免受免疫破壞。除了產(chǎn)生細胞外基質外，CAFs產(chǎn)生的CXCL12還可在胰腺癌模型中抑制腫瘤內(nèi)T細胞浸潤[54]?？傊珻AFs可通過影響多種獲得性免疫細胞(如Treg細胞、Th細胞)和TME的物理環(huán)境，形成TME中的免疫抑制狀態(tài)。

2.3CAFs在TME中對腫瘤細胞本身的免疫調(diào)節(jié) CAFs不僅能夠對TME中的免疫細胞產(chǎn)生作用，對腫瘤細胞本身也存在免疫調(diào)節(jié)功能(如上調(diào)腫瘤細胞上免疫標志物的表達)。已知的免疫檢查點(如程序性細胞死亡受體1/PD-L1)在預防自身免疫中起關鍵作用，但在癌癥中發(fā)揮著逃避免疫系統(tǒng)攻擊的作用。Li等[55]在小鼠中發(fā)現(xiàn)，CAFs可通過分泌CXCL5上調(diào)黑色素瘤細胞和結直腸癌細胞中PD-L1的表達；進一步研究表明，CAFs分泌的CXCL5通過磷脂酰肌醇激-3-激酶/蛋白激酶B信號通路促進PD-L1的表達，從而促進免疫抑制微環(huán)境的形成。在肝癌中，高表達IL-6的CAFs除了募集免疫抑制細胞外，還可通過上調(diào)腫瘤細胞中PD-L1的表達損害腫瘤浸潤的T細胞功能[56]。日本的一項研究顯示，CAFs與肺腺癌中免疫細胞的浸潤無關，但可通過分泌CXCL2上調(diào)肺腺癌細胞中PD-L1的表達，間接影響腫瘤的免疫狀態(tài)[57]。CAFs對腫瘤細胞的免疫抑制作用反映了CAFs可作為癌癥治療的潛在生物學標志物。

3 靶向CAFs在癌癥免疫療法中的應用

實體腫瘤的免疫療法在臨床前和早期臨床研究中顯示出廣闊的應用前景，但其作用有限。TME的成分復雜性是免疫療法的主要障礙之一，僅僅靶向腫瘤細胞的治療策略不足以阻止侵襲性腫瘤的生長，現(xiàn)代的免疫療法已轉向TME，因此需要一種協(xié)同的TME靶向策略開發(fā)更加有效的腫瘤免疫療法[58]。CAFs是實體瘤微環(huán)境中最優(yōu)勢的細胞類型之一，鑒于TME中腫瘤細胞與CAFs之間的密切相互作用，CAFs已成為腫瘤微環(huán)境中極具研究價值的治療靶標[59]。靶向CAFs的方法大致可分為三類：①可通過轉基因技術和腺病毒消除FAP+CAFs；②針對CAFs的信號轉導，如CXCL12/CXC趨化因子受體4和Janus激酶/信號轉導及轉錄激活因子3途徑以及TGF-β等信號通路；③靶向CAFs激活途徑。

3.1通過轉基因技術和腺病毒靶向CAFs 近年來，靶向CAFs療法主要集中于FAP[60]。FAP是一種跨膜絲氨酸蛋白酶，在大多數(shù)人類上皮腫瘤中的CAFs上高表達，并在腫瘤進展和轉移中發(fā)揮重要作用。在Lewis肺癌和胰腺導管腺癌模型中，F(xiàn)AP基因的缺失可致FAP+CAFs浸潤顯著減少，腫瘤快速缺氧壞死，這與CD8+T細胞浸潤有關[61-62]。通過DNA疫苗接種和嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)-T細胞消除FAP+CAFs已成為免疫治療方法的重要補充。一項開拓性的研究表明，口服FAP的DNA疫苗可誘導CD8+T細胞殺傷CAFs，從而顯著增加對多藥耐藥小鼠結腸癌和乳腺癌化療藥物的腫瘤內(nèi)吸收[63]。改良的FAP DNA疫苗能夠克服腫瘤的免疫耐受，誘導CD8+和CD4+T細胞免疫應答，其中SynCon FAP DNA疫苗可與其他腫瘤抗原特異性疫苗協(xié)同作用于荷瘤小鼠[64]。值得注意的是，在具有免疫能力的小鼠模型中，F(xiàn)AP特異性CAR-T細胞治療可以提高宿主的免疫能力，聯(lián)合引入抗FAP和抗腫瘤CAR-T細胞也可使免疫缺陷荷瘤小鼠表現(xiàn)出抗腫瘤免疫[65-66]。此外，通過過繼轉移FAP特異性CAR-T細胞可以抑制胰腺癌的生長，具有低免疫原性[67]。有研究顯示，以FAP為靶點的溶瘤腺病毒在荷瘤小鼠中通過激活內(nèi)源性T細胞攻擊FAP+間質細胞，從而增強抗腫瘤免疫[68-69]。但需要注意表達FAP的骨髓間充質干細胞和骨骼肌也可能被FAP特異性CAR-T細胞識別并殺傷。另一項研究則得出了相反的結果，即過繼轉移FAP特異性CAR-T細胞的抗腫瘤作用有限，且會引起顯著的致死毒性和惡病質[70]，相反的結果可能歸因于CAR中構建的差異單聯(lián)可變片段。因此，對于將FAP作為免疫治療的靶標需提高警惕。

3.2靶向CAFs相關的信號通路 學者們將靶向CAFs相關信號通路與免疫療法相結合，以期提高抗腫瘤效率[60,71]。在胰腺癌中靶向CXCL12/CXC趨化因子受體4軸可逆轉FAP+CAFs介導的免疫抑制作用，并與抗PD-L1免疫療法有協(xié)同作用[54]。同樣，靶向CAFs分泌的其他因子(如IL-6和TGF-β)也可改善抗腫瘤免疫反應[72]。針對IL-6及其信號通路的新型藥物，已經(jīng)在腫瘤中進行了臨床試驗[73]。有研究顯示，CAFs中的TGF-β信號轉導通過促進T細胞排斥，減弱抗PD-L1藥物的作用，TGF-β阻斷劑和抗PD-L1抗體聯(lián)合可抑制CAFs中的TGF-β信號轉導，有利于T細胞浸潤癌巢，從而激發(fā)有效的抗腫瘤免疫[74-75]。曲尼司特可抑制CAFs生長和TGF-β分泌，協(xié)同增強小鼠模型中E-G7淋巴瘤、LLC1 Lewis肺癌以及B16F1黑色素瘤的樹突狀細胞疫苗的抗腫瘤免疫反應[59]。由此可見，靶向CAFs相關的信號通路可能是治療癌癥的一種新策略。

3.3靶向CAFs激活途徑 除了直接消除CAFs外，靶向CAFs的激活途徑使其恢復正常也具有成效。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-21/核因子κB的激活對于CAFs的腫瘤轉移作用至關重要，使用miR-21小分子抑制劑AC1MMYR2對CAFs進行重編程，可減弱核因子κB的活性，其與紫杉醇聯(lián)合應用，可達到抑制腫瘤侵襲轉移的目的[76]。血管緊張素受體阻滯劑可將CAFs重編程為靜止狀態(tài)，但血管緊張素受體阻滯劑的劑量受全身不良反應的限制，為此，美國學者開發(fā)出優(yōu)先聚集在腫瘤中起作用的血管緊張素納米聚合物，在減輕全身不良反應的同時，可增強血管緊張素受體阻滯劑對CAFs的重編程作用，減輕腫瘤的免疫抑制作用，改善T淋巴細胞活性，使患有原發(fā)性和轉移性乳腺癌的小鼠對免疫檢查點抑制劑更加敏感[77]。通過維生素A和維生素D對CAFs進行重編程，將處于激活狀態(tài)的CAFs重置為靜止狀態(tài)，在胰腺導管腺癌和結直腸癌中引起了廣泛關注[78-80]。施用多效藥物全反式視黃醇可抑制活化的CAFs促進腫瘤的信號通路，致使CD8+T細胞浸潤顯著增加，并改善胰腺導管腺癌的療效[81]。一項平行研究顯示，維生素D受體的刺激能夠使乳腺癌中的CAFs失活[82]。目前正在進行程序性細胞死亡受體1聯(lián)合維生素D類似物治療胰腺導管腺癌的Ⅱ期臨床試驗[12]。

4 小 結

TME的存在可能促使腫瘤復發(fā)和耐藥性的產(chǎn)生，因此以腫瘤為中心的治療思路不足以根治惡性腫瘤。在TME中CAFs含量豐富，可以通過各種信號通路與免疫細胞及癌細胞相互作用，且與腫瘤進展關系密切，因此近年來備受關注。CAFs在癌癥進展過程中發(fā)揮的抗腫瘤免疫作用使其有望成為癌癥干預治療靶標。通過靶向CAFs，中斷其與腫瘤之間的相互作用，從而逆轉TME中的免疫抑制狀態(tài)，是一種克服癌癥的有效方法。目前對于CAFs在腫瘤免疫方面的研究多集中于體外細胞實驗，雖有一定參考價值，但對于體內(nèi)的復雜環(huán)境缺乏說服力。因此，需要動物模型來模擬體內(nèi)狀況，但多數(shù)采用免疫缺陷動物進行的實驗阻礙了CAFs對T細胞和B細胞的影響，這也是急需解決的一大難題。