(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

甲殼素(chitin)是甲殼類動物外殼的結(jié)構(gòu)材料,在自然中廣泛存在,存在量僅次于纖維素。其脫乙酰產(chǎn)物殼聚糖(chitosan)是一種天然的可食性保鮮材料,由于其有較好的成膜性、氣體選擇透過性和抗菌性,被廣泛地用做葡萄的采前和采后保鮮包裝處理[1]。但殼聚糖的溶解性能較差,不溶于水、堿性溶液和大部分有機溶劑,這大大限制了殼聚糖的應(yīng)用。不過由于殼聚糖分子鏈中氨基葡萄糖單元上的伯羥基、仲羥基以及氨基等基團具有較強的反應(yīng)活性[2-3],可通過功能化修飾或改性方法改善其溶解,并被賦予各種不同的功能特性[4-7],制備出各種不同性能的殼聚糖衍生物。例如在醫(yī)藥行業(yè)中使用的殼聚糖改性后制備的緩釋材料、醫(yī)用保水賦形材料[8-9]以及利用其生物相容性、抑菌性能制備的其他多種新型藥用材料[10]。

目前,國內(nèi)外相關(guān)研究人員在氣調(diào)貯藏[11-13]、輻射處理[14]、臭氧[15]、二氧化氯[16]等保鮮措施方面做了一些研究,但成本高以及多次施藥處理在生產(chǎn)上可行性不高。SO2兼具防腐、鈍化氧化酶活性、抗氧化、抑制呼吸、延緩代謝等多重功能[17],是目前使用最為廣泛的葡萄保鮮劑。但由于SO2對人體有毒害作用,因此通過SO2保鮮處理的葡萄的保鮮劑殘留量問題也是人們關(guān)注的焦點之一。

本研究以殼聚糖為主要原料,利用金屬離子配位反應(yīng)、硫化反應(yīng)及包埋技術(shù)制備殼聚糖型SO2緩釋材料。采用場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡、傅里葉紅外光譜儀對材料進行表征,探討不同分子量殼聚糖合成的SO2緩釋材料對SO2釋放的影響。選出合成殼聚糖型SO2緩釋材料的最佳分子量,為今后合成新型SO2緩釋材料提供理論基礎(chǔ),并為將該材料用于葡萄保鮮奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖(脫乙酰度97%,分子量分別為50、100、150 kDa)、殼聚糖鹽酸鹽(分子量為50 kDa) 自江蘇瑞多生物有限公司;冰乙酸、丙酮、無水乙醇、甲酸、硫酸銅、氫氧化鈉、碘 分析純,天津市致遠化學(xué)試劑有限公司;焦硫酸鈉 分析純,天津市光復(fù)精細化工研究所;硫代硫酸鈉 分析純,天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司;氨水 天津永晟精細化工有限公司;沉淀硫(含Al) 分析純,天津市福晨化學(xué)試劑廠;四硫化雙五亞甲基秋蘭姆(≧98%) 上海麥克林生化科技有限公司。

FA2004N電子天平 d=0.01 mg,上海菁海儀器有限公司;101-E電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;85-2控溫磁力攪拌器 江蘇金怡儀器科技有限公司;pHS-3E酸度計 天津市賽得利斯實驗分析儀器制造廠;HTC-1數(shù)顯溫濕度計 紅旗儀表(江蘇)有限公司;nicolet6700傅立葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司;FEI Quanta 250-EDS場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡-能譜儀 美國。

1.2 實驗方法

1.2.1 殼聚糖型SO2緩釋材料的制備 工藝流程如圖1,本文擬利用金屬離子對不同分子量(分子量分別為50、100、150 kDa)殼聚糖以及分子量為50 kDa的殼聚糖鹽酸鹽改性,進行殼聚糖分子鏈上N配位制得產(chǎn)物A;再將產(chǎn)物A利用膠硫劑對殼聚糖分子進行淺交聯(lián)制得產(chǎn)物B;進一步利用產(chǎn)物A包埋分散亞硫酸鹽或焦亞硫酸鹽制備得產(chǎn)物C;將產(chǎn)物B與產(chǎn)物C復(fù)合制得具有SO2分段緩釋、SO2緩釋周期長的殼聚糖型SO2緩釋材料。

圖1 殼聚糖型SO2緩釋材料工藝流程
Fig.1 Technological process of chitosan-type SO2sustained-release materials

1.2.1.1 產(chǎn)物A的制備 根據(jù)文獻[18]中的合成方法,準確稱取1.0 g的殼聚糖原料,溶于100 mL的1%甲酸溶液中,攪拌均勻,在磁力攪拌下滴加與殼聚糖單體等摩爾量的硫酸鹽水溶液,室溫反應(yīng)3 h后,加稀氨水調(diào)pH至5～7,繼續(xù)攪拌3 h,即為產(chǎn)物A,裝燒杯密封備用。

1.2.1.2 產(chǎn)物B的制備 準確稱取0.2 g的沉淀硫,研磨至變色加入1 mL飽和硫代硫酸鈉溶液繼續(xù)研磨,均勻后加入0.2 g四硫化雙五亞甲基秋蘭姆繼續(xù)研磨,加入1 mL乳化劑OP-10。研磨均勻即為膠硫劑。將產(chǎn)物A和膠體硫以1∶1的比例混勻,在60 ℃下攪拌至顏色將要變?yōu)楹谏?即為產(chǎn)物B,裝燒杯密封備用。

1.2.1.3 產(chǎn)物C的制備 準確各稱取0.5 g的硫代硫酸鈉和焦硫酸鈉,與1 mL乳化劑OP-10同時加入到液態(tài)產(chǎn)物A中,在60 ℃下攪拌至顏色將要變?yōu)楹谏?即為產(chǎn)物C,裝燒杯密封備用。

1.2.1.4 緩釋材料的制備 將產(chǎn)物C與產(chǎn)物B以1∶1的比例分散混合,在室溫下轉(zhuǎn)速為2000 r/min攪拌1 h。用乙醇/丙酮(1∶1,V/V)的混合溶劑將產(chǎn)物沉淀出來,抽濾,用75%乙醇、無水乙醇依次洗滌沉淀,最后60 ℃烘干至恒重,即為殼聚糖型SO2緩釋材料。若殼聚糖分子量為50 kDa的產(chǎn)物B和殼聚糖分子量為150 kDa的產(chǎn)物C混合,制成的殼聚糖型SO2緩釋材料即為5B15C;若殼聚糖分子量為150 kDa的產(chǎn)物B和殼聚糖分子量為50 kDa的產(chǎn)物C混合,制成的殼聚糖型SO2緩釋材料即為5C15B。

1.2.2 SO2釋放的測定及緩釋材料表征

1.2.2.1 殼聚糖型SO2緩釋材料釋放量測定 參考文獻[19]所載方法測定在室溫環(huán)境下每天釋放的SO2變化量及變化趨勢,將定量的殼聚糖型SO2緩釋材料放入1號磨口錐形瓶中,室溫下放置24 h后迅速取出殼聚糖型SO2緩釋材料,放入2號瓶中,再室溫下放置。48 h后,再從2號瓶中迅速取出殼聚糖型SO2緩釋材料,放入3號瓶中,檢測2號瓶的SO2量。依上類推,連續(xù)測定60 d的SO2緩釋量,并記錄每天的溫濕度。

檢測1號瓶釋放SO2量,迅速加入100 mL新煮沸過的去離子水及1 mL,10.5 mol/L的NaOH溶液,吸收30 min后,加入2 mL淀粉指示劑,然后用1.0 mol/L的碘標準溶液滴定至恰顯藍色,記錄數(shù)據(jù),并以同樣的方法作空白試驗。

每1 g緩釋材料釋放SO2的質(zhì)量mSO2(mg/g)=N(V1-V0)

式中:N:碘標準溶液的濃度,mol/L;V1:滴定試樣時消耗的碘標準溶液的體積,L;V0:滴定空白試樣消耗的碘標準溶液的體積,L。

1.2.2.2 紅外光譜檢測分析 依據(jù)文獻[20]中方法對殼聚糖原料及5B15C進行檢測,取溴化鉀載體約100 mg,置于瑪瑙研缽中,并加入少許樣品(樣品與載體的質(zhì)量比為1∶100)充分混合、磨細、混勻、裝模,然后將模具置于壓片機上并真空加壓至12 kPa,受壓1 min,制成0.1～1.0 mm厚的透明圓形薄片。用樣品架固定圓形薄片,置于紅外光譜儀的樣品室中進行測試。儀器的分辨率設(shè)定為0.4 cm-1,累加掃描16次。

1.2.2.3 場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡分析 依據(jù)文獻[21]中的測樣方法,取適量原料、產(chǎn)物A、B、C和5B15C(殼聚糖分子量為50 kDa的產(chǎn)物B和殼聚糖分子量為150 kDa的產(chǎn)物C混合,制成的殼聚糖型SO2緩釋材料)在60 ℃干燥箱中干燥至恒重的待測樣品,置于環(huán)境真空模式下的樣品艙中進行測試,倍數(shù)由小到大聚焦清晰后,調(diào)節(jié)最佳工作距離(WD)值;選擇合適的對比度和亮度、選擇適當?shù)膾呙杷俣群头直媛?最后將圖像保存。儀器使用的電壓為20 kV,設(shè)定的壓力(pressure)為130 Pa、保壓時間(dwell)為30 μs、模式(mode)為SE、探頭(det)為GSED。得到能譜圖、電鏡圖及元素組成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用WPS 2019對數(shù)據(jù)進行分析處理,用Origin 9.1作圖軟件進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子量殼聚糖型SO2緩釋材料的SO2釋放量

由圖2可知,在室溫條件下連續(xù)測樣60 d內(nèi)的最大溫差為14.6 ℃;最大相對濕差為25%。由圖3、圖4可知,在該條件下殼聚糖型SO2緩釋材料均有SO2氣體釋放,并且隨著時間的增加,50和150 kDa殼聚糖合成的殼聚糖型SO2緩釋材料釋放SO2呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。單一分子量合成的緩釋材料中(圖3),50和150 kDa殼聚糖合成的殼聚糖型SO2緩釋材料釋放曲線有先上升后下降的趨勢;殼聚糖鹽酸鹽和100 kDa殼聚糖合成的殼聚糖型SO2緩釋材料釋放曲線忽上忽下，受溫濕度的影響較大； 復(fù)合分子量合成的殼聚糖型SO2緩釋材料比單一分子量合成的殼聚糖型SO2緩釋材料的SO2釋放量相對平穩(wěn)(圖4)。圖4中殼聚糖分子量為50 kDa的產(chǎn)物B和150 kDa的產(chǎn)物C混合而成的殼聚糖型SO2緩釋材料(5B15C)前4 d,由于該緩釋材料在水氣及氧氣的作用下,含硫殼聚糖骨架分子在金屬離子的催化下釋放二氧化硫,使得SO2的釋放量突然升高,第4～30 d釋放量維持在50 mg·g-1以上,30 d之后釋放量逐漸減小,并且在整個釋放過程中相對5C15B其SO2的釋放量隨著溫濕度的改變而出現(xiàn)忽高忽低的現(xiàn)象較少,受溫濕度的影響較小,更適宜合成殼聚糖型SO2緩釋材料。

圖2 測定樣品時環(huán)境的溫濕度Fig.2 Temperature and humidity of the environment when measuring the sample

圖3 不同分子量緩釋材料的SO2釋放量Fig.3 SO2 release from different molecular weight sustained release materials

圖4 復(fù)合緩釋材料的SO2釋放量Fig.4 SO2 release from composite slow release materials

2.2 殼聚糖原料和5B15C的紅外光譜分析

通過紅外光譜的檢測圖5可知50和150 kDa分子量的殼聚糖原料在其特征結(jié)構(gòu)處均有吸收峰,即3400 cm-1左右是形成氫鍵締結(jié)的-OH伸縮振動吸收峰與-NH的伸縮振動吸收峰重疊而增寬的多重吸收峰(峰Ⅰ);2918.8～2922.4 cm-1和2880.4～2881.7 cm-1為C-H的兩個伸縮振動吸收峰(峰Ⅱ);1656.1～1657.8 cm-1是較強的酰胺I吸收峰(峰Ⅲ);1591.5～1598.8 cm-1是酰胺Ⅱ吸收峰(峰Ⅳ);1350～400 cm-1處為指紋區(qū)。

由圖5可知,5B15C與殼聚糖原料相比在峰Ⅰ處發(fā)生藍移,并且透過率增大;在峰Ⅱ處沒有吸收峰;在峰Ⅳ處出峰較小,可忽略不計;在峰Ⅲ處,吸收峰位置沒有發(fā)生變化但是透過率增加;在指紋區(qū)發(fā)生紅移,透過率介于50和150 kDa的殼聚糖原料之間。

圖5 紅外光譜Fig.5 Infrared spectrum

2.3 掃描電鏡以及元素分析

2.3.1 殼聚糖原料的場發(fā)射掃描電鏡檢測 由殼聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)式可知(圖6),殼聚糖原料中主要由C、H和O元素構(gòu)成,因此在能譜儀元素分析結(jié)果中只有C和O元素(圖7),其中C和O元素的原子含量分別為57.74%、42.26%;歸一化質(zhì)量分別為64.54%、35.46%。掃描電鏡下殼聚糖形狀呈片狀(圖8)。

圖6 殼聚糖結(jié)構(gòu)式Fig.6 Structural type of chitosan

圖7 殼聚糖EDS譜圖Fig.7 EDS spot 1-Det 1 of chitosan

圖8 殼聚糖電鏡圖(1600×)Fig.8 Electron micrograph of chitosan(1600×)

2.3.2 產(chǎn)物A的場發(fā)射掃描電鏡檢測 如圖9,殼聚糖通過與金屬離子絡(luò)合配位得到改性后的產(chǎn)物A,使其分子鏈聚集狀態(tài)改變,金屬離子產(chǎn)生溶劑化效應(yīng),水溶性增加,具備良好的成膜性和包覆性，并且改變分子結(jié)構(gòu)的電性質(zhì),使其正電性增強,抑菌能力增強[22-23]。由于本實驗選用的金屬離子鹽是無水硫酸銅,故在殼聚糖的基本結(jié)構(gòu)上引入了Cu離子,對其反應(yīng)過程進行推測[24-25]。由能譜儀元素分析可知(圖10),C、O、Cu和S的原子含量分別是24.70%、36.10%、32.71%、6.49%;歸一化質(zhì)量分別是40.88%、44.86%、10.23%、4.02%。電鏡下觀察由殼聚糖原料的片狀結(jié)晶體轉(zhuǎn)變成彌漫球狀(圖11)。

圖9 產(chǎn)物A合成途徑Fig.9 Synthetic pathway of compound A

圖10 產(chǎn)物A的EDS譜圖Fig.10 EDS spectrogram of compound A

圖11 產(chǎn)物A電鏡圖(1600×)Fig.11 Electron micrograph of compound A(1600×)

2.3.3 產(chǎn)物B的場發(fā)射掃描電鏡檢測 如圖12所示,絡(luò)合改性后的殼聚糖進行硫化交聯(lián)得到產(chǎn)物B,在合成過程中引入了硫,使得產(chǎn)物B分子骨架形成含硫大網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),能在水分子和氧的作用下將B分子骨架上的硫轉(zhuǎn)化為SO2緩慢釋放,是作為貯藏前期較高濃度SO2緩釋劑。其反應(yīng)過程推測如下[24-25],由能譜儀元素分析(圖13)可知,C、O、S、Cu及Al的原子含量分別是44.80%、36.99%、5.82%、11.58%及0.80%;歸一化質(zhì)量分別是57.96%、35.93%、2.82%、2.83%及0.46%,其中含有Al離子是從試劑中引入。電鏡下觀察產(chǎn)物B由產(chǎn)物A的彌漫球狀轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)在一起(圖14)。

圖12 產(chǎn)物A合成途徑Fig.12 Synthetic pathway of compound B

圖13 產(chǎn)物B的EDS譜圖Fig.13 EDS spectrogram of compound B

圖14 產(chǎn)物B電鏡圖(1600×)Fig.14 Electron micrograph of compound B(1600×)

2.3.4 產(chǎn)物C的場發(fā)射掃描電鏡檢測 利用金屬離子配位改性后的殼聚糖為包埋劑,對亞硫酸鹽、焦亞硫酸鹽進行包埋得到產(chǎn)物C,故在包埋過程中引入了硫,作為貯藏中后期SO2平穩(wěn)長效緩釋劑,其結(jié)構(gòu)推測如圖15[24-25],由能譜儀元素分析(圖16)可知,O、Cu、S的原子含量分別是31.59%、53.39%、15.03%;歸一化質(zhì)量分別是60.13%、25.59%、14.27%。電鏡下觀察產(chǎn)物C由產(chǎn)物A的彌漫球狀轉(zhuǎn)變?yōu)榘裨谝黄?圖17)。

圖15 產(chǎn)物C形態(tài)Fig.15 Pattern of compound C

圖16 產(chǎn)物C的X-射線能譜圖Fig.16 EDS spectrogram of compound C

圖17 產(chǎn)物C電鏡圖(1600×)Fig.17 Electron micrograph of compound C(1600×)

2.3.5 5B15C的場發(fā)射掃描電鏡檢測 產(chǎn)品5B15C為固體粉末,呈墨綠色,其產(chǎn)品如圖18。由能譜儀元素分析(圖19)可知,C、O、Cu、S的原子含量分別是21.23%、36.00%、32.08%、10.70%;歸一化質(zhì)量分別是36.40%、46.34%、10.40%、6.87%。電鏡下觀察為絮云狀(圖20)。

圖18 殼聚糖型SO2緩釋材料Fig.18 Chitosan-type SO2 sustained-release material

圖19 能譜儀元素分析Fig.19 EDS element analysis

圖20 5B15C電鏡圖(6000×)Fig.20 Electron micrograph of 5B15C(6000×)

通過掃描電鏡圖20可知,由殼聚糖原料合成殼聚糖型SO2緩釋材料的中間產(chǎn)物的形狀和組成元素上都發(fā)生了相應(yīng)的改變,說明殼聚糖型SO2緩釋材料的合成途徑是正確的。該材料在水氣及氧氣的作用下,含硫殼聚糖骨架分子在金屬離子的催化下,緩慢釋放二氧化硫,在緩慢釋放二氧化硫的過程中形成一定的孔洞,使水汽能透入包埋劑,包埋的亞硫酸鹽在金屬離子的催化下轉(zhuǎn)化為二氧化硫釋放。

3 結(jié)論

本研究利用碘量法測定SO2釋放量可知,合成的材料均有SO2氣體的釋放,其中最佳分子量合成的殼聚糖型SO2緩釋材料(5B15C)的釋放曲線在前4 d,釋放SO2的量突然升高,第4～30 d釋放量趨于穩(wěn)定,30 d之后釋放量逐漸的減小,并且受溫濕度影響較小,較為符合水果保鮮的曲線[26]。通過場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡、傅里葉紅外光譜儀等手段對5B15C進行表征。該緩釋材料在室溫環(huán)境下呈粉末狀、墨綠色;電鏡下為絮云狀,其主要元素和原子含量為21.23% C、36.00% O、10.70% S、32.08% Cu;歸一化質(zhì)量分別是36.40%、46.34%、6.87%、10.40%;主要官能團為-OH、-NH、C-H以及酰胺鍵。本研究結(jié)果為制備新型SO2保鮮劑提供了新思路和一定的理論基礎(chǔ)。但是,目前該材料未能控制釋放SO2的釋放量,后續(xù)將進一步優(yōu)化該緩釋材料的制備配方,并在研制殼聚糖型SO2緩釋材料的基礎(chǔ)上,初探該材料對“紅地球”、“木納格”葡萄保鮮貯藏品質(zhì)的影響。