康利花，蒙琪琪，俞彤苑，蔡佳玲，陳茹意，黃靖汶，阮文茹，蔡曉萱，張 弦

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121)

苦蘵(PhysalisangulataL.)，別名燈籠果、黃姑娘、天泡子等，為茄科酸漿屬草本藥食兩用植物，在我國廣泛分布.苦蘵的果、根或全草皆可入藥，具有清熱利尿、解毒之功.

國內(nèi)外目前對苦蘵提取物中分離得到的甾體類化合物的藥理活性研究發(fā)現(xiàn)，酸漿苦素類(physagulin)化合物以及睡茄內(nèi)酯類(withanolide)具有較高的抗腫瘤活性[1-2]，結(jié)構(gòu)研究亦表明酸漿苦素R(physagulin R)可能具有抗生素及抗炎藥物活性，因而成為國內(nèi)外研究熱點[3-5].目前對苦蘵physagulin R的藥性利用要求解決physagulin R合成途徑基因的篩選和鑒定這一難題.

據(jù)文獻報道，到目前為止已從苦蘵中總共分離得到17個酸漿苦味素類化合物.通過對其研究，可知這些化合物在生源合成中都來源于幾種共同的前體，這說明其次生代謝途徑具有一定的保守性，不同藥用活性成分的生源合成規(guī)律和機制存在一定的共性[6-8].近期，苦蘵基因組即將測序完成，將為酸漿苦味素類化合物代謝合成途徑研究提供了遺傳基礎(chǔ).

狗尾草花葉病毒(Foxtailmosaicvirus, FoMV)屬于馬鈴薯X病毒屬，是一種單組分、單鏈、正義RNA病毒，基因組大小約6.2 kb，種傳病毒，可廣泛地侵染單雙子葉植物[9].FoMV侵染單子葉植物后，僅產(chǎn)生較輕的癥狀或基本無癥狀，但保持了持續(xù)穩(wěn)定的復(fù)制表達能力.以上特點使得FoMV成為一種優(yōu)秀的病毒表達載體，可應(yīng)用于單雙子葉植物基因功能的研究，已有研究表明FoMV可成為一種優(yōu)秀的生物反應(yīng)器[10].

病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)是通過病毒攜帶靶基因的片段在侵染植物后，能夠誘導(dǎo)植物內(nèi)源(靶)基因的表達沉默，可在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平抑制靶基因的表達，進而形成植物表型或生理指標上的差異，無需植物組織培養(yǎng)；能夠在不同遺傳背景下的受侵染植物上起作用，通過差異化的表型和基因型分析，能對基因功能進行更透徹的分析[11-14].煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)為雙組分+ssRNA病毒(TRV1和TRV2)，TRV2上有克隆外源基因的位點，侵染植物后可引起相應(yīng)基因的表達沉默，是廣泛運用的VIGS病毒載體[15].近年來應(yīng)用 VIGS 技術(shù)進行藥用植物次生代謝產(chǎn)物調(diào)控的研究取得諸多重要成果，如那可汀和甜菜紅素的生物合成等[16].

本實驗成功地在苦蘵上通過FoMV實現(xiàn)了外源基因綠色熒光蛋白(eGFP)的表達，以TRV病毒為載體，對苦蘵的八氫番茄紅素脫氫酶(phytoenedesaturase，PDS)實現(xiàn)了基因沉默，驗證了苦蘵上通過植物病毒系統(tǒng)開展基因功能研究的有效性.可以通過該方法對Physagulin R基因合成途徑上候選基因的表達進行調(diào)控，再結(jié)合對合成產(chǎn)物的檢測結(jié)果明確相關(guān)基因.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

苦蘵及本氏煙(Nicotianabenthamiana)植物種子均為本實驗室保存，均生長在無蟲恒溫(25 ℃)溫室中，光照強度8 000 Lx，并給予16 h光照/8 h黑暗日照條件.苦蘵種子儲存于4 ℃保存箱進行去春化處理，經(jīng)表面消毒后，用0.01 mol/L PBS浸泡3 d，待發(fā)芽出苗后移植于營養(yǎng)土中.至3周后于6葉期即可用于農(nóng)桿菌浸潤侵染實驗.

1.2 克隆載體及試劑

狗尾草花葉病毒侵染性克隆(pCambia2300:FOMV，EF630359)由清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉玉樂教授惠贈，煙草脆裂病毒(TRV)侵染性克隆(pBin19:pTRV1，AF406990；pCAMBIA1309:TRV2, AF406991)由杭州師范大學(xué)洪益國教授惠贈.peGFP質(zhì)粒、農(nóng)桿菌LBA4404由本實驗室保存.pEASY-Blunt3克隆載體、Trans-T1感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、植物基因組提取試劑盒、植物RNA提取試劑盒購自QIAGEN；2×TaqMIX試劑盒購自康為世紀；常用化學(xué)試劑及細菌培養(yǎng)基均購自上海生工；限制性內(nèi)切酶SpeI、HpaI及逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自New English Biolabs；引物合成和測序均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成，DNA Marker購自TaKaRa，KOD-PlusPCR擴增酶購自TOYOBO公司.

1.3 苦蘵中外源基因病毒表達載體的構(gòu)建

通過生物軟件DNAMAN設(shè)計eGFP ORF的擴增引物，設(shè)計含HpaI酶切位點及保護堿基的上游引物為eGFP_Hpa-F及含AscI酶切的下游引物為eGFP_ASC-R (表1).以peGFP質(zhì)粒為模板，通過KOD-Plus擴增eGFP ORF片段，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性18 s， 退火溫度為58 ℃，退火時間為20 s，72 ℃延伸40 s，33個循環(huán)后延伸10 min，產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增片段大小無誤，PCR產(chǎn)物使用羅氏(ROCHE)PCR回收試劑盒按說明進行純化，再利用HpaI和AscI酶切，與同樣經(jīng)過酶切處理的質(zhì)粒pCambia2300:FOMV連接，轉(zhuǎn)化Trans-T1感受態(tài)細胞后通過引物：進行菌落PCR檢測，條件與前述擴增條件相同.篩選到的陽性克隆經(jīng)測序驗證，引物為pFoMV-seq-F/R (表1)，正確的pCambia2300:FOMV/eGFP表達質(zhì)粒通過電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404.

表1 合成相關(guān)基因引物Tab.1 Related primers in this study

續(xù)表1

1.4 苦蘵八氫番茄紅素脫氫酶基因(PDS)片段的RT-PCR擴增

采集3周生長期的苦蘵葉片1 g，用液氮冷凍，加入5 mm直徑鋼珠3顆，用組織振蕩破碎儀破碎，處理條件為35 Hz/s 持續(xù)2 min破碎.利用QIAGEN的RNA試劑盒按說明進行苦蘵總RNA的提取.提取后的RNA樣品溶解于50 μL RNase Free Water，用Thermo Scientific NanoDrop進行濃度測定及電泳檢查.

取2 μg總RNA樣品，采用全式金生物(TransGen Biotech)的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒，按說明進行逆轉(zhuǎn)錄，引物為Anchored Oligo(dT)18，獲得的cDNA通過核酸微量紫外分光光度計NanodropND-2000(美國ThermoScientific公司)測量反應(yīng)總體系濃度后稀釋至100 ng/μL，分裝為10 μL/小管備用.

以苦蘵cDNA為模板，PCR擴增目的基因PDS的部分401 bp片段，使用引物為含HpaI酶切位點KZ_PDS 401 Seq-F/含SpeI酶切位點的KZ_PDS 401 Seq-R (表1)，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性18 s，退火溫度為52 ℃，退火時間為20 s，72 ℃延伸30 s，33個循環(huán)后延伸10 min，產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，擴增片段大小無誤，PCR產(chǎn)物使用羅氏(ROCHE)PCR回收試劑盒按說明進行純化留用.

1.5 PDS基因片段的酶切及連接至pCAMBIA1309:TRV2載體

PDS基因的PCR片段及VIGS載體pCAMBIA1309:TRV2分別用HpaI和SpeI雙酶切后，分別回收目的片段和載體進行連接，重組質(zhì)粒通過化學(xué)法轉(zhuǎn)化至全式金生物的Trans1-T1 抗噬菌體感受態(tài)細胞中，pTRV2-F/-R為引物(表1)，用菌落PCR篩選重組質(zhì)粒.重組質(zhì)粒取3個送賽默飛生物(蘇州)公司測序驗證，正確的重組質(zhì)粒pCAMBIA1309:TRV2/PDSi通過電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，并通過pTRV2克隆構(gòu)建引物pTRV1-F/R進行PCR驗證.

1.6 含目的靶基因的農(nóng)桿菌培養(yǎng)及浸潤接種

將含有目的靶基因的VIGS載體的農(nóng)桿菌接種到含卡那霉素及鏈霉素抗性的YEP培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min過夜培養(yǎng).用4 000 r/min，離心15 min收集菌體，用無菌的0.01 MPBS重懸，調(diào)菌液至OD600為1.0左右，加入終濃度為0.01 mmol/L乙酰丁香酮以增強農(nóng)桿菌侵染效率.用1 mL無菌注射器將菌液注射到6葉期的苦蘵葉片中，注射后在第7、10、14、21天進行癥狀的觀察，并使用Sony照相機進行拍照及樣品的采集.

1.7 苦蘵種子萌發(fā)階段的農(nóng)桿菌侵染實驗

將30顆苦蘵種子涂布在預(yù)先浸濕的無菌9 cm Waterman濾紙上，置于直徑10 cm培養(yǎng)皿內(nèi).保持在25 ℃的生長室中，同時保持光照.在這樣的條件下2 d后，種子開始破壞它們的外衣并發(fā)芽.在此階段，收集種子于50 mL離心管中，與5 mL OD600為0.5的農(nóng)桿菌懸浮混合.使用真空泵保持0.085 MPa的負壓，來實現(xiàn)農(nóng)桿菌滲濾種子10 min.然后將農(nóng)桿菌滲入的種子轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)土中，保持黑暗24 h，然后置于25 ℃下16 h光照/ 8 h黑暗的無昆蟲生長室中培養(yǎng)，定期檢查局部和全身感染的發(fā)展，并進行照相記錄.

1.8 外源基因表達的觀察及檢測

為了檢測來自FoMV/eGFP的綠色熒光蛋白的表達，在苦蘵葉子接種農(nóng)桿菌浸潤接種10 d后收集系統(tǒng)新長出的幼葉，并在Nikon A1共聚焦顯微鏡下檢查綠色熒光.根據(jù)制造商的使用說明，設(shè)定450～490 nm激發(fā)和520 nm發(fā)射的條件以激發(fā)GFP并監(jiān)測綠色熒光的發(fā)射，同時在明視野下拍攝苦蘵的表皮葉肉細胞，使用Nikon A1軟件處理共聚焦圖像，拼合不同信號通道的圖片.

1.9 樣品的分子生物學(xué)分析及RT-PCR定量檢測

收集的苦蘵及本氏煙葉片，根據(jù)制造商的說明書，使用RNAprep Pure Plant Kit(TIANGEN)從苦蘵葉組織中提取總RNA，使用FastQuant RT試劑盒(TIANGEN)，通過M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶從經(jīng)DNase I處理的總RNA(2 μg)合成第一鏈cDNA，通過RT-PCR用特異引物檢測過表達系統(tǒng)中FoMV的侵染及eGFP的轉(zhuǎn)錄；引物pTRV1-F/R來檢測VIGS系統(tǒng)中TRV的侵染.利用CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad,USA)對相關(guān)靶基因進行表達量的檢測，使用引物為：以KZ.GAPDH和18S作為內(nèi)參，PDS基因的定量引物qRT_PDS-F/R(表1)，10 μL反應(yīng)體系包含2×UltraSYBRMIXER 5 μL，cDNA 1 μL(100 ng)，以及相應(yīng)基因的上下游引物各0.5 μL，每個反應(yīng)包含4個平行重復(fù)，以溶解曲線檢查產(chǎn)物擴增的特異性，使用相對定量法計算VIGS靶基因的相對表達量.

2 結(jié)果與分析

本實驗通過FoMV構(gòu)建外源基因表達的病毒載體，實驗設(shè)計如圖1a所示，增強型綠色熒光蛋白(eGFP)的ORF為720 bp，目前作為一種報告基因來研究基因表達、調(diào)控，我們使用eGFP表達作為技術(shù)體系的陽性對照.通過PCR獲得了eGFP的編碼序列，對純化的PCR樣品和表達載體我們進行了酶切和連接，通過PCR的方法篩選了陽性的克隆，其電泳結(jié)果(圖1b)顯示插入片段條帶大小約為900 bp(CP啟動子170 bp+eGFP720 bp，使用引物為pFoMV-seq-F/eGFP_Asc-R)和線性化的載體大小均符合預(yù)期.將兩者連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)測序驗證我們的陽性克隆含有目的插入片段.通過農(nóng)桿菌浸潤接種6葉齡的苦蘵，7 d后通過尼康共聚焦顯微鏡對新生的苦蘵系統(tǒng)葉片進行了觀察，顯示在其中均勻存在綠色熒光信號(圖1c)，這一結(jié)果說明FoMV/GFP已經(jīng)實現(xiàn)了整株植物的侵染，其攜帶的GFP蛋白實現(xiàn)了表達.作為一種潛病毒可以持續(xù)穩(wěn)定地表達外源或內(nèi)源基因，體現(xiàn)出相應(yīng)的基因功能，這是本技術(shù)平臺的優(yōu)勢.

a.FoMV病毒表達載體的示意圖，通過農(nóng)桿菌將含有病毒全長序列的片段插入植物基因組，然后通過花椰菜花葉病毒的35S啟動子轉(zhuǎn)錄為全長的RNA病毒，外源片段通過病毒的外殼蛋白(CP)的啟動子進行轉(zhuǎn)錄翻譯.b.eGFP片段的PCR電泳結(jié)果(CP啟動子170 bp+eGFP720 bp)及FoMV/eGFP質(zhì)粒的線性化片段電泳結(jié)果.c.FoMV/eGFP接種苦蘵7 d后在系統(tǒng)新葉上觀察到的GFP熒光.

圖1 基于FoMV在苦蘵中的GFP表達
Fig.1 FoMV-based eGFP expression inPhysalisperuviana

a.基于煙草脆裂病毒的基因沉默載體構(gòu)建示意圖，TRV為雙組分+ssRNA病毒(TRV1和TRV2)，TRV2上有克隆外源沉默基因的位點.b.PDS基因部分片段401 bp和線性化的pTRV2的電泳結(jié)果.c.PDS的沉默載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后接種 6 葉齡的苦蘵，2 周后可以觀察到新生的系統(tǒng)葉上出現(xiàn)褪綠變白的表型.

圖2 基于煙草脆裂病毒VIGS技術(shù)的苦蘵功能研究技術(shù)
Fig.2 TRV-based VIGS system and the syptom ofPDSionPhysalisL.

基于煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus, TRV)的VIGS載體體系可以克服寄主分生組織障礙的局限性，可以有力地蔓延整個植物組織，包括分生組織，而且侵染的癥狀與其他病毒相比更加輕微.在藥食兩用植物的基因功能研究中尚未見報道.因此，我們建立了基于TRV的苦蘵基因表達抑制載體.其載體設(shè)計如圖2a所示，TRV2攜帶有目的片段.

提取的苦蘵總RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，通過PCR擴增出PDS基因的401 bp部分片段，經(jīng)酶切連接插入pTRV2(圖2b)，經(jīng)測序驗證我們的沉默載體構(gòu)建正確，同樣轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后接種6葉齡的苦蘵，2周后可以觀察到新生的系統(tǒng)葉上出現(xiàn)褪綠變白的表型，這顯示了PDS的合成受到了破壞，我們成功構(gòu)建了基于TRV的苦蘵VIGS技術(shù)平臺.

由于接種6葉齡的苦蘵出現(xiàn)VIGS表型的時間在兩周后，周期較長，因此，我們對該體系的適用性進行了進一步優(yōu)化，即對種子萌發(fā)階段的苦蘵進行了農(nóng)桿菌的浸潤接種.結(jié)果顯示經(jīng)處理后，萌發(fā)2 d(圖3a)苦蘵子葉上即出現(xiàn)了PDS基因沉默的表型，TRV病毒的持續(xù)侵染，使得PDS的沉默表型在4、6、8、10、14、21 d(圖3b-f)均能持續(xù)實現(xiàn)和保持其基因沉默的表型.在接種2月后，苦蘵進入花期(圖3g)及坐果期(圖3h)，其成熟果實的外萼上同樣出現(xiàn)PDS沉默的表型，對于有褪綠表型的樣品，我們進行了采樣和定量分析.PDS基因在萼片、葉片、果肉中的表達僅為野生型中的4.36%、5.97%和4.98%(圖4).這說明基于TRV2的VIGS的基因表達沉默效率很高，且各花器官中的沉默水平穩(wěn)定，以上結(jié)果顯示我們的實驗設(shè)計合理，能夠?qū)崿F(xiàn)靶基因的表達干擾.

a.萌發(fā)后2 d;b.萌發(fā)后4 d; c.萌發(fā)后6 d; d.萌發(fā)后8 d; e.萌發(fā)后14 d; f.萌發(fā)后21 d; g.花期;h.坐果期.

圖4 通過VIGS技術(shù)使不同器官的PDS表達受到抑制Fig.4 The inhibited expression of PDS of different organs

基因功能的闡釋，離不開“一正一反”的Gain/Loss of function的過程分析.本研究中利用潛病毒狗尾草花葉病毒構(gòu)建了基因過表達系統(tǒng)，成功地在苦蘵上實現(xiàn)了外源基因GFP的表達，綠色熒光蛋白的表達穩(wěn)定，在系統(tǒng)新葉中穩(wěn)定而明亮，進而可以利用實現(xiàn)苦蘵內(nèi)源基因的表達，可以實現(xiàn)某未知功能基因的超表達，從而獲得某一次生代謝物合成上的變化或外觀性狀的變化.而與此對應(yīng)的是基于TRV的基因沉默技術(shù)，可以通過針對未知的基因設(shè)計特定的序列結(jié)構(gòu)，通過病毒的接種后，在苦蘵的萌發(fā)期、幼苗期、成苗期、坐果期不同生長階段均能實現(xiàn)靶基因的轉(zhuǎn)錄mRNA的特異性降解，抑制效果顯著且持久，通過病毒介導(dǎo)的基因超表達及基因表達抑制技術(shù)可實現(xiàn)苦蘵功能基因的差異表達，表型可以通過性狀觀察或次生代謝物含量的檢測分析得以明確，通過本方法可對藥食兩用植物苦蘵的重要基因進行功能研究.