郭兆培, 林 琳, 陳 杰, 田華雨, 陳學(xué)思

(中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所, 生態(tài)環(huán)境高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長春 130022)

隨著科技的發(fā)展, 基因治療逐漸在基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用領(lǐng)域被認(rèn)可, 用于治療基因相關(guān)疾病, 尤其是癌癥治療[1,2]. 傳統(tǒng)的放療、 化療和手術(shù)治療給患者帶來極大的痛苦, 并且容易復(fù)發(fā), 產(chǎn)生并發(fā)癥等. 基因治療是一種從核酸水平糾正錯亂及異?；虻男滦椭委熓侄? 有望從根本上治愈基因相關(guān)的各種疾病[3～5]. DNA及RNA等治療基因, 一方面容易在循環(huán)過程中被血液中的酶降解, 另一方面, 即使到達(dá)腫瘤組織, 其龐大的體積也很難穿過細(xì)胞膜, 從而失去治療作用[6], 因此, 開發(fā)安全且高效的基因擔(dān)載體系顯得尤為重要. 陽離子聚合物, 尤其是聚乙烯亞胺(PEI), 具有易于功能化修飾、 相對生產(chǎn)成本較低和免疫原性低等特點(diǎn), 已成為生命科學(xué)研究的重要工具, 具有潛在的臨床基因治療應(yīng)用價值. 在生理學(xué)環(huán)境下, PEI可與帶負(fù)電的DNA(或RNA)通過靜電作用形成納米顆粒, 在有效保護(hù)DNA的同時, 大大壓縮了DNA的體積. 這些納米級復(fù)合物顆?？梢酝ㄟ^大胞飲、 網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)及小窩內(nèi)陷等方式被細(xì)胞內(nèi)吞, 在細(xì)胞內(nèi)釋放基因物質(zhì), 對靶細(xì)胞的特定基因進(jìn)行調(diào)控, 從而完成基因治療[7～9]. 高分子量的PEI(分子量25000)具有較高的轉(zhuǎn)染效率, 但細(xì)胞毒性較大, 低分子量的PEI(分子量1800)具有較小的細(xì)胞毒性, 但轉(zhuǎn)染效率較低. 因此, 本課題組從多個角度對PEI進(jìn)行改性以降低細(xì)胞毒性并提升轉(zhuǎn)染效率, 利用交聯(lián)或修飾低分子量的PEI[10～12], 或?qū)Ω叻肿恿縋EI進(jìn)行生物相容性修飾等[13～15], 可以在一定程度上提高轉(zhuǎn)染效率并降低細(xì)胞毒性.

當(dāng)陽離子聚合物用于體內(nèi)時, 過多的正電荷易與血液中的負(fù)電蛋白結(jié)合, 形成較大顆粒, 被機(jī)體清除. 通常的解決方法是引入遮蔽體系遮蔽多余的正電荷, 如在PEI/DNA納米粒表面包裹pH響應(yīng)性電荷翻轉(zhuǎn)遮蔽體系, 引入負(fù)電的聚合物, 或者通過pH敏感鍵將聚乙二醇(PEG)鍵合到納米粒子上, 并取得了一定的體內(nèi)應(yīng)用效果[16～18]. 載體體系中PEG的含量對體內(nèi)循環(huán)起著關(guān)鍵作用, 在上述體系中, PEG的含量相對較少, 因此, 其體內(nèi)循環(huán)效果并沒有得到太大的提升. 但納米顆粒表面過多的PEG會嚴(yán)重降低細(xì)胞對納米顆粒的內(nèi)吞, 進(jìn)而影響治療效果[19,20]. 因此, 如何平衡、 解決這一矛盾成為提高載體體內(nèi)應(yīng)用的關(guān)鍵.

為了改善PEI在體內(nèi)的應(yīng)用效果, 同時降低細(xì)胞對納米顆粒的內(nèi)吞及轉(zhuǎn)染的影響, 本文構(gòu)建了聚谷氨酸接枝聚乙二醇@碳酸鈉(PPG@CaCO3)遮蔽體系, 用于遮蔽DNA/PEI復(fù)合物顆粒. 通過在聚谷氨酸上接枝較多的PEG, 達(dá)到更好的血液循環(huán)的目的, 通過在PPG上生長CaCO3解決引入過多PEG時引起的轉(zhuǎn)染效率下降的問題. 研究結(jié)果表明, PPG@CaCO3遮蔽體系不僅提升了PEI的轉(zhuǎn)染效率, 而且在應(yīng)用于小鼠體內(nèi)時, 顯著延長了載體的血液循環(huán)時間.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

PEI(Mw=25000, PEI-25000,Mw=1800, PEI-1800)、 噻唑藍(lán)(MTT)、 胰蛋白酶和多聚甲醛粉末(純度95%), 美國Sigma-aldrich公司; 谷氨酸芐酯-N-羧酸內(nèi)酸酐(BLG-NCA), 上海吉爾生化有限公司; 無水氯化鈣, 上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 碳酸鈉和磷酸三鈉, 北京化工廠; 氨基化甲氧基聚乙二醇(mPEG5K-NH2), 北京鍵凱科技有限公司; 熒光素酶試劑盒, 美國Promega生物技術(shù)有限公司; DMEM培養(yǎng)基、 新生牛血清(FBS)和Lyso Tracker green, 美國Thermo Fisher Scientific; Cy5-DNA(invitrogen), 廣州銳博生物科技有限公司; 人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)、 人乳腺癌細(xì)胞(MCF7)及中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO), 中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫; BALB/C小白鼠, 北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司;ZetaPotential/BI-90型Zeta電位及粒度分析儀, 美國布魯克海文儀器公司(Brookhaven); FC500型流式細(xì)胞儀, 美國貝克曼庫爾特公司(Beckman); ZESS LSM780型激光共聚焦顯微鏡, 德國Zeiss公司; Nikon-TE2000U型倒置熒光顯微鏡, 日本Nikon公司; 2030-101型熒光光度計(jì), 美國Promega公司; Merlin型掃描電子顯微鏡(SEM), 德國Zeiss公司; Tecan Infinite M200型多功能酶標(biāo)儀, 瑞士Tecan集團(tuán)公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 PPG@CaCO3及PPG@Ca3(PO4)2的制備 參照文獻(xiàn)[21]方法制備高分子載體PPG; 將1 g PPG、 無水氯化鈣、 碳酸鈉及磷酸三鈉分別溶于100 mL去離子水配成溶液; 將23.7 mL氯化鈣溶液緩慢滴加到40 mL PPG溶液中攪拌均勻; 在高速攪拌下, 緩慢滴加45.2 mL碳酸鈉溶液或46.6 mL磷酸三鈉溶液; 滴加完成后繼續(xù)攪拌4 h以上; 將產(chǎn)物溶液轉(zhuǎn)入透析袋(截留分子量3500)中, 在去離子水中透析48 h, 期間換水5次并保持水的pH值在7.4左右; 用濾紙濾掉較大顆粒, 濾液凍干待用.

1.2.2 粒徑和電位測定 測定遮蔽體系PPG@CaCO3及PPG@Ca3(PO4)2的粒徑和電位時, 將PPG@CaCO3及PPG@Ca3(PO4)2溶于水中, 配制成0.2 mg/mL的溶液, 測定粒徑大小及表面電位. 測定復(fù)合物顆粒DNA/PEI/PPG@CaCO3及DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2的粒徑和電位時, 選用熒光素酶質(zhì)粒DNA(pGL3)與基因載體材料(PEI)進(jìn)行復(fù)合. 首先, 配制0.1 mg/mL DNA水溶液, 將DNA與一定濃度的PEI混合均勻, 控制PEI的濃度為0.4 mg/mL, 靜置, 穩(wěn)定30 min, 然后加入等體積不同濃度的PPG@CaCO3或PPG@Ca3(PO4)2溶液混合均勻, 靜置20 min, 用納米粒度電位儀測量粒徑大小及表面電位.

1.2.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞, 接種于96孔培養(yǎng)板, 細(xì)胞密度為1.0×104Cell/孔, 每孔加入180 μL DMEM培養(yǎng)液(含10% FBS, 100 Units/mL青霉素, 100 μg/mL鏈霉素), 于37 ℃及體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 小心吸除培養(yǎng)液; 每孔中加入200 μL不同含量的PEI-25000, PEI-25000/PPG@CaCO3, PEI-25000/PPG@Ca3(PO4)2, PEI-1800, PEI-1800/PPG@CaCO3及PEI-1800/PPG@Ca3(PO4)2的DMEM溶液, 繼續(xù)培養(yǎng)48 h; 每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL); 在37 ℃繼續(xù)孵育4 h; 小心除去培養(yǎng)液, 每孔加入200 μL DMSO, 振蕩5 min; 用酶標(biāo)儀檢測492 nm處光吸收. 細(xì)胞存活率[Cell viability(%)]按下式計(jì)算:

Cell viability =(Asample/Acontrol)×100%

式中:Asample為單純樣品或復(fù)合物顆粒的細(xì)胞樣品孔的吸收;Acontrol為空白細(xì)胞(作為參照)的吸收, 每組實(shí)驗(yàn)做4個平行對照, 重復(fù)3次.

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 分別用HeLa, MCF7及CHO細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn), 以pGL3為報(bào)告基因. 將細(xì)胞接種于96孔板, 細(xì)胞密度為1.0×104Cell/孔, 培養(yǎng)24 h, 分別加入復(fù)合物顆粒. 將PEI與DNA按照不同的質(zhì)量比混合均勻, 其中DNA用量為0.2 μg/孔, 靜置30 min, 加入不同質(zhì)量的PPG, PPG@CaCO3或PPG@Ca3(PO4)2混合均勻, 并保持最終體積10 μL, 靜置20 min后加入96孔板中; 培養(yǎng)48 h后, 小心移去培養(yǎng)液, 用pH值為7.4的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液洗滌2次, 每孔加入50 μL細(xì)胞裂解液, 于-20 ℃冰箱中冷凍1 h, 取出, 溶解后吹打混合均勻; 取20 μL裂解液用于熒光素酶分析系統(tǒng)檢測. 另取25 μL裂解液用于BCA法檢測, 測定裂解液中的總蛋白含量, 最終結(jié)果的熒光素酶活性表示為每毫克蛋白的相對單位(RLU/mg Protein).

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)吞 取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞, 經(jīng)胰酶消化后用DMEM稀釋, 按每孔2.0×105Cell的密度接種于6孔板中, 置于37 ℃及CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的孵箱中培養(yǎng)24 h; 更換新鮮培養(yǎng)液, 然后分別加入Cy5-DNA/PEI, Cy5-DNA/PEI/PPG, Cy5-DNA/PPG@CaCO3和Cy5-DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h; 吸出培養(yǎng)液, 用PBS緩沖溶液清洗3次, 用0.25%的胰酶溶液消化, 用10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中和胰酶, 將細(xì)胞懸浮液收集至小型離心管(EP管)中, 離心收集細(xì)胞, 吸出上清液, 然后用500 μL PBS溶液洗滌2次, 用流式細(xì)胞儀檢測載體材料對Cy5-DNA的內(nèi)吞情況.

1.2.6 激光共聚焦顯微鏡測試 依次用濃鹽酸、 酸液(重鉻酸鉀、 濃硫酸、 雙蒸水用量分別為100 g, 100 mL, 100 mL)浸泡蓋玻片至少48 h, 用乙醇浸泡48 h, 用去離子水洗滌后干燥; 將處理過的蓋玻片放入6孔板, 紫外光滅菌處理, 將HeLa細(xì)胞以每孔1.5×105Cell的密度接種于蓋玻片上, 培養(yǎng)24 h, 更換新鮮培養(yǎng)液, 然后加入各種載體與Cy5-DNA的復(fù)合物, 內(nèi)吞4 h, 吸去廢液, 用PBS輕輕清洗5次; 用4%多聚甲醛固定10 min, 吸棄廢液, 再用PBS洗滌3次; 每孔加入1 μL DAPI(1 mg/mL)溶液, 標(biāo)記細(xì)胞核, 1 min后吸出廢液, 用PBS洗滌5次; 然后用新配置的Lyso Tracker green標(biāo)記內(nèi)涵體, 用PBS洗滌至少5次, 用甘油封片, 于4 ℃避光保存, 用激光共聚焦顯微鏡觀察復(fù)合物顆粒在細(xì)胞內(nèi)的分布情況.

1.2.7 藥代動力學(xué)測試 取4～6周齡、 體重約為20 g的BALB/C小白鼠(所有實(shí)驗(yàn)程序均符合東北師范大學(xué)動物保護(hù)和使用委員會制定的實(shí)驗(yàn)動物指南), 分為5組, 每組3只, 分別尾靜脈注射以下5組藥物, Cy5-DNA, Cy5-DNA/PEI, Cy5-DNA/PEI/PPG, Cy5-DNA/PPG@CaCO3和Cy5-DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2, 其中Cy5-DNA的用量為1 mg/kg, 每只小鼠給藥體積為200 μL. 在設(shè)定的時間點(diǎn), 用帶有肝素鈉的微量移液器取血, 并轉(zhuǎn)入收集管; 從每個樣品中取樣10 μL血液, 并用PBS稀釋10倍, 轉(zhuǎn)入黑色96孔板, 用多功能酶標(biāo)儀檢測Cy5-DNA的熒光, 同時以空白血液作為參比; 采用PKSolver法計(jì)算了Cy5-DNA在血漿中的半衰期(t1/2).

Scheme 1 Preparation of PPG@CaCO3(A) and PPG@Ca3(PO4)2(B)

2 結(jié)果與討論

2.1 PPG, PPG@CaCO3及PPG@Ca3(PO4)2的制備及表征

Scheme 1給出PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2合成路線. 通過元素分析法測量了PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2中的鈣含量分別為6.35%和10.9%.

2.2 粒徑和電位

陽離子載體與DNA靜電復(fù)合后通常會形成表面帶電荷的納米顆粒, 其大小、 表面電位及表面性質(zhì)將對納米顆粒在體內(nèi)循環(huán)及細(xì)胞內(nèi)吞產(chǎn)生重要的影響. 圖1給出PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2的粒徑分布及電位圖. 由圖1(A)可見, PPG@CaCO3的粒徑約為100 nm, PPG@Ca3(PO4)2的粒徑約為90 nm, 這可能是因?yàn)榱姿徕}在PPG上的生長好于碳酸鈣, 因而粒徑較小. 由圖1(C)和(D)可見, PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2的粒徑接近, 但明顯小于動態(tài)光散射的結(jié)果. 這與PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2表面含有大量的PEG有關(guān), 導(dǎo)致水合粒徑較大. 從圖1(B)可以看出, PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2的納米顆粒均為負(fù)電, 這有利于其與DNA/PEI的納米顆粒進(jìn)一步復(fù)合.

Fig.1 DLS(A), zeta potential(B) and SEM images(C, D) of PPG@CaCO3(a, C) and PPG@Ca3(PO4)2(b, D)

Fig.2 DLS(A), zeta potentials(B) and SEM images(C—E) of DNA/PEI-25000(a, C), DNA/PEI-25000/PPG@CaCO3(b, D) and DNA/PEI-25000/PPG@Ca3(PO4)2(c, E)

進(jìn)一步比較了DNA/PEI, DNA/PEI/PPG@CaCO3及DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2的粒徑及電位情況. DNA/PEI形成的納米粒子要小于DNA/PEI/PPG@CaCO3和DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2[圖2(A), (C), (D), (E)]. 這是因?yàn)榫哂幸欢降腜PG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2通過靜電吸附到DNA/PEI顆粒表面時會增加復(fù)合物顆粒尺寸.Zeta電位結(jié)果表明[圖2(B)], 將PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2引入到DNA/PEI上, 大大降低了DNA/PEI的表面電位, 表面電位由原來的25 mV下降到10 mV以下. 較低的表面電位一方面會減少與其它負(fù)電物質(zhì)的不必要結(jié)合, 另一方面還可以保持一定的與帶負(fù)電的細(xì)胞膜的結(jié)合能力.

2.3 細(xì)胞毒性

圖3給出不同濃度時PEI-25000, PEI-1800及其與PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2形成的復(fù)合物顆粒在HeLa細(xì)胞中的毒性. 由圖3(A)可見, PEI-25000具有較大的細(xì)胞毒性, 未遮蔽PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2時, 當(dāng)PEI濃度增加到20 μg/mL時, 細(xì)胞存活率迅速降至20%以下, PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2遮蔽后, 細(xì)胞存活率提升, 當(dāng)PEI濃度為20 μg/mL時, 細(xì)胞存活率依然接近80%, 因此引入PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2可以有效降低陽離子對細(xì)胞的毒副作用. 由圖3(B)可見, PEI-1800本身細(xì)胞毒性較低, 但隨著其濃度的增加也會產(chǎn)生一定的細(xì)胞毒性, 用PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2遮蔽后可以降低細(xì)胞毒性.

Fig.3 Relative HeLa cell viability of various carrier concentrations(A) a. PEI-25000; b. PEI-25000/PPG@CaCO3; c. PEI-25000/PPG@Ca3(PO4)2.(B) a. PEI-1800; b. PEI-1800/PPG@CaCO3; c. PEI-1800/PPG@Ca3(PO4)2.

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

以熒光素酶質(zhì)粒DNA(pGL3)為報(bào)告基因, 考察載體在不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率. 圖4(A)給出PPG, PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2遮蔽DNA/PEI在HeLa細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染情況. 可以看出, DNA/PEI在質(zhì)量比為1∶1.25時的轉(zhuǎn)染效率略高于1∶5. 而當(dāng)加入PPG和PPG@Ca3(PO4)2后, 載體轉(zhuǎn)染效率均大幅度下降. 而DNA/PEI/PPG@CaCO3的轉(zhuǎn)染效率不但沒有降低, 反而提高近10倍. 對比DNA/PEI/PPG@CaCO3在不同質(zhì)量比時的轉(zhuǎn)染結(jié)果發(fā)現(xiàn), 當(dāng)質(zhì)量比為1∶2.5∶2.5時, 具有最佳的轉(zhuǎn)染效果. 進(jìn)一步考察了PEI-1800的DNA/PEI體系, 得到了相似的結(jié)果[圖4(B)], 即PPG@CaCO3遮蔽體系有利于提高DNA/PEI的轉(zhuǎn)染效率. 但高分子量PEI體系的轉(zhuǎn)染效果更好. 本文進(jìn)一步研究了PEI-25000的DNA/PEI/PPG@CaCO3在CHO[圖4(C)]和MCF7[圖4(D)]細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況. 在這2種細(xì)胞中, 遮蔽PPG@CaCO3后, 轉(zhuǎn)染效率都有一定提高, DNA/PEI/PPG@CaCO3在CHO中最佳質(zhì)量比為1∶2.5∶1.25, 而在MCF7細(xì)胞中質(zhì)量比為1∶5∶2.5, 總體上差別不大.

Fig.4 Transfection efficiency of DNA/PEI, DNA/PEI/PPG, DNA/PEI/PPG@CaCO3, and DNA/PEI/PPG@ Ca3(PO4)2 at various mass ratios in HeLa(A, B), CHO(C) and MCF-7(D) cells(A, C, D) a. DNA/PEI-25000; b. DNA/PEI-25000/PPG; c. DNA/PEI-25000/PPG@CaCO3; d. DNA/PEI-25000/PPG@Ca3(PO4)2.(B) a. DNA/PEI-1800; b. DNA/PEI-1800/PPG; c. DNA/PEI-1800/PPG@CaCO3.

Fig.5 Flow cytometric analysis of cell endocytosis efficiency(A) and laser scanning confocal microscope observing particles intracellular transport(B) in HeLa cellsa. Control; b. DNA/PEI-25000; c. DNA/PEI-25000/PPG; d. DNA/PEI-25000/PPG@CaCO3; e. DNA/PEI-25000/PPG@Ca3(PO4)2.

2.5 細(xì)胞流式分析及激光共聚焦顯微鏡結(jié)果

圖5(A)給出DNA/PEI, DNA/PEI/PPG, DNA/PEI/PPG@CaCO3及DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2在HeLa細(xì)胞的內(nèi)吞情況. 以空白細(xì)胞作為參比(Control), 由圖5(A)可見, 所有組的內(nèi)吞效率相差不大, DNA/PEI的內(nèi)吞效率略高于DNA/PEI/PPG, 這可能是因?yàn)橐牒写罅縋EG的PPG體系, 過多的PEG對細(xì)胞內(nèi)吞有一定的影響. DNA/PEI/PPG@CaCO3及DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2的內(nèi)吞效率略高于DNA/PEI, 這可能與遮蔽體系中的CaCO3和Ca3(PO4)2納米顆粒有關(guān), 引入顆粒性的遮蔽體系, 有利于提高細(xì)胞內(nèi)吞. 與DNA/PEI相比, DNA/PEI/PPG@CaCO3和DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2略微提高了細(xì)胞內(nèi)吞效率, 但DNA/PEI/PPG@CaCO3的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)高于DNA/PEI和DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2, 這不同于普遍認(rèn)為的高細(xì)胞內(nèi)吞效率與高細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率一致的觀點(diǎn). 因此, 本文通過激光共聚焦顯微鏡觀察體系被細(xì)胞內(nèi)吞后的情況. 由圖5(B)可見, 采用載體擔(dān)載Cy5-DNA(紅色熒光), 通過Lyso Tracker green進(jìn)行內(nèi)涵體染色(綠色熒光)及DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色(藍(lán)色熒光)觀察體系進(jìn)入細(xì)胞情況. 研究發(fā)現(xiàn), DNA/PEI, DNA/PEI/PPG及DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2在細(xì)胞核周圍的熒光點(diǎn)比較少而且比較小, 但DNA/PEI/PPG@CaCO3顯示出更亮、 更大的熒光點(diǎn). 通常, 納米顆粒被細(xì)胞內(nèi)吞后形成內(nèi)涵體, 具有弱酸性, 內(nèi)涵體會進(jìn)一步結(jié)合溶酶體, 消化內(nèi)吞的物質(zhì). 因此, 如果載體不能從內(nèi)涵體逃逸, 基因物質(zhì)將會被消化降解. DNA/PEI/PPG@CaCO3體系遇酸會產(chǎn)生CO2氣體, 有利于漲破內(nèi)涵體, 使基因物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞, 因此具有較高的轉(zhuǎn)染效率.

2.6 藥代動力學(xué)

為考察載體是否適合體內(nèi)應(yīng)用, 本文通過藥代動力學(xué)研究載體的體內(nèi)循環(huán)情況. 分別將載有Cy5-DNA的納米顆粒及Cy5-DNA通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi). 注射劑量為1 mg/kg Cy5-DNA. 由圖6(A)可見, 在注射后不同時間點(diǎn)(0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12和24 h)取血, 檢測Cy5-DNA的熒光. 隨著時間的增加, Cy5-DNA及Cy5-DNA/PEI組血液中Cy5-DNA濃度迅速下降到較低水平. Cy5-DNA/PEI/PPG@CaCO3及Cy5-DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2與Cy5-DNA/PEI/PPG循環(huán)情況接近, 經(jīng)過24 h, 這3個體系中Cy5-DNA在血液中的濃度與2 h時Cy5-DNA組在血液中濃度接近, 因此, Cy5-DNA/PEI/PPG@CaCO3, Cy5-DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2及Cy5-DNA/PEI/PPG大大提高了Cy5-DNA在血液中的循環(huán)時間. 可見, 引入PPG可以有效增加血液循環(huán)時間, 并且在PPG上生長一定量的碳酸鈣及磷酸鈣不會影響血液循環(huán)效果. 本文對藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析, 采用PKSolver法, 計(jì)算了載體擔(dān)載Cy5-DNA在血漿中的半衰期. 由圖6(B)可見, 沒有載體時, Cy5-DNA很容易在血液中被清除, 其在血液中半衰期不到3 h. 單獨(dú)使用陽離子載體PEI時, 雖然可以起到一定作用, 但其半衰期也只是略微的改善. 引入PPG之后, Cy5-DNA在血漿中的半衰期得到大幅度提升, 與單獨(dú)的Cy5-DNA相比, 半衰期提高了近3倍. 由此可見, PPG的引入對于改善血藥濃度有著至關(guān)重要的作用. 同時, 即使在PPG上引入碳酸鈣或者磷酸鈣納米粒, 對Cy5-DNA在血漿中的半衰期影響不大.

Fig.6 Pharmacokinetics of Cy5-DNA, Cy5-DNA/PEI, Cy5-DNA/PEI/PPG, Cy5-DNA/PEI/PPG@CaCO3 and Cy5-DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2(A) and their half-life in blood(B)a. DNA; b. DNA/PEI-25000; c. DNA/PEI-25000/PPG; d. DNA/PEI-25000/PPG@CaCO3; e. DNA/PEI-25000/PPG@Ca3(PO4)2.

3 結(jié) 論

為了使陽離子基因載體更加適合體內(nèi)應(yīng)用, 并且不會影響其自身的轉(zhuǎn)染效率, 本文設(shè)計(jì)開發(fā)了具有促進(jìn)轉(zhuǎn)染增強(qiáng)作用的遮蔽體系. 制備了陰離子聚合物PPG, 以此聚合物為模板分別生長碳酸鈣和磷酸鈣得到PPG@CaCO3和PPG@Ca3(PO4)2, 并作為遮蔽體系, 用于遮蔽DNA/PEI. 由于PPG@CaCO3在酸性環(huán)境會釋放出二氧化碳?xì)怏w, 有利于漲破內(nèi)涵體, 從而將基因物質(zhì)運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi). 而DNA/PEI/PPG及DNA/PEI/PPG@Ca3(PO4)2體系無法在酸性環(huán)境中產(chǎn)生氣體, 導(dǎo)致運(yùn)送基因物質(zhì)至細(xì)胞內(nèi)的能力大大減弱. 通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染、 細(xì)胞內(nèi)吞及激光共聚焦實(shí)驗(yàn)研究了載體被細(xì)胞內(nèi)吞及細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)倪^程, 通過藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了所設(shè)計(jì)的載體體系大大提高了基因物質(zhì)的體內(nèi)循環(huán)時間, 適合體內(nèi)應(yīng)用. 因此, 本文設(shè)計(jì)的遮蔽體系不僅解決了陽離子載體不適合體內(nèi)應(yīng)用的問題, 而且解決了在通常情況下, 陽離子載體加入遮蔽體系后轉(zhuǎn)染性能大大降低的不利因素, 為陽離子基因載體的進(jìn)一步應(yīng)用提供了參考.