杜艷平，區(qū)俊文，習文韜，金昭延，楊鵬程

廣州中醫(yī)藥大學祈福醫(yī)院營養(yǎng)科，廣東 廣州 510000

1,2-二甲基肼(DMH)是引起DNA中鳥嘌呤發(fā)生甲基化并誘發(fā)突變的烷化劑，是一種具有較好器官選擇性的常用化學誘癌劑，可被用于誘導大鼠結腸癌。高脂飲食是常見的膳食模式，有Meta分析顯示，尚無充份證據(jù)證明該膳食模式與結腸癌發(fā)生有明顯的相關性[1]。但有研究發(fā)現(xiàn)應用DMH誘發(fā)大鼠結腸癌發(fā)生的過程中，高脂飲食可能介導炎癥進展和細胞增殖，從而影響結腸癌的形成[2]。但高脂飲食與DMH在結腸癌發(fā)生早期，對腸道的作用及機制研究尚未見報道。

腸道正常的生理代謝需要完整的腸道結構，并且腸道的氧化還原系統(tǒng)應處于平衡狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，當腸道的氧化還原狀態(tài)被打破，會產(chǎn)生大量的活性氧基團(ROS)，對腸道產(chǎn)生損害，破壞腸道黏膜細胞和上皮間緊密連接[3]。本研究應用DMH作用于SD(Sprague-Dawley)大鼠，并同步給予高脂飲食，觀察在結腸癌發(fā)生早期，DMH和高脂飲食聯(lián)合對腸道的作用及腸道氧化還原狀態(tài)的改變，探討可能的作用機制，為結腸癌的預防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 30只體質量180~200 g的健康雄性SPF級SD大鼠，購自廣東省醫(yī)學動物實驗中心。DMH購自Sigma公司，總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、總蛋白定量(考馬斯亮藍法)等檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，髓過氧化物酶(MPO)試劑盒購自廈門慧嘉生物。

1.2 動物分組及處理 普通飼料喂養(yǎng)大鼠1周適應環(huán)境后，按體質量進行編號后按照隨機分組的方法分為對照組、DMH組、DMH+高脂組，每組10只。實驗室溫度保持在(20±4)℃，濕度60%~70%。代謝籠飼養(yǎng)大鼠，自由攝食飲水，對照組和DMH組給予普通飼料，DMH+高脂組給予高脂肪飼料，飼料均購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心(普通飼料：能量3.85 kcal/g，其中脂肪供能比10%，碳水化合物70%，蛋白20%；高脂飼料：能量4.73 kcal/g，其中脂肪供能比45%，碳水化合物35%，蛋白20%)。對照組頸部皮下注射滅菌生理鹽水，DMH組和DMH+高脂組大鼠頸部皮下注射0.4%的DMH溶液(無菌生理鹽水配制，NaHCO3調節(jié)pH至6.5~7.0，劑量20 mg/kg)，隔天1次。

實驗第15天，腹腔靜脈采血后處死所有大鼠；距回盲部5 cm分別取10 cm回腸和5 cm結腸，生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干后稱重，計算腸組織濕重(結果以mg/cm表示)，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 觀察指標 實驗期間，觀察大鼠皮毛、眼睛、營養(yǎng)狀況、活動及糞便性狀等，分別于實驗前，實驗第3、6、9、12、15天稱量大鼠體質量。實驗第15天，大鼠處死后觀察腹腔及腸管變化；分別取1 cm回腸和結腸置于10%福爾馬林液中固定及脫水后、常規(guī)石蠟包埋切片、HE染色，40及100倍光學顯微鏡下觀察腸道的病理學特征。

1.4 指標測定 取回腸和結腸組織，稱重后以1:9的比例加入生理鹽水，制備10%的結腸勻漿，參考試劑盒說明檢測T-AOC、MDA、SOD、MPO、NO等指標。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS21.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組計量資料比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般狀況比較 對照組大鼠行動自如，眼睛明亮，毛發(fā)有光澤，大便成形。DMH組和DMH+高脂組大鼠活動量少，眼睛無神，毛發(fā)光澤稍差，大便稀爛不成形；各組大鼠整個實驗過程均無死亡。

實驗前各組大鼠體質量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；從實驗第6天開始，DMH組大鼠體質量明顯低于對照組和DMH+高脂組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但正常組和DMH+高脂組之間的體質量比較差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1不同時間點各組大鼠體質量變化曲線

2.2 各組大鼠腸組織濕重比較 實驗第15天，DMH組和DMH+高脂組大鼠回腸和結腸濕重明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但DMH組和DMH+高脂組大鼠間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠腸組織濕重比較s，mg/cm)

表1 各組大鼠腸組織濕重比較s，mg/cm)

注：與對照組比較，aP<0.05。

對照組DMH組DMH+高脂組F值P值images/BZ_9_207_1608_1203_1672.png10 10 10 47.96±4.69 40.54±4.15a 41.60±5.06a 7.457 0.003 69.25±3.61 63.79±5.07a 62.47±4.96a 6.127 0.006

2.3 各組大鼠腸組織的病理變化 回腸：對照組回腸黏膜未見異常改變，但DMH組、DMH+高脂組的大鼠回腸黏膜絨毛壞死脫落，腸黏膜上皮細胞壞死(圖2)。結腸：對照組結腸黏膜未見異常改變，但DMH組、DMH+高脂組大鼠結腸均可見不同程度炎癥細胞浸潤及上皮壞死(圖3)。

圖2 各組大鼠回腸黏膜的病理變化

圖3各組大鼠結腸黏膜的病理變化

2.4 各組大鼠回腸及結腸的勻漿脂質過氧化水平比較 給予DMH的兩個組大鼠回腸勻漿的T-AOC、MDA、MPO和NO明顯高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中DMH+高脂組的T-AOC、MDA高于DMH組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。給予DMH的兩組大鼠結腸勻漿T-AOC、MDA、MPO和NO明顯高于對照組，而SOD明顯低于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中DMH+高脂組的SOD水平明顯低于DMH組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠不同指標的含量的比較

表2 各組大鼠不同指標的含量的比較

注：與對照比較，aP<0.05；與DMH組比較，bP<0.05。

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3 討論

物質代謝過程中，在腸道有氧的情況下不可避免產(chǎn)生自由基。當DMH作用于腸道時，自由基產(chǎn)生過多，不能及時清除，會導致自由基在腸道的聚集，當達到一定水平后，可對腸道細胞進行攻擊，導致細胞膜的完整性遭到破壞，腸道細胞受損，影響吸收功能。本研究結果發(fā)現(xiàn)，DMH組大鼠的體質量增長緩慢，回腸和結腸濕重均低于對照組，提示DMH損傷腸道功能，從而影響營養(yǎng)物質的吸收。但DMH+高脂組大鼠由于攝入脂肪和總能量較高，體質量增長相對較快，從第6天開始，體質量均高于DMH組大鼠。

研究發(fā)現(xiàn)，應用DMH誘導大鼠結腸癌發(fā)生過程中，結腸癌的發(fā)生與腸道脂質過氧化所致的腸道上皮損傷有關[4]。而我們既往的研究也發(fā)現(xiàn)，DMH導致大鼠結腸組織炎癥細胞浸潤，氧化還原系統(tǒng)失衡，MDA、T-AOC水平升高[5]。本研究結果也進一步驗證了這一結果，給予DMH的兩個組均可見大鼠回腸和結腸損傷，回腸和結腸中T-AOC、MDA、MPO和NO均高于對照組，而結腸中SOD低于對照組，提示腸道氧化還原系統(tǒng)的失衡參與結腸癌早期階段。T-AOC可測量大鼠腸道中各種抗氧化物質和抗氧化酶等構成的總抗氧化水平，腸道的脂質過氧化產(chǎn)物生成過多，可導致T-AOC水平下降，但本研究中，DMH卻導致大鼠腸道組織中T-AOC升高，可能是由于在腸道受損早期代償性增高，具體還有待進一步研究。

膳食模式與結腸癌的關系仍缺乏明確證據(jù)，但有動物實驗發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可增加結腸癌的發(fā)病風險[6]。同時，還有研究發(fā)現(xiàn)，長期攝入高脂飲食可導致小鼠腸組織T-AOC和SOD明顯降低，而ROS和MDA明顯升高，影響腸道消化酶活性，促進DMH誘導大鼠結腸癌的生長[7]。本研究也發(fā)現(xiàn)，與DMH組相比，DMH+高脂組大鼠的回腸MDA升高，提示高脂飲食加重了大鼠小腸所致的氧化應激狀態(tài)，而小腸代償性升高T-AOC水平以減少對腸道的損傷。

氧自由基攻擊腸道及腸道黏膜，可導致脂質過氧化發(fā)生，誘發(fā)腸道損傷，引起MDA水平升高。CZYRKO等[8]發(fā)現(xiàn)隨著腸道組織受損程度的加重，MDA濃度也隨之升高，推測MDA可反映腸道自由基產(chǎn)生和腸道損傷情況。本研究發(fā)現(xiàn)，給予DMH的兩個組大鼠回腸和結腸中MDA含量均升高，其中DMH+高脂組大鼠的回腸組織中MDA含量高于DMH組。提示DMH引起脂質過氧化產(chǎn)物增多，從而導致腸道受損，而高脂飲食則加重這一過程。

腸道擁有對抗自由基的防御系統(tǒng)，包括酶類抗氧化劑，其中較為重要的是SOD，能夠加速超氧陰離子生成O2和H2O2，后者在最終可生成無毒性的H2O分子，SOD活性水平能夠反映ROS的清除能力。本研究結果顯示，給予DMH的兩個組的結腸組織中含量降低，而DMH+高脂組SOD的含量低于DMH組。這提示SOD在結腸組織中起著重要的抗脂質過氧化的作用，腸道消耗過多SOD從而導致其含量下降，也進一步證實了高脂飲食可加重腸道功能損傷。

含鐵溶酶體MPO在特定條件下，能夠催化H2O2和Cl-進行反應轉為次氯酸，強氧化性可導致腸道氧化應激和組織損傷。而NO是典型的帶一未成對電子的自由基，腸組織內(nèi)NO濃度過高的時候，能夠產(chǎn)生細胞毒作用。本研究顯示給予DMH的兩個組大鼠回腸和結腸組織中，MPO和NO均升高，但這兩個組之間的差異無統(tǒng)計學意義，進一步說明DMH可導致腸道自由基產(chǎn)生增多，對腸道造成一定損傷。

綜上所述，DMH導致大鼠回腸和結腸損傷，引起腸道脂質過氧化產(chǎn)物生成增加，破壞腸道的抗氧化酶系統(tǒng)，高脂飲食可加重腸道氧化損傷，在誘發(fā)大鼠結腸癌的過程中起重要作用。