劉 鳳 劉增長(zhǎng)

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重慶 400000)

冠狀動(dòng)脈性心臟病(冠心病)是發(fā)達(dá)國(guó)家首位致死病因。在我國(guó)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及人民生活方式的改變，冠心病發(fā)病率及死亡率居高不下，儼然成為重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。其死亡率超過(guò)腫瘤及其他疾病，位居首位，所以探究有效的冠心病防治方法仍然是我們研究的重中之重。

動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病的主要病理基礎(chǔ)，內(nèi)皮功能受損是動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制中的早期關(guān)鍵事件[2]，而外界刺激產(chǎn)生的過(guò)量活性氧(ROS)將致使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，這是內(nèi)皮功能障礙的主要原因。過(guò)量的ROS產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)抗氧化和促氧化的平衡失調(diào)，進(jìn)而觸發(fā)炎癥信號(hào)的激活及線粒體介導(dǎo)的凋亡，加重動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[3]。過(guò)去的研究指出，清除體內(nèi)過(guò)量的ROS或增強(qiáng)抗氧化能力可能是預(yù)防和治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵點(diǎn)[4]。

茯苓酸是一種從茯苓中提取的三萜類化合物。目前，大量研究證據(jù)表明，茯苓酸具有多種藥理作用，包括止吐、抗炎、抗癌等特性[5]。并且在許多細(xì)胞模型中均表現(xiàn)出抗氧化特性。作為天然活性物質(zhì)，茯苓酸相比于人工合成的化學(xué)藥物具有來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。已有文章報(bào)道多種天然活性物質(zhì)，如丹參素、姜黃素等均能夠通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路對(duì)多種心血管疾病發(fā)揮保護(hù)作用[6,7]。因此將天然活性物質(zhì)應(yīng)用于臨床疾病治療是一種趨勢(shì)。盡管此前已有文獻(xiàn)報(bào)道，茯苓酸可以減輕血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞肥大和凋亡[8]，還可通過(guò)抗炎及抗氧化作用改善膿毒癥引起的急性腎損傷[9]。但此天然活性物質(zhì)對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的影響尚不清楚。故本研究旨在探究茯苓酸對(duì)氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響及其潛在的機(jī)制，以明確其可否通過(guò)改善冠狀動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮損傷，從而具有治療冠心病的潛能。

1 材料與方法

1.1材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)購(gòu)自萊博斯生物技術(shù)有限公司；茯苓酸(Pachymic acid，PA)、CCK-8試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(Solarbio)；總超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)購(gòu)自YiYun Biotechnologies；活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；血紅素加氧酶抑制劑Znpp購(gòu)自美國(guó)APExBIO；Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax抗體均購(gòu)于GeneTex；Cleaved-caspase3購(gòu)于Cell Signaling Technology；RT-PCR中所使用的引物均購(gòu)自上海生工公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于完全RPMI1640培養(yǎng)基中[含10%熱滅活胎牛血清(FBS)、100 μg/ml鏈霉素以及100 U/ml青霉素]，放入5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)密度進(jìn)行換液和傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞約2×105個(gè)/ml接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中,待其生長(zhǎng)狀態(tài)達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求后進(jìn)行分組給藥。

1.2.2藥物制備 將茯苓酸粉末溶于二甲基亞砜(DMSO)中制成茯苓酸儲(chǔ)備溶液(20 mmol/L)，然后在使用前用無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成所需的濃度。并且保證在用于處理細(xì)胞的溶液中DMSO的終濃度不超過(guò)0.1%，以規(guī)避DMSO的細(xì)胞毒性作用。OX-LDL在使用前用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋成所需濃度，在特定的實(shí)驗(yàn)組中，用PA預(yù)處理HUVEC 12 h，然后再暴露于70 μg/ml OX-LDL 24 h[10]。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將細(xì)胞接種到96孔板中，密度為4 000個(gè)/孔，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，用不同濃度(10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L)的茯苓酸預(yù)處理HUVEC 12 h，再暴露于OX-LDL 24 h。處理好細(xì)胞后，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，后將96孔板放回培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。細(xì)胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集處理好的細(xì)胞，用PBS洗3次后加入500 μl PBS重懸細(xì)胞，置于1.5 ml EP管中，每管在避光條件下分別加入5 μl Annexin V及5 μl PI，混勻，于室溫避光條件下反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀(BD Calibur)檢測(cè)凋亡率。

1.2.5ROS含量檢測(cè) 細(xì)胞傳代處理后，將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到90%～95%時(shí)，按照對(duì)照組(未給予任何藥物處理)、70 μg/ml OX-LDL組、70 μg/ml OX-LDL+PA組、PA組處理細(xì)胞，預(yù)先使用PA(10 μmol/L)預(yù)處理HUVEC 12 h，再用70 μg/ml OX-LDL接著處理細(xì)胞24 h后，吸出舊培養(yǎng)基并用PBS清洗2次。向96孔板加入10 μmol/L DCFH-DA，繼續(xù)放在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗3次，置于熒光酶標(biāo)儀中，在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm發(fā)射波長(zhǎng)的條件下檢測(cè)ROS相對(duì)熒光含量。

1.2.6SOD和MDA的檢測(cè) HUVEC根據(jù)相應(yīng)的組別處理好后，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，加入200 μl PBS冰上超聲破碎裂解細(xì)胞，然后再置于4℃離心機(jī)中，12 000 r/min離心10 min。取上清液按照SOD(超氧化物歧化酶)和MDA(丙二醛)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)其活性。

1.2.7RT-PCR檢測(cè)Nrf2/HO-1的mRNA表達(dá)水平 使用RNA快速提取劑盒(上海奕杉生物)提取各處理組細(xì)胞總RNA，并檢測(cè)其濃度。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒嚴(yán)格按照說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Nrf2及HO-1擴(kuò)增引物購(gòu)自Sangon Biotech(上海生工)。引物如下：Nrf2上游TCCAGTCAGAAACCAGTGGAT，Nrf2下游GAATGTCTGCGCCAAAAGCTG；HO-1上游AAGACTGCGTTCCTGC-TCAAC，HO-1下游AAGACTGCGTTCCTGCTCAAC。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Nrf2及HO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8蛋白免疫印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白及Nrf2/HO-1的表達(dá)水平 為了探究PA潛在的作用機(jī)制，我們首先使用HO-1特異性抑制劑Znpp(10 μmol/L)處理細(xì)胞24 h，再用PA預(yù)處理HUVEC 12 h，最后加入70 μg/ml OX-LDL誘導(dǎo)細(xì)胞。收集處理好的細(xì)胞，在細(xì)胞樣品中加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液，收集裂解后蛋白樣品置于4℃離心機(jī)，12 000 r/min離心10 min。吸取上清液，使用BCA試劑盒(北京索萊寶)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。再將上清液與上樣緩沖液混合并煮沸10 min，儲(chǔ)存于-20℃條件下。蛋白樣品采用25 μg上樣量上樣至SDS-PAGE凝膠，恒壓電泳，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉(TBST溶解)室溫下封閉1 h，一抗4℃條件下孵育過(guò)夜。將條帶置于相應(yīng)屬性的二抗中室溫孵育1 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。

2 結(jié)果

2.1PA增加OX-LDL誘導(dǎo)后的HUVEC細(xì)胞活力 PA的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1A所示。與對(duì)照組相比，單獨(dú)使用70 μg/ml OX-LDL誘導(dǎo)HUVEC后，細(xì)胞活力明顯下降，而采用不同濃度(10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L)的PA預(yù)處理HUVEC后，PA濃度<80 μmol/L的組相比OX-LDL處理組，其細(xì)胞活力有所提升，其中10 μmol/L PA預(yù)處理后細(xì)胞活力提高最為顯著(如圖1B)。因此，在隨后的實(shí)驗(yàn)中使用10 μmol/L PA處理細(xì)胞。

圖1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)細(xì)胞活力分析Fig.1 Analysis of cell viability in HUVECNote:A.Chemical structure of PA；B.Effects of differernt concentrations of PA pretreatment on cell viability after OX-LDL induced HUVEC injury.Compared with the control group,##.P<0.01;Compared with OX-LDL group,**.P<0.01.

圖2 PA對(duì)OX-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡的影響Fig.2 Effect of PA on apoptosis of OX-LDL-induced HUVEC Note:A,B.Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of cells in each treatment group after double staining of membrane conjugate protein V/PI.C,D.Expression of apoptosis-related proteins were detected by Western blot.Cont.Control;M.OX-LDL;PA+M.PA+OX-LDL;PA+M+Znpp.PA+OX-LDL+Znpp.Compared with the control group,##.P<0.01,#.P<0.05;Compared with OX-LDL group,**.P<0.01,*.P<0.05;Compared with PA+OX-LDL group,$$.P<0.01,$.P<0.05.

圖4 HUVEC中PA誘導(dǎo)的保護(hù)基因及蛋白的表達(dá)分析Fig.4 Effects of PA on cytoprotective gene and protein expression in HUVEC cellsNote:A,B.The mRNA levels of cytoprotective genes,such as Nrf2 and HO-1 were evaluated using RT-PCR,with GAPDH as an internal control;C,D,E.The expression of Nrf2 and HO-1 in HUVEC were detected by Western blot.Compared with the control group,##.P<0.01;Compared with OX-LDL group,**.P<0.01;Compared with PA+OX-LDL group,$$.P<0.01.

圖3 HUVEC氧化應(yīng)激損傷分析Fig.3 Analysis of oxidative stress damage in HUVECNote:Compared with the control group,##.P<0.01;Compared with OX-LDL group,**.P<0.01.

2.2PA減弱OX-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡 膜聯(lián)蛋白V和PI雙染色是比較常用的檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平的方法，因此采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。與對(duì)照組相比，OX-LDL組的凋亡率明顯升高，PA預(yù)處理則可以顯著降低其凋亡率，而單獨(dú)使用PA處理HUVEC對(duì)其凋亡率無(wú)影響(如圖2A、B)，這表明PA預(yù)處理HUVEC后可以減輕OX-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外，蛋白免疫印跡分析顯示，PA預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)OX-LDL誘導(dǎo)HUVEC后與凋亡正相關(guān)的蛋白Cleaved-caspase3及Bax的上調(diào)，促使細(xì)胞保護(hù)蛋白Bcl-2的表達(dá)增加，而這一作用可以被HO-1特異性抑制劑Znpp(10 μmol/L)消除。這與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致。以上結(jié)果表明PA可以減輕OX-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡，并且這種作用可能與HO-1表達(dá)水平有關(guān)。

2.3PA減輕OX-LDL誘導(dǎo)的HUVEC氧化應(yīng)激損傷 使用活性氧(ROS)特異性熒光染料DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS相對(duì)含量。結(jié)果顯示，OX-LDL誘導(dǎo)HUVEC 24 h后細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增加，PA預(yù)處理可以減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生(如圖3A)。促氧化劑丙二醛(MDA)含量和細(xì)胞內(nèi)ROS水平均能反映細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷程度，故使用MDA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDA含量，其結(jié)果與各處理組ROS水平是相呼應(yīng)的，OX-LDL組與對(duì)照組相比，其細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯增加，PA預(yù)處理能夠降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量(如圖3B)。超氧化物歧化酶(SOD)屬于抗氧化酶，與對(duì)照組相比，OX-LDL組SOD活性明顯下降，而PA預(yù)處理能夠上調(diào)SOD活性(如圖3C)。 結(jié)果顯示，PA預(yù)處理可以改善OX-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激損傷。

2.4PA通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激，減輕OX-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞凋亡 為了探究PA保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷的潛在機(jī)制，使用相應(yīng)藥物處理HUVEC。在PA預(yù)處理12 h后顯著逆轉(zhuǎn)OX-LDL下調(diào)的內(nèi)皮細(xì)胞中Nrf2/HO-1的mRNA水平。同時(shí)我們使用蛋白免疫印跡法檢測(cè)各處理組Nrf2/HO-1的表達(dá)情況(如圖4)。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，OX-LDL處理的HUVEC中Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)水平下降，PA預(yù)處理可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Nrf2及HO-1蛋白的表達(dá)。在使用HO-1特異性抑制劑Znpp后，PA上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1蛋白及mRNA表達(dá)水平的作用則失效。這表明PA可以激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用。

3 討論

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂將導(dǎo)致血流阻塞、心肌缺血，進(jìn)而發(fā)展為一系列惡性心血管事件。嚴(yán)重危害人類健康并給患者帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管臨床上有相當(dāng)多的干預(yù)手段及藥物可減輕危害程度，然而最終的臨床結(jié)果卻不盡人意。故將關(guān)注點(diǎn)放在對(duì)冠心病早期發(fā)病機(jī)制的防治上可能是改善目前狀況的一個(gè)有效方法。本研究旨在探究PA對(duì)OX-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。OX-LDL可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS損害內(nèi)皮細(xì)胞功能。更重要的是，我們研究發(fā)現(xiàn)PA預(yù)處理可通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)途徑抑制氧化應(yīng)激并減少細(xì)胞凋亡，從而有效改善內(nèi)皮細(xì)胞功能。

PA可能是通過(guò)減弱OX-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷進(jìn)一步發(fā)揮抗凋亡作用。最近有研究提出，OX-LDL能夠刺激細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量ROS并上調(diào)黏附分子的表達(dá)將單核細(xì)胞募集到內(nèi)皮下，從而損害內(nèi)皮細(xì)胞的分泌功能并降低其抗氧化能力，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[11]。因此通過(guò)抗氧化劑消除過(guò)量的ROS并提高其抗氧化能力可能是抑制OX-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷的關(guān)鍵方法。我們的研究表明，OX-LDL誘導(dǎo)后的HUVEC細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，引起細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的失衡，表現(xiàn)為抗氧化酶SOD活性降低，促氧化物MDA含量升高，使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。但PA預(yù)處理能夠顯著降低ROS及MDA的產(chǎn)生，并且提升內(nèi)源性抗氧化酶SOD活性。這些結(jié)果表明PA可能是通過(guò)提升細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑濃度來(lái)抑制OX-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷。另有研究報(bào)道稱,高水平的氧化應(yīng)激可干擾線粒體PT孔正常開(kāi)放與關(guān)閉及電子轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。細(xì)胞凋亡主要是由半胱天冬酶(caspase)分子執(zhí)行的細(xì)胞程序性死亡，細(xì)胞內(nèi)Bcl2蛋白家族是caspase活化的中心調(diào)節(jié)因子，其中包括抗凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax[13]。此前有研究者證實(shí)，Bcl-2的上調(diào)和Bax的下調(diào)能夠抑制OX-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡[14]。故我們猜測(cè)在OX-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞損傷模型中是否也有同樣的表現(xiàn)，并進(jìn)一步做了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與過(guò)往研究一致。在本研究中，流式細(xì)胞術(shù)和蛋白免疫印跡結(jié)果均顯示，OX-LDL作用于HUVEC后，細(xì)胞凋亡率明顯增加，且Bcl-2表達(dá)下調(diào)、Bax和Cleaved-caspase3表達(dá)上調(diào)。尤其值得關(guān)注的是，PA預(yù)處理后下調(diào)促凋亡蛋白(Bax、Cleaved-caspase3)的表達(dá)，并上調(diào)抗凋亡蛋白(Bcl-2)的表達(dá)進(jìn)而減弱OX-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果表明OX-LDL引發(fā)HUVEC氧化應(yīng)激損傷后，可進(jìn)一步通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白平衡，觸發(fā)細(xì)胞凋亡，而這一惡性過(guò)程可被PA預(yù)處理所終止。

PA可通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)途徑對(duì)OX-LDL誘導(dǎo)后的HUVEC發(fā)揮保護(hù)作用。Nrf2/HO-1途徑被認(rèn)為是細(xì)胞抗氧化防御的關(guān)鍵機(jī)制。越來(lái)越多研究表明，天然活性產(chǎn)物能通過(guò)激活Nrf2/ARE途徑保護(hù)心血管功能[15]。核因子E-2相關(guān)因子2(Nrf2)是維持氧化還原穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞抗氧化防御的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[16]，能夠通過(guò)抗氧化反應(yīng)元件(ARE)調(diào)節(jié)多種抗氧化劑及Ⅱ期解毒酶的表達(dá)。其中包括血紅素加氧合酶1(HO-1)、醌氧化還原酶(NQO1)、超氧化物歧化酶(SOD)[17]。在Nrf2調(diào)節(jié)的抗氧化劑及Ⅱ期解毒酶中，血紅素加氧合酶(HO-1)被認(rèn)為在動(dòng)脈粥樣硬化性疾病中起關(guān)鍵的保護(hù)作用[18]。HO-1能夠作為抗氧化酶催化促氧化劑血紅素降解產(chǎn)生鐵、一氧化碳(CO)、膽綠素等代謝產(chǎn)物從而發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用。此前有大量研究證實(shí),HO-1的表達(dá)上調(diào)有助于細(xì)胞抵御外界刺激，響應(yīng)于氧化應(yīng)激損傷[19-21]。與此一致，我們?cè)诘鞍缀突驅(qū)用婢l(fā)現(xiàn)PA預(yù)處理12 h后上調(diào)了Nrf2核易位及下游靶標(biāo)HO-1的表達(dá)，表明PA通過(guò)上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Nrf2/HO-1表達(dá)水平而表現(xiàn)出抗氧化活性。此外，在使用HO-1特異性抑制劑Znpp后，消除了PA對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。這證實(shí)PA通過(guò)增加Nrf2核易位及HO-1的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)抗氧化應(yīng)激及抗凋亡作用。

綜上所述，PA作用于HUVEC后通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)途徑發(fā)揮抗凋亡、抗氧化作用，從而改善OX-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，可作為早期抗動(dòng)脈粥樣硬化疾病的潛在藥物。