肖 娟 張華果 陳 潔 牛朝霞 楊紅梅

(河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，鄭州 451191)

肺癌是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，肺癌的發(fā)病率和死亡率一直位居惡性腫瘤譜第一位[1]。小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)約占肺癌發(fā)生率的20%，由于惡性程度高、侵襲性強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移、多數(shù)SCLC患者在確診時已為晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時機(jī)，因此放療和化療成為主要的治療手段。盡管大多數(shù)SCLC患者對初始化療較敏感，但極易產(chǎn)生化療耐藥性，導(dǎo)致治療失敗[2]。因此，逆轉(zhuǎn)化療耐藥性成為目前SCLC治療中亟待解決的問題之一。蓽茇酰胺(piperlongu-mine,PLM)，又名蓽茇明堿，是分離自蓽茇的一種生物堿類化合物。近年研究表明，PLM對前列腺癌、結(jié)腸癌、肺腺癌、肝癌和黑色素瘤等惡性腫瘤具有顯著的抑制作用[3-7]。Wang等[8]研究證實(shí)，PLM可逆轉(zhuǎn)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤耐藥株對長春新堿和卡鉑的耐藥性。但目前國內(nèi)外尚未見PLM對SCLC順鉑(cisplatin,DDP)耐藥性逆轉(zhuǎn)作用的報道。本研究擬通過分子生物學(xué)方法探究PLM對人SCLC耐藥株H446/DDP細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用及其分子機(jī)制。本研究有望為PLM治療SCLC奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和RPMI1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；PLM和DDP購自美國Selleck公司；CCK-8試劑盒購自武漢博士德生物公司；AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解液和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistance associated protein 1,MRP1)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1(glutathione S transferase P1,GSTP1)、Survivin、細(xì)胞周期蛋白A(cyclin A)、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶2(cyclin dependent kinase 1,CDK1)和β-actin單克隆抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)；每2 d換液1次，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%時進(jìn)行傳代。

1.2.2建立耐藥株H446/DDP細(xì)胞 取對數(shù)生長期的H446細(xì)胞，加入含0.1 mg/L DDP的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，更換為不含DDP的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞恢復(fù)生長后重復(fù)上述處理，若細(xì)胞能在該濃度下穩(wěn)定生長，則逐步提高DDP濃度，每次提高約50%，直至細(xì)胞可在含有1 mg/L DDP的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長，將此耐藥細(xì)胞株命名為H446/DDP。

1.2.3細(xì)胞活力檢測與藥物聯(lián)合效用評價 將H446細(xì)胞和H446/DDP細(xì)胞以每孔5 000個接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h，分別加入不同劑量PLM和DDP，同時設(shè)空白組和對照組，每組設(shè)5個復(fù)孔，孵育24 h；每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育1 h，用酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測各孔吸光度A值；計算細(xì)胞活力(cell viability)，細(xì)胞活力=(加藥組A值-調(diào)零組A值)/(對照組A值-調(diào)零組A值)×100%；使用SPSS16.0軟件計算藥物的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)，并計算出耐藥倍數(shù)與逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，耐藥倍數(shù)=耐藥細(xì)胞IC50/敏感細(xì)胞IC50，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=耐藥細(xì)胞IC50/PLM作用下IC50；使用CompuSyn軟件計算出在不同抑制效應(yīng)(fraction affected,Fa)下的藥物聯(lián)合指數(shù)(combination index,CI)，并繪制出Fa-CI曲線。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期H446/DDP細(xì)胞，將其分為對照組、DDP組、PLM組和DDP+PLM組，其中DDP和PLM的終濃度分別為6 mg/L和2 mg/L；藥物處理24 h后，收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次，用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個/ml，取200 μl細(xì)胞懸液，加入5 μl AnnexinV-FITC和10 μl碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液，輕輕混勻，4℃避光孵育15 min，送流式細(xì)胞儀分析檢測。

1.2.5細(xì)胞周期檢測 細(xì)胞分組同1.2.4段，收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入1 ml 冰預(yù)冷的75%乙醇，-20℃固定2 h，PBS洗滌2次，加入PI染色液，室溫避光孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.6Western印跡法檢測蛋白水平 用不同劑量 PLM(0、2、4 mg/L)處理H446/DDP細(xì)胞24 h后，收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰上孵育15 min，4℃下12 000 g離心30 min后取上清，用紫外分光光度法檢測樣品蛋白濃度，取25 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜2次，加入一抗(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗(1∶2 000 稀釋)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL進(jìn)行曝光反應(yīng)，顯影，拍照，使用ImageJ 1.45s軟件分析目標(biāo)蛋白的相對灰度值。

2 結(jié)果

2.1耐藥前后相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化 如圖1所示，與親代H446細(xì)胞相比，耐藥株H446/DDP細(xì)胞中P-gp、MRP1、GSTP1和Survivin蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。這提示H446細(xì)胞順鉑耐藥性的產(chǎn)生可能與P-gp、MRP1、GSTP1和Survivin蛋白的高表達(dá)有關(guān)。

2.2PLM與DDP對細(xì)胞活力的影響 如圖2所示，與對照組相比，經(jīng)不同劑量PLM和DDP處理24 h 后， H446和H446/DDP細(xì)胞活力均顯著下降(P<0.05)，且隨藥物劑量的增加呈下降趨勢；DDP對H446和H446/DDP細(xì)胞的IC50分別為1.21 mg/L和13.76 mg/L，PLM對H446/DDP細(xì)胞的IC50為6.29 mg/L；當(dāng)PLM與DDP按1∶3濃度比聯(lián)用時，IC50為7.28 mg/L(其中DDP的濃度為5.46 mg/L)；H446/DDP細(xì)胞的耐藥倍數(shù)為11.37， PLM對H446/DDP細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.52。這表明PLM可增強(qiáng)DDP對H446/DDP細(xì)胞的抑制作用。

圖1 H446和H446/DDP細(xì)胞中P-gp、MRP1、GSTP1和Survivin蛋白的表達(dá)Fig.1 Protein levels of P-gp,MRP1,GSTP1 and Survivin in H446 and H446/DDP cellsNote:A.Western blot analysis;B.Statistical analysis;*.P<0.05 versus H446 group.

圖2 PLM與DDP對H446和H446/DDP細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect of PLM and DDP on cell viability in H446 and H446/DDP cellsNote:A.H446 cells;B.H446/DDP cells.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus the same concentration DDP group.

2.3PLM與DDP聯(lián)合效應(yīng)分析 Chou-Talalay中效分析法結(jié)果顯示，在不同抑制效應(yīng)Fa值下，聯(lián)合指數(shù)CI值均小于1，這說明PLM與DDP聯(lián)用可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，見圖3。

2.4PLM與DDP對細(xì)胞凋亡的影響 如圖4所示，與對照組相比，PLM組、DDP組和DDP+PLM組細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)；同時，DDP+PLM組細(xì)胞凋亡率顯著高于DDP組(P<0.05)。這表明PLM可協(xié)同增強(qiáng)DDP誘導(dǎo)的H446/DDP細(xì)胞凋亡。

圖3 抑制效應(yīng)-聯(lián)合指數(shù)曲線Fig.3 Graph of fraction affected(Fa)and combination index(CI)

圖4 PLM和DDP對H446/DDP細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of PLM and DDP on apoptosis of H446/DDP cellsNote:A.Apoptosis detection;B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus DDP group.

圖5 PLM和DDP對H446/DDP細(xì)胞周期的影響Fig.5 Effect of PLM and DDP on cell cycle of H446/DDP cellsNote:A.Cell cycle detection;B.Statistica analys.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus DDP group.

圖6 PLM對H446/DDP細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of PLM on expression levels of resistance-related proteins in H446/DDP cellsNote:A.Western blot analysis;B.Statistica analysis.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus 2 mg/L group.

2.5PLM與DDP對細(xì)胞周期的影響 如圖5所示，與對照組相比，PLM組、DDP組和DDP+PLM組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)，S期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)；與DDP組相比，DDP+PLM組G0/G1期細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05)，S期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)。這表明DDP和PLM可誘導(dǎo)H446/DDP細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，且二者聯(lián)用效應(yīng)更強(qiáng)。

2.6PLM對相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 如圖6所示，與對照組相比，經(jīng)2 mg/L或4 mg/L PLM處理24 h后， H446/DDP細(xì)胞中P-gp、MRP1、GSTP1、Survivin、Cyclin A和CDK2蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)，且隨PLM劑量的增加呈下降趨勢。

3 討論

化療是治療中晚期惡性腫瘤患者的重要手段之一，然而耐藥性的產(chǎn)生嚴(yán)重制約了化療的效果，甚至導(dǎo)致化療失敗。肺癌化療耐藥性的形成是一個多因素參與的復(fù)雜過程，涉及細(xì)胞內(nèi)化療藥物的代謝與積累，以及抗凋亡能力等方面。下調(diào)P-gp和MRP1蛋白表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞對DDP的外排作用，從而逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞對DDP的耐藥性[9,10]。而上調(diào)GSTP1和Survivin蛋白表達(dá)可減弱DDP對肺癌細(xì)胞的殺傷作用[11,12]。本研究結(jié)果顯示，耐藥株H446/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥倍數(shù)為11.37，其P-gp、MRP1、GSTP1和Survivin蛋白表達(dá)水平也均顯著高于親代H446細(xì)胞。這表明上述蛋白可能在H446細(xì)胞獲得DDP耐藥性的過程中發(fā)揮著重要作用。

PLM是一種提取自胡椒科植物蓽茇的生物堿類化合物，具有抗血小板凝集、抗阿爾茲海默病、抗血小板聚集、抗炎、抗抑郁和鎮(zhèn)痛等藥理學(xué)作用[13-16]。近年來PLM的抗腫瘤作用逐漸成為研究的熱點(diǎn)。PLM可通過引發(fā)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡[3]，也可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[4]，還可通過下調(diào)P-gp、MRP1和ABCG2蛋白表達(dá)逆轉(zhuǎn)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤耐藥株HXO-RB44/VCR和SO-Rb50/CBP細(xì)胞耐藥性[8]。本研究結(jié)果表明，PLM可協(xié)同增強(qiáng)DDP對H446/DDP細(xì)胞的殺傷作用，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.52。

腫瘤細(xì)胞可通過ATP 結(jié)合盒(ATP-binding cassette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將化療藥物外排至細(xì)胞外，使腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物含量降低，最終導(dǎo)致多藥耐藥性。P-gp和MDR1為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的重要成員。Fang等[10]研究顯示，抑制STAT3活化可下調(diào)肺癌耐藥株A549/DDP細(xì)胞中MDR1和MRP1基因表達(dá)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)其耐藥性。吳秋歌等[17]研究證實(shí)，抑制P-gp表達(dá)可提高H446細(xì)胞對DDP的敏感性。Zhao等[18]研究顯示，SCLC耐藥株H69/DDP細(xì)胞中MDR1蛋白表達(dá)顯著升高。本研究結(jié)果表明，PLM可劑量依賴性地下調(diào)H446/DDP細(xì)胞中P-gp和MRP1的蛋白表達(dá)水平，這可能是PLM逆轉(zhuǎn)H446/DDP細(xì)胞耐藥性的機(jī)制之一。

GSTP1可催化谷胱甘肽與DDP的結(jié)合反應(yīng)，使后者無法進(jìn)入細(xì)胞核與靶點(diǎn)DNA結(jié)合，從而降低腫瘤細(xì)胞對DDP的敏感性[19]。Survivin為目前發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子，在肺癌細(xì)胞DDP耐藥性的形成過程中發(fā)揮著重要作用[11]。Wu等[20]研究顯示，下調(diào)GSTP1蛋白表達(dá)可增強(qiáng)H446/DDP對DDP的敏感性。Tang等[11]研究證實(shí)，H446/DDP細(xì)胞中Survivin蛋白呈高表達(dá)，抑制PI3K/Akt1通路可下調(diào)Survivin蛋白，繼而逆轉(zhuǎn)其DDP耐藥性。本研究表明，PLM可劑量依賴性地下調(diào)H446/DDP細(xì)胞中GSTP1和Survivin的蛋白表達(dá)水平。

Song等[3]研究證實(shí)，PLM可上調(diào)人黑色素瘤A375和A875細(xì)胞中p21和p27蛋白表達(dá)，導(dǎo)致其發(fā)生G2/M期阻滯。Wang等[8]研究顯示，PLM可通過下調(diào)CDK1蛋白表達(dá)阻滯人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞于G0/G1期和G2/M期。而下調(diào)Cyclin A和CDK2表達(dá)會使腫瘤細(xì)胞阻滯于S期，從而引起腫瘤細(xì)胞凋亡[21,22]。本研究證實(shí)，PLM可劑量依賴性地下調(diào)Cyclin A和CDK2蛋白表達(dá)，并與DDP協(xié)同阻滯H446/DDP細(xì)胞于S期。

綜上所述，PLM可在體外逆轉(zhuǎn)人小細(xì)胞肺癌耐藥株H446/DDP細(xì)胞耐藥性，這可能與其下調(diào)P-gp、MRP1、GSTP1、Survivin、Cyclin A和CDK2蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而增強(qiáng)DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和S期阻滯有關(guān)。