趙云霞 牛 波

近年來乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，發(fā)病率排在女性惡性腫瘤的首位[1-2]。其最主要的治療手段依然是外科手術和化療[3]。但是，腫瘤細胞耐藥的出現(xiàn)嚴重影響了乳腺癌治療效果[4]。因此，探究乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找新的生物治療靶點依然是目前亟待解決的重大課題[5]。

長鏈非編碼RNAs(Long non-coding RNAs，lncRNAs)是指轉錄長度大于200個核苷酸并且不翻譯成蛋白質的功能性RNA分子。lncRNA與人類健康和疾病密切相關[6-8]。大量研究表明lncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要功能，lncRNA與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關[9-10]。目前已鑒定出HOTAIR、FBXL19-AS1、H19等乳腺癌相關lncRNA[11-12]。成神經細胞瘤相關轉錄本1(Neuroblastoma associated transcript 1，NBAT1)是一種腫瘤抑制基因，其表達缺失與成神經細胞瘤增殖能力密切相關[13]。近期發(fā)現(xiàn)，NBAT1也在骨肉瘤、腦膠質瘤、肺癌細胞的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[14-16]。但是，關于lncRNA NBAT1在乳腺腫瘤中的作用機制尚不十分清楚，本研究將重點探討其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人正常乳腺上皮細胞系MCF-10A，人乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7購自中國科學院細胞庫；mimics miR-3664-5p和ASO-miR-3664-5p及其對照購自上海吉瑪制藥技術有限公司；過表達質粒載體(pcDNA3-NBAT1)和對照質粒載體(pcDNA3-NC)購自天津賽爾生物技術有限公司；MCF-10A專用DMEM/F12培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司；RT及PCR引物均由金唯智公司合成，miR-3664-5p的RT引物序列為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACACTCATG-3′；U6的RT引物序列為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAA TATGGAAC-3′；NBAT1上游序列為5′-CTCCACCCATTTGTAAGC-3′，下游序列為5′-AATACCCATGAGTCCATAC-3′；GAPDH的上游序列為5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游序列為5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′；miR-3664-5p的上游序列為5′-TGCGGAACTCTGTCTTCACTCATG-3′，U6上游序列為5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，miR-3664-5p和U6的下游均為5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.2 細胞培養(yǎng)及其轉染

細胞系MCF-10A置于含5%馬血清，10 μg/mL胰島素，20 ng/mL表皮生長因子，100 ng/mL霍亂毒素，0.5 μg/mL氫化可的松的DMEM/F12專用培養(yǎng)基中，人乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7均置于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。選擇對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好，表達lncRNA NBAT1最低的MCF-7細胞用于后續(xù)轉染實驗。當MCF-7細胞融合至70%～80%時，pc-NC組和pc-NBAT1組分別轉染pcDNA3-NC載體和pcDNA3-NBAT1載體， pc-NC+mimics NC組、pc-NBAT1+mimics NC組及pc-NBAT1+mimics miR-3664-5p組分別轉染pcDNA3-NC+mimics NC、pcDNA3-NBAT1+mimics NC及pcDNA3-NBAT1+mimics miR-3664-5p，轉染均按照脂質體Lipo8000TM說明書進行。

1.3 RNA提取，逆轉錄及實時熒光定量PCR

收集MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7常規(guī)培養(yǎng)細胞，及MCF-7細胞pc-NC組和pc-NBAT1組轉染后48 h細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA，經NanoDrop分析儀檢測，OD260/OD280為1.8～2.0。根據(jù)逆轉錄試劑盒說明書將總RNA逆轉錄為cDNA。NBAT1的定量檢測以GAPDH為內參，miR-3664-5p的定量檢測以U6為內參，均采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.4 Western blot法檢測Caspase 9蛋白表達

收集MCF-7細胞pc-NC組、pc-NBAT1組轉染后48 h細胞，用RIPA裂解細胞，提取細胞中的總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取各組蛋白樣品30 μg進行SDS-PAGE電泳，用PVDF轉膜，加入Caspase 9以及GAPDH一抗(1∶1 000)孵育過夜，加入HRP標記的二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌后，在ECL發(fā)光液下顯影，用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)曝光并對圖像進行分析。

1.5 雙熒光素酶報告驗證

采用美國Promega公司的pmirGLO雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，分別化學合成lncRNA NBAT1、Caspase 9的3′UTR區(qū)與miR-3664-5p的結合位點序列片段，并插入 pmirGLO luciferase表達載體中，獲得野生型載體pmirGLO/NBAT1和pmirGLO/Caspase 9-UTR，同樣的方法合成突變序列，獲得突變型載體pmirGLO/NBAT1-m和pmirGLO/Caspase 9-mUTR，將pmirGLO/NBAT1和pmirGLO/Caspase 9-UTR野生型載體、pmirGLO/NBAT1-m和pmirGLO/Caspase 9-mUTR突變型載體、mimics miR-3664-5p模擬物或者反義核酸ASO-miR-3664-5p及陰性對照組分別與Lipo8000TM 脂質體混合后轉染293T細胞，轉染48 h后，收集細胞。按照雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書，并以海腎熒光值作為內參。計算螢火蟲熒光值與海腎熒光值的比值，評估報告基因在細胞中的相對活力。

1.6 CCK-8檢測細胞增殖能力

MCF-7細胞接種至96孔板中，每孔細胞數(shù)為5×103個。pc-NC組、pc-NBAT1組或pc-NC+mimics NC組、pc-NBAT1+mimics NC組及pc-NBAT1+mimics miR-3664-5p組轉染24 h、48 h、72 h、96 h、118 h后，每孔中同時加入90 μL新鮮的含10%胎牛血清的培養(yǎng)液和10 μL的CCK-8溶液，然后置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中反應4 h。用免疫酶標儀測定各孔在450 nm 處的吸光度OD值，以各組平均值反映細胞增殖能力。

1.7 平板克隆分析

pc-NC組、pc-NBAT1組或pc-NC+mimics NC組、pc-NBAT1+mimics NC組及pc-NBAT1+mimics miR-3664-5p組轉染24 h后，200個細胞/孔接種于12孔板，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2天換液1次。15天后，棄去培養(yǎng)基，甲醇固定20 min后，每孔加入400 μL的1%結晶紫染色液，室溫染色10 min，水漂洗5 min，觀察實驗結果。

1.8 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 lncRNA NBAT1的表達量

通過在線軟件Starbase分析TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)lncRNA NBAT1在1 104例乳腺癌組織中的表達量顯著低于其在113例正常乳腺組織中的表達量(P<0.001)(圖1A)。lncRNA NBAT1在正常對照細胞株MCF-10A細胞中表達量最高，在MDA-MB-231和MDA-MB-453細胞中其表達量比MCF-10A低(P<0.001)，在MCF-7細胞中其表達量最低(P<0.001)(圖1B)。

2.2 生物信息學預測lncRNA NBAT1、miR-3664-5p、Caspase 9三者的關系及雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證

運用Targetscan數(shù)據(jù)庫進行了生物信息學分析，預測miR-3664-5p和lncRNA NBAT1及Caspase 9的結合位點(圖2A、2B)。并使用pmirGLO雙熒光素酶報告系統(tǒng)進行了進一步驗證，檢測結果顯示，mimics miR-3664-5p能夠抑制熒光素酶表達(P<0.001)，ASO-miR-3664-5p能夠促進熒光素酶表達(P<0.001)，但是當miR-3664-5p結合位點突變后，抑制和促進作用均消失(圖2C、2D)，進一步證明lncRNA NBAT1可以吸附miR-3664-5p，同時Caspase 9是miR-3664-5p的靶基因。

2.3 過表達lncRNA NBAT1對MCF-7中miR-3664-5和Caspase 9表達的影響

lncRNA NBAT1過表達載體pcDNA3-NBAT1和對照載體pcDNA3-NC分別轉染乳腺癌細胞株MCF-7，qPCR方法檢測pc-NBAT1組lncRNA NBAT1的表達較pc-NC組增高(P<0.001)；qPCR檢測pc-NBAT1組miR-3664-5的表達較pc-NC組降低(P<0.001)；Western blot檢測pc-NBAT1組Caspase 9蛋白的表達較pc-NC組增高(P<0.001)(圖3)。

2.4 CCK-8和克隆形成檢測細胞的增殖能力

CCK-8和克隆形成檢測過表達lncRNA NBAT1后細胞的增殖能力降低；如果同時將lncRNA NBAT1過表達載體和mimics miR-3664-5p轉染MCF-7細胞，觀察發(fā)現(xiàn)miR-3664-5p過表達能夠緩解過表達lncRNA NBAT1對細胞增殖的抑制效應(圖4)。

圖1 lncRNA NBAT1在組織和細胞系中的相對表達量Figure 1 The expression of lncRNA NBAT1 in breast tissues and breast cell linesNote：A.The expression of lncRNA NBAT1 in breast cancer and normal tissues；B.The expression of lncRNA NBAT1 in breast cancer cell lines and normal cell line.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，when compared with the MCF-10A group(n=3).

圖2 lncRNA NBAT1、miR-3664-5p、Caspase 9三者的靶定關系的預測及驗證Figure 2 The predicted binding sites of miR-3664-5p in lncRNA NBAT1 and Caspase 9 by the dual-luciferase reporter systemNote：A.The predicted binding sites of miR-3664-5p in lncRNA NBAT1 and lncRNA NBAT1 mutant sequences；B.The predicted binding sites of miR-3664-5p in Caspase 9-UTR and Caspase 9-mUTR sequences；C.Dual-luciferase reporter analysis for the miR-3664-5p binding to lncRNA NBAT1；D.Dual-luciferase reporter analysis to confirm that the Caspase 9 was a target-gene of miR-3664-5p.***P<0.001，when compared with the mimics NC group(n=3).

圖3 MCF-7細胞過表達NBAT1后對miR-3664-5和caspase9表達的影響Figure 3 The effect of lncRNA NBAT1 on the expression of miR-3664-5 and Caspase 9Note：A.qPCR analysis for the relative expression of lncRNA NBAT1 in MCF-7 cells transfected with pcDNA3-NBAT1 and pcDNA3-NC plasmids；B.qPCR analysis for the relative expression of miR-3664-5p in MCF-7 cells transfected with pcDNA3-NBAT1 and pcDNA3-NC plasmids；C.Western blot analysis for the relative protein expression of Caspase 9 in MCF-7 cells transfected with pcDNA3-NBAT1 and pcDNA3-NC plasmids.***P<0.001，when compared with the pc-NC group(n=3).

圖4 CCK8和克隆形成實驗檢測lncRNA NBAT1對MCF-7細胞的增殖能力影響Figure 4 The effects of lncRNA NBAT1 on proliferation of MCF-7 cells by CCK-8 and colony formating assaysNote：A.The effect of lncRNA NBAT1 on proliferation of MCF-7 cells by CCK8 assay；B.The effect of lncRNA NBAT1 on proliferation of MCF-7 cells by colony formating assay；C.CCK-8 assay for the rescue effect of miR-3664-5p on the proliferation of MCF-7 with lncRNA NBAT1 overexpression；D.Colony formation assay for the rescue effect of miR-3664-5p on the proliferation of MCF-7 with lncRNA NBAT1′s overexpression.***P<0.001，when compared with the pc-NC group(n=3).

3 討論

lncRNA是一類長度大于200個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA，lncRNA可以通過染色質重塑、轉錄調控以及轉錄后調控等方式參與機體的表觀遺傳調控。lncRNA參與了細胞增殖分化、神經發(fā)育、免疫穩(wěn)態(tài)、腫瘤發(fā)生等生命過程[6]。lncRNA在乳腺癌的研究有許多進展，lncRNA FBXL19-AS1在乳腺癌中高表達，通過抑制has-miR-718，促進乳腺癌細胞的增殖和侵襲[11]。lncRNA-PANDAR在乳腺癌組織及細胞系中高表達，可以抑制p16的表達，促進乳腺癌細胞的增殖[17]。lncRNA NBAT1在乳腺癌中的作用并不清楚，研究其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，將有助于更加全面地了解乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機制。

在本研究中，通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中l(wèi)ncRNA NBAT1的表達分析比較，發(fā)現(xiàn)lncRNA NBAT1低表達于乳腺癌組織當中。lncRNA NBAT1可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程具有一定的調控作用。為進一步探討lncRNA NBAT1在乳腺癌細胞中的生物學功能，本研究應用重組質粒在乳腺癌MCF-7細胞中特異性過表達lncRNA NBAT1，通過CCK-8和克隆形成實驗進一步證實，過表達lncRNA NBAT1對MCF-7細胞增殖能力有明顯抑制作用。lncRNA的作用機制較為復雜，其中一種重要機制即是作為分子海綿與microRNA結合進而抑制其對下游相應靶mRNA的沉默效應。通過Targetscan在線生物信息學網站的檢索表明，miR-3664-5p可能是lncRNA NBAT1的結合分子之一。綜上可推測，lncRNA NBAT1的抗乳腺癌細胞增殖作用可能是通過吸附miR-3664-5p的來實現(xiàn)的。為證實這一假說，本研究通過過表達MCF-7細胞內lncRNA NBAT1，采用RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，過表達lncRNA NBAT1可明顯抑制MCF-7細胞內miR-3664-5p的表達水平。Targetscan在線預測網站分析表明Caspase 9基因是miR-3664-5p的下游抑制靶點。Caspase 9是內源性凋亡通路中關鍵蛋白酶，處在凋亡相關基因Caspase頂端[18]。Caspase 9可以激活細胞凋亡途徑中的最關鍵酶Caspase 3，從而促進細胞的凋亡。因此，它的活化對于整個內源性凋亡通路的激活尤為重要。通過進一步研究發(fā)現(xiàn)，在過表達lncRNA NBAT1后MCF-7細胞內Caspase 9的表達水平也有所提高，細胞增殖受到明顯抑制。至此，本研究初步表明lncRNA NBAT1的作用機制是通過吸附miR-3664-5p發(fā)揮作用，進而釋放對Caspase 9的抑制作用而實現(xiàn)的。同時通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)進一步驗證miR-3664-5p和Caspase 9的靶向關系。

綜上所述，lncRNA NBAT1在乳腺癌組織中表達降低，主要通過減少miR-3664-5p的吸附，進而抑制Caspase 9的表達而促進了乳腺癌細胞的增殖。lncRNA NBAT1作為與乳腺癌密切相關的新分子，有可能成為乳腺癌治療的潛在靶點。