樂(lè)煒，王超，鄧波，章永

咸寧市中心醫(yī)院，湖北咸寧437000

肝癌發(fā)病率在癌癥中排名第六，致死率排名第三[1]。據(jù)報(bào)道，全球每年肝癌死亡患者超過(guò)70萬(wàn)人，其中約50%發(fā)生在中國(guó)，嚴(yán)重危害了我國(guó)公民的身體健康[2]。手術(shù)切除和化療是臨床治療肝癌的主要手段，但由于肝癌局部復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、耐藥性及化療藥物的不良反應(yīng)嚴(yán)重影響了療效[3]。因此尋找安全有效的抗腫瘤藥物及治療方案是目前研究的重點(diǎn)。研究顯示，木犀草素(Lut)具有抗炎、抗氧化、心血管保護(hù)等作用[4～6]，且Lut也是一種有效的腫瘤防治劑，對(duì)肝癌、乳腺癌和結(jié)腸癌均有顯著抑制作用[5,7]。白藜蘆醇(Res)是一種普遍存在于藜蘆、葡萄和花生等植物中的非黃酮類多酚化合物，具有心血管保護(hù)和改善代謝的作用[8,9]，其通過(guò)作用于不同的信號(hào)通路，對(duì)前列腺癌、乳腺癌、肺癌等癌癥發(fā)揮抑制作用，具有較好的抗腫瘤活性[10]。Lut和Res對(duì)細(xì)胞內(nèi)過(guò)度激活的核因子κB(NF-κB)均有抑制作用，但Lut和Res是否通過(guò)抑制NF-κB表達(dá)發(fā)揮抑制肝癌的作用，目前鮮見(jiàn)報(bào)道。2018年7月～2019年2月，本研究對(duì)此做了探討。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞(HepG2)、人正常肝細(xì)胞(LO2)分別購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)、中科院上海細(xì)胞庫(kù)。Res(溶于DMSO，母液濃度為50 mmol/L)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Lut(溶于DMSO，母液濃度為40 mmol/L) 購(gòu)自美國(guó)MCE公司；索拉非尼購(gòu)自美國(guó)Adooq公司；MTT和DAPI購(gòu)自上海Beyotime公司；FBS和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；DMSO購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；NF-κB、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、Bcl-2聯(lián)接X(jué)蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；β-actin和GAPDH購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；ECL購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

1.2 HepG2、LO2細(xì)胞培養(yǎng) HepG2、LO2細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS和雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況定時(shí)換液和傳代。

1.3 藥物處理 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2、LO2細(xì)胞以1×105/mL接種于96孔板、24孔板、6孔板和T25細(xì)胞瓶中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至60%～80%，將培養(yǎng)基更換為含(終濃度0、5、10、20 μmol/L)Lut、(0、12.5、25、50 μmol/L)Res及5 μmol/L Lut+12.5 μmol/L Res、5 μmol/L Lut+25 μmol/L Res、5 μmol/L Lut+50 μmol/L Res、10 μmol/L Lut+12.5 μmol/L Res、10 μmol/L Lut+25 μmol/L Res、10 μmol/L Lut+50 μmol/L Res、20 μmol/L Lut+12.5 μmol/L Res、20 μmol/L Lut+25 μmol/L Res、20 μmol/L Lut+50 μmol/L Res、10 μmol/L索拉非尼的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè) 采用MTT實(shí)驗(yàn)。藥物處理結(jié)束后，于96孔板中每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT母液10 μL，37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD)值，用空白孔校準(zhǔn)。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率，細(xì)胞相對(duì)存活率=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

1.5 細(xì)胞形態(tài)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2、LO2細(xì)胞，以1×105/mL的接種于6孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)融合80%時(shí)，分別給予20 μmol/L Lut、25 μmol/L Res、20 μmol/L Lut+25 μmol/L Res處理24 h。于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)及形態(tài)變化。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用DAPI染色法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2、LO2細(xì)胞，以1×105/mL的接種于6孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至融合80%時(shí)，分別給予20 μmol/L Lut、25 μmol/L Res、20 μmol/L Lut+25 μmol/L Res處理24 h。藥物處理結(jié)束后，吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌5 min×3次，4%多聚甲醛室溫固定15 mim，PBS洗滌5 min×3次，DAPI室溫染色5 min，PBS洗5 min×3次，洗滌結(jié)束后，Zeiss倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。

1.7 NF-κB入核情況觀察 采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)。藥物處理結(jié)束后，吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌5 min×3次，4%多聚甲醛室溫固定15 mim，PBS洗滌5 min ×3次，0.5% Triton X-100室溫透膜3～5 min，PBS洗5 min×3次，5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗5 min ×3次，Alexa Fluor 594標(biāo)記的熒光二抗室溫孵育1 h，PBS洗5 min×3次，DAPI室溫復(fù)染5 min，PBS洗5 min×3次，洗滌結(jié)束后，用眼科彎鑷輕輕將孔板內(nèi)爬片取出，抗熒光淬滅劑和指甲油封固，OLYMPUS正置熒光顯微鏡拍照，觀察NF-κB的入核情況。

1.8 細(xì)胞內(nèi)NF-κB及凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase-3)表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。藥物處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，RIPA強(qiáng)裂解液冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，BCA法測(cè)定樣本中蛋白含量。用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%BSA室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗5 min×3次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h，TBST洗5 min×3次，用ECL顯色液顯色。用Image J進(jìn)行半定量分析。蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白電泳條帶灰度值/內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值。

1.9 細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase-3)mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用qRT-PCR技術(shù)。藥物處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，用TRIzol(Invitrogen公司，美國(guó))提取細(xì)胞總RNA，NanoDrop 1000測(cè)定RNA濃度(A260/A280為1.8～2.0)，逆轉(zhuǎn)錄參照TaKaRa RT-PCR說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。RT-PCR引物序列由Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成，NF-κB上游引物序列5′-CTGTCTTGTGGACAACGCAGTGGAATTTTAGG-3′，下游引物序列5′-CACTTATGGACAACTATGAGGTCTCTGG-3′；Bcl-2上游引物序列5′-CAGATGCCGGTTCAGGTACTCAGTC-3′，下游引物序列5′-CTCGTCGCTACCGTCGTGACTTGG-3′；Bax上游引物序列5′-CAGATGCCGGTTCAGGTACTCAGTC-3′，下游引物序列5′-AAGCTGAGCGAGTGTCTCCGGCG-3′；Caspase-3上游引物序列5′-GCATACTGTTTCAGCATGGCA-3′，下游引物序列5′-CAAACTTTTTCAGAGGGGATCG-3′；GAPDH上游引物序列5′-AGCCTTCTCCATGGTCGTGA-3′，下游引物序列5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTC-3。使用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系10 μL(cDNA 2 μL、引物3 μL、SYBR 5 μL)，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃ 4 s、60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。以GAPDH作為內(nèi)參。目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 Lut、Res對(duì)HepG2、LO2細(xì)胞活力的影響 0、5、10、20 μmol/L Lut處理后HepG2細(xì)胞相對(duì)存活率分別為(100.00±4.05)%、(93.50±4.23)%、(88.33±4.84)%、(79.00±6.20)%，LO2細(xì)胞相對(duì)存活率分別為(100.00±4.94)%、(99.17±7.11)%、(97.17±3.13)%、(96.00±5.83)%；0、12.5、25、50 μmol/L Res處理后HepG2細(xì)胞相對(duì)存活率分別為(100.00±4.05)%、(93.17±6.18)%、(84.33±6.06)%、(73.83±4.88)%，LO2細(xì)胞相對(duì)存活率分別為(98.83±4.02)%、(96.67±3.88)%、(96.93±4.96)%；5 μmol/L Lut+12.5、25、50 μmol/L Res處理后HepG2細(xì)胞相對(duì)存活率分別為(80.33±5.50)%、(74.67±4.89)%、(66.83±5.56)%，LO2細(xì)胞相對(duì)存活率分別為(96.67±4.50)%、(95.46±4.73)%、(97.67±3.88)%；10 μmol/L+12.5、25、50 μmol/L Res處理后HepG2細(xì)胞相對(duì)存活率分別為(78.33±5.39)%、(68.17±7.22)%、(60.17±3.31)%，LO2細(xì)胞相對(duì)存活率分別為(96.83±4.54)%、(95.67± 4.37)%、(98.66±7.20)%；20 μmol/L Lut+12.5、25、50 μmol/L Res處理后HepG2細(xì)胞相對(duì)存活率分別為(75.17±5.00)%、(45.83±4.92)%、(47.17±6.31)%，LO2細(xì)胞相對(duì)存活率分別為(95.33±5.68)%、(95.31±4.73)%、(95.67±4.18)%。索拉非尼處理后HepG2、LO2細(xì)胞相對(duì)存活率分別為(49.33±6.12)%、(76.34±7.17)%。與未處理的細(xì)胞相比，分別經(jīng)10、20 μmol/L Lut及25、50 μmol/L Res單獨(dú)處理后HepG2細(xì)胞相對(duì)存活率低(P均<0.05)；Lut與Res聯(lián)合處理24 h后HepG2細(xì)胞相對(duì)存活率低(P均<0.05)；20 μmol/L Lut+25 μmol/L Res處理后HepG2細(xì)胞相對(duì)存活率最低(P均<0.05)。各濃度Lut、Res及二者聯(lián)合處理24 h對(duì)LO2細(xì)胞相對(duì)存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；而索拉非尼處理24 h后LO2細(xì)胞相對(duì)存活率低(P<0.05)。

2.2 Lut、Res對(duì)HepG2、LO2細(xì)胞形態(tài)及凋亡的影響 未經(jīng)藥物處理的HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞透亮，胞體肥厚，邊界清晰；而分別經(jīng)20 μmol/L Lut、25 μmol/L Res、20 μmol/L Lut+25 μmol/L Res處理后，HepG2細(xì)胞逐漸固縮，膜局部破損，死亡細(xì)胞多。DAPI染色發(fā)現(xiàn)，藥物處理后，HepG2細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度的核固縮和染色體片段化，經(jīng)20 μmol/L Lut+25 μmol/L Res處理后的HepG2細(xì)胞變化更明顯。同時(shí)，藥物處理對(duì)LO2的細(xì)胞形態(tài)和DAPI染色后核形態(tài)均無(wú)明顯影響。

2.3 Lut、Res對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)的影響 未經(jīng)藥物處理及經(jīng)Lut 20 μmol/L、Res 25 μmol/L、Lut 20 μmol/L+Res 25 μmol/L處理后HepG2細(xì)胞內(nèi)NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.08、0.96±0.10、1.00±0.12、0.95±0.12；p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.06、0.74±0.04、0.63±0.05、0.36±0.08。藥物處理對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但可下調(diào)細(xì)胞內(nèi)p-NF-κB蛋白表達(dá)，經(jīng)Lut 20 μmol/L+Res 25 μmol/L處理后HepG2細(xì)胞內(nèi)p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量最低(P均<0.05)，HepG2細(xì)胞內(nèi)NF-κB入核被明顯抑制。

2.4 Lut、Res對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的影響 與未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞相比，經(jīng)藥物處理后HepG2細(xì)胞內(nèi)Bax、Caspase-3表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，經(jīng)Lut 20 μmol/L+Res 25 μmol/L處理后HepG2細(xì)胞內(nèi)Bax、Caspase-3表達(dá)最高，Bcl-2表達(dá)最低 (P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 Lut、Res對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax、Caspase-3相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討論

近年來(lái)，藥物聯(lián)合治療肝癌成為研究熱點(diǎn)，一方面聯(lián)合用藥可降低給藥劑量，減少藥物的不良反應(yīng)；另一方面又可對(duì)抗肝癌的耐藥性，發(fā)揮協(xié)同抗癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，Lut和索拉非尼聯(lián)用可增加肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性，通過(guò)激活c-Jun氨基末端激酶，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，有效解決了臨床治療中肝癌對(duì)索拉非尼的耐藥性問(wèn)題[11]。姜黃素與低劑量的塞來(lái)昔布聯(lián)用可通過(guò)抑制蛋白激酶B/NF-κB/前列腺素E2/活性氧信號(hào)通路，協(xié)同促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，有效避免了塞來(lái)昔布單獨(dú)治療時(shí)因劑量較高引起的嚴(yán)重心血管不良反應(yīng)[12]。除此之外，葫蘆素B與姜黃素聯(lián)用二者可在低劑量下實(shí)現(xiàn)安全、高效協(xié)同抑制人肝癌細(xì)胞BEL-7402/5-Fu的生長(zhǎng)，這與抑制P-糖蛋白和多藥耐藥性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)[13]。因此，藥物聯(lián)用是治療肝癌的有效措施。

Lut和Res對(duì)細(xì)胞內(nèi)過(guò)度激活的NF-κB均有抑制作用。Lut可抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW246.7內(nèi)NF-κB的激活，發(fā)揮抗炎作用[14]；也可抑制腫瘤壞死因子α刺激的人肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)NF-κB表達(dá)，抑制炎癥相關(guān)通路激活[15]。Res則可通過(guò)抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-15和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549中NF-κB的活性，發(fā)揮抗腫瘤的作用[16,17]。但Lut和Res是否通過(guò)抑制NF-κB發(fā)揮抑制肝癌的作用及聯(lián)用是否具有協(xié)同作用，目前鮮見(jiàn)研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，Lut和Res體外聯(lián)合使用較單獨(dú)使用對(duì)HepG2的生長(zhǎng)具有更強(qiáng)的抑制作用，20 μmol/L Lut+25 μmol/L Res對(duì)HepG2生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)。重要的是，Lut和Res單獨(dú)及聯(lián)合處理下，LO2細(xì)胞活力和形態(tài)均無(wú)顯著變化，說(shuō)明Lut、Res可選擇性抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)而對(duì)正常肝細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)影響。Lut與Res聯(lián)合使用具有低毒性、高藥效的特點(diǎn)。

NF-κB作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子，激活后將從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。肝癌細(xì)胞內(nèi)NF-κB被過(guò)度激活，因此可通過(guò)上調(diào)IκBα表達(dá)抑制NF-κB的激活，顯著減緩腫瘤的發(fā)展[18]。同時(shí)，化療藥物可通過(guò)激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的NF-κB而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性[19]。研究發(fā)現(xiàn)，Lut和Res均可抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)NF-κB的激活，具有一定的抗腫瘤活性，但單獨(dú)使用需要的劑量較大且藥效不佳[9,11,15,16]。p-NF-κB是NF-κB的活性形式，本研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的Lut和Res聯(lián)用可顯著抑制HepG2內(nèi)NF-κB的激活,誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，發(fā)揮協(xié)同抗肝癌的作用。這種協(xié)同作用一方面可能與抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有關(guān)，另一方面可能與增加腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性有關(guān)。

綜上所述，體外低劑量Lut與Res聯(lián)用應(yīng)用可協(xié)同抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，且這種抑制作用強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照藥索拉非尼；同時(shí)其對(duì)LO2細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響，安全性優(yōu)于索拉非尼，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。其作用機(jī)制可能與抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)NF-κB的激活，下調(diào)Bcl-2表達(dá)、上調(diào)Bax、Caspase-3表達(dá)有關(guān)。這為天然產(chǎn)物聯(lián)合用藥及靶向NF-κB抗肝癌的研究提供新思路。但本研究?jī)H檢測(cè)了單一靶點(diǎn)(NF-κB)，未考察其上游的調(diào)控蛋白，機(jī)制研究過(guò)于單一；本研究?jī)H考察了聯(lián)合用藥體外抗肝癌的作用，考慮到藥物的體內(nèi)吸收和代謝，其體內(nèi)抗腫瘤活性需進(jìn)一步研究。同時(shí)，LO2是一種轉(zhuǎn)化后的正常肝細(xì)胞，不具備正常肝細(xì)胞的所有特性，藥物的安全性需在原代肝細(xì)胞上進(jìn)一步驗(yàn)證。