馮青青，趙文文，趙文飛，于文靜，閆文嫻，魏紅梅

青島市中心醫(yī)院，山東青島266000

肝細(xì)胞癌(HCC)是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤，2012年全球有782 500例新發(fā)患者和745 500例死亡患者[1]。HCC早期癥狀并不明顯，易被忽視。大多數(shù)HCC患者確診時(shí)已是晚期，因此病死率高[2,3]。近年來(lái)，有關(guān)HCC預(yù)后標(biāo)記物的研究一直是熱點(diǎn)與難點(diǎn)。微小RNA(miRNA)在HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中表達(dá)水平有變化，在HCC的篩查和診斷、治療方案選擇、預(yù)后分析方面具有指導(dǎo)意義[4,5]。臨床甲醛固定石蠟包埋(FFPE)標(biāo)本是進(jìn)行醫(yī)學(xué)回顧性研究的最佳資源。雖然新鮮標(biāo)本經(jīng)過(guò)固定、脫水、浸蠟、包埋后，miRNA部分已降解或修飾，但miRNA因其體積微小，故可在FFPE組織中保存，與新鮮組織樣品中miRNA表達(dá)相差無(wú)幾[6,7]。本課題組前期利用PubMed Central文獻(xiàn)檢索，深入分析miRNA在HCC組織中的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)智人(hsa)-miR-191-5p、hsa-miR-221-5p在HCC細(xì)胞系及組織中呈高表達(dá)，并與HCC發(fā)生密切相關(guān)，二者可作為HCC的潛在生物標(biāo)記物[8～20]。2018年2月，本研究檢索癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)、高通量基因表達(dá)(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)，并用RT-PCR檢測(cè)本院76例HCC及其癌旁組織中hsa-miR-191-5p與hsa-miR-221-5p的表達(dá)，探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 生物信息學(xué)分析資料來(lái)源：取GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中GSE12717芯片集，其中包含8例HBV感染的HCC患者樣本和4例正常無(wú)腫瘤對(duì)照樣本，GSE10694芯片集包含78例HBV感染的HCC患者樣本和配對(duì)癌旁樣本。RT-PCR檢測(cè)標(biāo)本來(lái)源：2016年2月～2018年2月本院腫瘤綜合治療二科確診的HCC患者76例，取其HCC組織標(biāo)本及其癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>3 cm)，均為初治，HBV陽(yáng)性。

1.2 HCC組織中差異表達(dá)基因篩選 采用生物信息學(xué)分析方法。GEO篩選檢索式：(hepatocellular OR liver OR hepatic OR HCC)AND (malignant OR cancer OR tumor OR neoplas OR carcinoma)。檢索時(shí)間截至2018年2月。數(shù)據(jù)來(lái)源于TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)，下載并預(yù)處理HCC相關(guān)數(shù)據(jù)集的miRNA表達(dá)資料，篩選出差異表達(dá)基因，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05，差異表達(dá)倍數(shù)(FC)>1或<-1。本研究包含21份肝臟正常組織及137份HBV感染HCC組織樣本。數(shù)據(jù)集中相同的miRNA表達(dá)值求和，并用log2(total_RPM+1)轉(zhuǎn)變。在GEO芯片集的HCC組織中驗(yàn)證差異miRNA。用R語(yǔ)言程序包(edgeR)篩選差異表達(dá)基因。

1.3 HCC及其癌旁組織中hsa-miR-191-5p、hsa-miR-221-5p表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、引物、探針及實(shí)時(shí)定量RT-PCR試劑盒購(gòu)自賽默飛公司。取總RNA各200 ng，加入RT反應(yīng)體系15 μL中行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用安捷倫MX3000P型熒光定量PCR儀行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)總體系20 μL，其中2×taqman Master Mix 10 μL、cDNA 1.33 μL、taqman引物及探針1 μL、高壓滅菌去離子水7.67 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算平均值。采用2-ΔΔCt法分析目的miRNA在不同樣本中的表達(dá)，U6為內(nèi)參照[21～23]。U6引物序列為5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′，hsa-miR-191-5p引物序列為5′-TGGTTGTTGTTTAAAATAGGAA-3′，hsa-miR-221-5p引物序列為5′-CAGCATACATGATTCCTTGTGA-3′。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織中差異表達(dá)基因篩選結(jié)果 在GSE12717篩選出43個(gè)差異表達(dá)miRNA(P<0.05，|Fold change|≥1)，GSE10694篩選出50個(gè)差異表達(dá)miRNA(P<0.05，|Fold change|≥0.5)，在TCGA中篩選出101個(gè)差異表達(dá)miRNA(P<0.05，|Fold change|≥1)。hsa-miR-221-5p、hsa-miR-191-5p在兩個(gè)GEO數(shù)據(jù)集中呈現(xiàn)差異表達(dá)，但在TCGA中未檢測(cè)出二者表達(dá)差異。

2.2 HCC及其癌旁正常組織中hsa-miR-191-5p、hsa-miR-221-5p表達(dá)比較 HCC及其癌旁正常組織中hsa-miR-191-5p相對(duì)表達(dá)量分別為6.03±1.82、0.93±0.08，hsa-miR-221-5p相對(duì)表達(dá)量分別為6.03±1.82、0.93±0.08。HCC組織中hsa-miR-191-5p、hsa-miR-221-5p表達(dá)均高于癌旁正常組織(P均<0.05)。

2.3 hsa-miR-191-5p、hsa-miR-221-5p表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系 hsa-miR-191-5p與HCC的TNM分期、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有關(guān)(P均<0.05)，hsa-miR-221-5p表達(dá)與HCC的TNM分期、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、包膜浸潤(rùn)有關(guān)(P均<0.05)；二者表達(dá)與患者其他臨床病理特征無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 hsa-miR-191-5p、hsa-miR-221-5p表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

miRNA作為內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，體積微小，有利于在FFPE組織中穩(wěn)定保存。miRNA在FFPE與新鮮組織中表達(dá)與質(zhì)量高度一致[6]。miRNA參與一系列腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物過(guò)程，許多miRNA在腫瘤組織、血液和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，在癌癥的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后中起重要作用[6,7]。目前，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)介入了腫瘤研究的各個(gè)方面，包括GEO、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)在內(nèi)的大數(shù)據(jù)分析，可篩選并驗(yàn)證在腫瘤檢測(cè)和靶向治療方面發(fā)揮作用的生物標(biāo)記物。Ura等[8]發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-191在HCC組織中表達(dá)上調(diào)，與He等[9]研究結(jié)果一致。以上研究均使用液氮保存的新鮮組織作為研究對(duì)象。

本研究用FFPE提取miRNA，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-191在HCC組織中表達(dá)明顯高于非癌肝組織，提示hsa-miR-191可能為HCC的促癌基因。He等[9]發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-191在HCC組織中的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)，但hsa-miR-191與患者臨床病理特征的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-191在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期HCC組織中的表達(dá)明顯高于Ⅰ、Ⅱ期?？梢?jiàn)HCC臨床分期越晚，hsa-miR-191的表達(dá)越高。提示hsa-miR-191與HCC的進(jìn)展有關(guān)。同時(shí)，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的HCC組織中hsa-miR-191的表達(dá)明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)者。可見(jiàn)hsa-miR-191高表達(dá)的HCC患者易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。提示hsa-miR-191可能參與了HCC的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。Elyakim等[10]在體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲除hsa-miR-191后，HCC細(xì)胞增殖降低，細(xì)胞凋亡增加；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)減慢。進(jìn)一步證實(shí)hsa-miR-191可促進(jìn)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制其凋亡。有關(guān)hsa-miR-191靶基因的報(bào)道較少，研究證實(shí)hsa-miR-191直接抑制與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子3(TIMP3)的表達(dá)[9]。利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)在非小細(xì)胞肺癌組織中核因子IA也是hsa-miR-191的靶標(biāo)[11]。在亞砷酸鹽轉(zhuǎn)化的肝上皮細(xì)胞中，缺氧誘導(dǎo)因子2α通過(guò)調(diào)控miR-191啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活，參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，獲得干細(xì)胞表型[12]。

hsa-miR-221在HCC組織中呈高表達(dá)。多項(xiàng)研究針對(duì)新鮮HCC組織使用芯片、Northern blottimg及RT-PCR等方法檢測(cè)hsa-miR-221表達(dá)，F(xiàn)u等[15]則使用原位雜交技術(shù)檢測(cè)FFPE組織中hsa-miR-221表達(dá);Karakatsanis等[19]也用RT-PCR檢測(cè)了HCC的FFPE組織中hsa-miR-221表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)HCC組織中hsa-miR-221高表達(dá)，提示hsa-miR-221在HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，也扮演著癌基因的角色。有研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-221表達(dá)與HCC分期及預(yù)后相關(guān)[13,19]。本研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-221在Ⅲ～Ⅳ期HCC組織中的表達(dá)明顯高于Ⅰ、Ⅱ期，與研究[13,19]結(jié)果一致。同時(shí)，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的HCC組織中hsa-miR-221的表達(dá)高于無(wú)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)者；且hsa-miR-221表達(dá)還與腫瘤包膜狀態(tài)密切相關(guān)。提示hsa-miR-221表達(dá)與腫瘤細(xì)胞局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。陳罡等[20]將hsa-miR-221模擬物轉(zhuǎn)染至HCC細(xì)胞系HepG2中，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-221可促進(jìn)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)，使HepG2細(xì)胞處于DNA合成的S期，進(jìn)一步驗(yàn)證了hsa-miR-221促HCC細(xì)胞增殖的特性。同時(shí)，hsa-miR-221可抑制肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡[20]。本研究結(jié)果認(rèn)為，hsa-miR-221在HCC的進(jìn)展及惡化中發(fā)揮重要作用。已證實(shí)的hsa-miR-221靶基因有Bmf[13]、DDIT4[14]、CDKN1B/p27/Kip1、CDKN1C/p57/Kip2[17]、PTEN、TIMP3、PPP2R2A[18]等，以上基因有助于解釋hsa-miR-221促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

綜上所述，hsa-miR-191、hsa-miR-221在HCC組織中具有致癌作用?；谏镄畔W(xué)分析結(jié)合RT-PCR檢測(cè)的HCC組織中hsa-miR-191、hsa-miR-221呈高表達(dá)，二者可能參與HCC的惡性進(jìn)展。hsa-miR-191、hsa-miR-221有望成為HCC的分子標(biāo)志物。本研究也存在不足之處，無(wú)論是TCGA還是GEO數(shù)據(jù)庫(kù)提供的都是歐美人群的數(shù)據(jù)，缺少亞洲人群的相關(guān)數(shù)據(jù);且本研究樣本較少，代表性差，后期需進(jìn)行多中心研究。