陳琨，李桐，劉俐璐，李園園，姜瞻梅

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030）

乳清蛋白（whey protein，WP）是乳清中多種蛋白質(zhì)組分的統(tǒng)稱，根據(jù)提取蛋白質(zhì)的加工過程不同，可得到不同組成的乳清蛋白產(chǎn)品，如乳清濃縮蛋白（whey protein concentrate，WPC）是蛋白含量為34%～86%的商業(yè)產(chǎn)品，而經(jīng)過進(jìn)一步處理所得到的乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI），其蛋白質(zhì)含量通常大于90%。乳清蛋白富含多種成分，包括β-乳球蛋白、乳鐵蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白、血清白蛋白和乳過氧化物酶等，是一種營養(yǎng)豐富且易消化吸收的蛋白質(zhì)[1-2]，有利于保持身體健康、提高免疫力、增強(qiáng)骨質(zhì)和控制體重等，且乳清蛋白方便獲取、價格低廉，適合用作食品基料，在制藥、化學(xué)等其他許多領(lǐng)域都具有良好的應(yīng)用價值[3]。

乳清分離蛋白具有多種功能特性，如溶解性、起泡性、凝膠性和乳化性等，因而適用于食品加工體系中。其中，凝膠特性是乳清蛋白的重要特性之一，它在許多食品的制備中都起著主要作用，如酸奶、果凍等，同時利用這種特性也可以將其作為增稠劑、微膠囊壁材等[4-6]。因此，不斷探究各種因素對乳清分離蛋白凝膠性的影響，并提高乳清分離蛋白的凝膠特性從而擴(kuò)大其在食品及其他領(lǐng)域的應(yīng)用，具有重要的社會經(jīng)濟(jì)價值。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，國內(nèi)外應(yīng)用交聯(lián)技術(shù)對乳清分離蛋白進(jìn)行改性的研究日益增多，其方法主要包括酶交聯(lián)[7]、化學(xué)交聯(lián)[8]等。其中化學(xué)交聯(lián)具有操作簡便、反應(yīng)快速等特點(diǎn)，因而在快速高效的基礎(chǔ)上致力于開發(fā)安全的化學(xué)方法逐漸成為研究的熱點(diǎn)。

檸檬酸（citric acid，CA），又名枸櫞酸，因其具有愉悅的酸味，口感酸爽、安全無毒，被廣泛用作酸味劑，特別是在食品和飲料中[9]。近年來，應(yīng)用檸檬酸作為一種安全高效、價格低廉的交聯(lián)劑，已經(jīng)逐漸得到人們的關(guān)注。通過添加檸檬酸作為交聯(lián)劑，促使乳清蛋白分子間產(chǎn)生一些新的酰胺鍵及二硫鍵，進(jìn)而形成蛋白質(zhì)交聯(lián)。與此同時在疏水和范德華力的相互作用下，進(jìn)一步促進(jìn)了加熱后凝膠結(jié)構(gòu)的形成及凝膠特性的改善?？琢罹闧10]探究將檸檬酸用于淀粉和小麥醇溶蛋白的交聯(lián)，通過十二烷基硫酸鈉鹽-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）等方法證明，檸檬酸交聯(lián)小麥醇溶蛋白的發(fā)生，也驗(yàn)證了檸檬酸交聯(lián)可提高小麥醇溶蛋白的斷裂強(qiáng)度；Bagheri 等[11]使用檸檬酸對乳清蛋白進(jìn)行預(yù)交聯(lián)處理，再通過乙醇脫溶劑產(chǎn)生蛋白顆粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)交聯(lián)后形成的蛋白顆粒具有較好的消化穩(wěn)定性。許多研究已表明檸檬酸可用于蛋白質(zhì)的交聯(lián)，并改善其部分功能特性，但是目前國內(nèi)對檸檬酸處理改善乳清分離蛋白凝膠特性的研究還不全面。本研究以凝膠硬度和保水性為指標(biāo)，探究檸檬酸處理對乳清蛋白的凝膠特性的影響，并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法進(jìn)一步確定檸檬酸濃度及乳清分離蛋白濃度對其凝膠特性的交互作用，確定最優(yōu)凝膠條件，致力于通過一種快速高效、安全無毒的化學(xué)方法改善乳清分離蛋白的凝膠特性，并為食品工業(yè)獲得新型、安全、高效的乳清分離蛋白功能性基料提供基本理論數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白（蛋白質(zhì)含量93.5%）：美國Mullins Whey Inc.公司；檸檬酸（≥99.5%）：上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TAXT-plus 質(zhì)構(gòu)分析儀：英國 SMS 公司；TGL20M高速冷凍離心機(jī)：百密思儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白交聯(lián)樣品的制備

將乳清分離蛋白（WPI）粉末溶解于去離子水中，在25 ℃下攪拌2 h，并在4 ℃下儲存過夜以確保完全溶解。然后將其配制成蛋白質(zhì)濃度為4%、6%、8%、10%、12%的溶液，即獲得乳清蛋白溶液。向配制好的乳清蛋白溶液中添加檸檬酸，使其最終濃度分別為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%，完全溶解后使用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)混合液的pH 值至7.0，然后50 ℃條件下反應(yīng)6 h；反應(yīng)后將混合液冷卻。

1.3.2 乳清蛋白凝膠特性的測定

將相同蛋白濃度、不含檸檬酸的WPI 溶液作為對照組；檸檬酸處理的WPI 溶液作為樣品組。將對照組和樣品組同時置于95 ℃水浴鍋中恒溫加熱30 min，隨后取出冷水浴冷卻至25 ℃已形成凝膠。在4 ℃下放置24 h，備用。

用TAXT-plus 質(zhì)構(gòu)儀對凝膠硬度進(jìn)行測量，采用P/0.5 探頭。為避免破壞凝膠，測量時不要將凝膠從稱量皿中移出。探頭以2 mm/s 的速度穿刺，壓縮比例為50%。將整個過程中的最大力定義為凝膠強(qiáng)度。數(shù)據(jù)對3 個平行樣進(jìn)行重復(fù)測定。

將凝膠均勻切成小塊，取出一定量的凝膠進(jìn)行稱量，質(zhì)量記作m，并置于50 mL 離心管中。記錄離心前離心管總質(zhì)量m1。以8 000 r/min 在4 ℃條件下離心30 min。離心后離心管中的水倒出再進(jìn)行稱量，離心管總質(zhì)量記作m2。保水性按下式計(jì)算：

式中：m1為離心前凝膠和離心管總質(zhì)量，g；m2為離心并排水后凝膠和離心管總質(zhì)量，g；m 為凝膠質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究乳清蛋白濃度（4%、6%、8%、10%、12%）和檸檬酸濃度（0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%）對乳清蛋白凝膠特性的影響，將凝膠硬度和凝膠保水性作為觀測指標(biāo)。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乳清蛋白濃度、檸檬酸濃度為自變量，凝膠強(qiáng)度和凝膠保水性分別為響應(yīng)值，應(yīng)用Design-Expert8.0 軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，如表1 所示，并進(jìn)行二因素五水平的響應(yīng)面法分析試驗(yàn)，然后通過分析得到最優(yōu)凝膠條件。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及編碼水平Table 1 Factors and coding levels of response surface experiment

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

本研究均進(jìn)行3 次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，將所得結(jié)果取平均值并利用SPSS 22.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，將P＜0.05 認(rèn)為差異顯著。利用Excel（2010）作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乳清蛋白濃度對凝膠硬度的影響

本研究選取在檸檬酸（CA）濃度為1%的條件下，探究不同乳清蛋白濃度對其處理后所形成凝膠硬度影響，其試驗(yàn)結(jié)果如圖1 所示。

圖1 乳清分離蛋白濃度對凝膠硬度的影響Fig.1 Effect of WPI concentration on gel hardness

由圖1 可以看出，檸檬酸處理后的乳清蛋白其凝膠性顯著提高，且乳清蛋白濃度對凝膠硬度也有顯著影響（P＜0.05）。結(jié)果顯示，在蛋白質(zhì)濃度為4%、6%、8%時，未經(jīng)處理的乳清蛋白經(jīng)過加熱處理未能形成凝膠；對比經(jīng)過檸檬酸處理處理的乳清蛋白，其在各種濃度下均能形成凝膠，其凝膠硬度顯著增大。同時，凝膠硬度隨著蛋白質(zhì)濃度的增加而顯著增加，當(dāng)乳清蛋白濃度為12%時，凝膠硬度最大，達(dá)到1 284.40 g。崔旭海等在探究環(huán)境條件對乳清蛋白凝膠特性的影響時也發(fā)現(xiàn)，在蛋白濃度為4%～14%的范圍內(nèi)隨著乳清蛋白濃度的增高其凝膠硬度也隨之增高[12]。分析其原因，推測是由于檸檬酸的加入使得乳清蛋白發(fā)生交聯(lián)，蛋白質(zhì)中的氨基和交聯(lián)劑檸檬酸中的羧基發(fā)生親核取代反應(yīng)，氨基氮攻擊具有部分正電荷的羰基碳進(jìn)而形成新的酰胺鍵，檸檬酸的多個羧基參與反應(yīng)使得蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)[13]，形成大分子聚合物，有助于形成更加致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。而均勻致密的微觀結(jié)構(gòu)可能更易于與蛋白質(zhì)凝膠中的水結(jié)合，有助于增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度和保水性[14]，因此本研究中檸檬酸處理使得WPI 的凝膠硬度增加。同時，隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，參與凝膠作用的蛋白質(zhì)分子也隨之增多，使得參與形成三維凝膠網(wǎng)絡(luò)的蛋白質(zhì)增多進(jìn)而有助于凝膠硬度增大[15]。

2.1.2 乳清蛋白濃度對凝膠保水性的影響

本研究選取在檸檬酸（CA）濃度為1%的條件下，探究不同乳清蛋白濃度對其處理后所形成凝膠保水性的影響，其試驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示。

圖2 乳清分離蛋白濃度對凝膠保水性的影響Fig.2 Effect of WPI concentration on water holding capacity of gel

由圖2 可以看出，檸檬酸處理后的乳清蛋白其凝膠性顯著提高，且乳清蛋白濃度對凝膠保水性也有顯著影響（P＜0.05）。結(jié)果顯示，在蛋白質(zhì)濃度為4%、6%、8%時，未經(jīng)處理的乳清蛋白經(jīng)過加熱處理未能形成凝膠；而經(jīng)過檸檬酸處理的乳清蛋白，其在各種濃度下均能形成凝膠，對比可知其在蛋白質(zhì)濃度為10 %和12%所形成凝膠的保水性均顯著提高。同時，凝膠保水性隨著蛋白質(zhì)濃度的增加而顯著增加，當(dāng)乳清蛋白濃度為12%時，凝膠保水性最好，達(dá)到76.33%。蛋白凝膠的持水性取決于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)合水的能力[16]。分析原因，由于檸檬酸的加入使得乳清蛋白發(fā)生交聯(lián)并形成大分子聚合物，有助于形成更加致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，同時，隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，參與凝膠作用及形成三維凝膠網(wǎng)絡(luò)的蛋白質(zhì)增多，形成更均勻和更致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)，其具有更小的孔隙，其可以結(jié)合更大量的水并且有助于水分的截留，由此改善了凝膠的保水性[17]。

2.1.3 檸檬酸濃度對凝膠硬度的影響

本研究選取在WPI 濃度為10%的條件下，探究不同檸檬酸濃度對交聯(lián)后乳清蛋白所形成凝膠硬度的影響，其試驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示。

圖3 不同檸檬酸濃度下凝膠硬度的變化Fig.3 Effect of CA concentration on gel hardness

由圖3 可以看出，乳清蛋白凝膠硬度隨著檸檬酸濃度的增加而先上升后下降，且檸檬酸濃度對凝膠硬度影響效果顯著（P＜0.05），在檸檬酸濃度為0.6%時，凝膠硬度達(dá)到最大，為1 059.36 g。

檸檬酸濃度較小時，凝膠硬度隨著檸檬酸濃度的增加而增加，分析其原因是檸檬酸交聯(lián)乳清蛋白形成大分子聚合物，參與形成凝膠網(wǎng)絡(luò)的大分子物質(zhì)有助于形成致密的凝膠結(jié)構(gòu)進(jìn)而增加凝膠硬度。隨著檸檬酸濃度的增加，使得樣品溶液中的離子強(qiáng)度不斷升高，檸檬酸在交聯(lián)蛋白質(zhì)的同時，也通過靜電屏蔽作用使蛋白質(zhì)分子聚集，使之形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[18]，而在參與交聯(lián)的乳清蛋白數(shù)量有限的情況下，過多檸檬酸的加入可能使得靜電排斥力增加，因此使得所形成凝膠的強(qiáng)度有所下降。

2.1.4 檸檬酸濃度對凝膠保水性的影響

本研究選取在WPI 濃度為10%的條件下，探究不同檸檬酸濃度對處理后乳清蛋白所形成凝膠保水性的影響，其試驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示。

圖4 不同檸檬酸濃度下凝膠保水性的變化Fig.4 Effect of CA concentration on water holding capacity of gel

由圖4 可以看出，檸檬酸處理的乳清蛋白其凝膠保水性顯著提高（P＜0.05），但隨著檸檬酸濃度的升高其凝膠保水性下降。在檸檬酸濃度為0.3%時，凝膠保水性最好，達(dá)到97.23%。這可能由于檸檬酸處理乳清蛋白形成大分子聚合物，參與形成凝膠網(wǎng)絡(luò)的大分子物質(zhì)有助于形成更加致密的凝膠結(jié)構(gòu)，同時，由于細(xì)密的凝膠網(wǎng)絡(luò)的微小孔隙和可用于與水相互作用的更多位點(diǎn)，凝膠保水性得到改善，這些位點(diǎn)是包含在WPI-CA 產(chǎn)物中的檸檬酸殘基的游離羥基[19]。但是隨著檸檬酸濃度的增加，可能在蛋白質(zhì)之間建立了較多共價鍵降低了蛋白質(zhì)鏈的柔韌性并且具有更少的鏈間空間[20]，同時樣品溶液中的離子強(qiáng)度不斷升高，凝膠相互結(jié)合不緊密，導(dǎo)致結(jié)合水的能力下降[21]。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化凝膠工藝條件

2.2.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乳清蛋白濃度、檸檬酸濃度兩個因素為響應(yīng)因素，以凝膠硬度和保水性為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（取平均值）如表2 所示。

表2 中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Central composite test design and results

2.2.2 回歸模型的建立與分析

采用Design Expert 8.0 軟件對表2 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析和顯著性檢驗(yàn)，建立的凝膠硬度、保水性與各因素變量的二次方程模型為：

凝膠硬度：Y1=601.17A-24.80B-226.77AB-39.31A2-228.05B2+1 261.76

保水性：Y2=-0.033A-0.10B+0.014A2+0.009 5B2+0.046AB2+0.75

凝膠硬度回歸模型方程的方差分析如表3 所示。

表3 凝膠硬度回歸模型方程的方差分析Table 3 Variance analysis of gel hardness regression model equations

由表3 的凝膠硬度回歸模型方程的方差分析可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯?；貧w方程模型的F 值為173.28，P 值小于0.01，這表明此回歸方程模型極顯著。失擬項(xiàng)P 值為0.245 3 大于0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著。該模型R2=0.992 0，R2adj=0.986 3，說明模型與試驗(yàn)擬合度較高，響應(yīng)值與響應(yīng)因素線性關(guān)系顯著。

凝膠保水性回歸模型方程的方差分析如表4 所示。

表4 凝膠保水性回歸模型方程的方差分析Table 4 Variance analysis of gel water holding capacity regression model equations

由表4 的凝膠保水性回歸模型方程的方差分析可知，因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯?；貧w方程模型的F 值為28.41，P 值小于0.01，這表明此回歸方程模型極顯著。該模型R2=0.953 0，R2adj=0.919 5，說明模型與試驗(yàn)擬合度較高，響應(yīng)值與響應(yīng)因素線性關(guān)系顯著。

2.2.3 響應(yīng)面分析

兩因素對凝膠硬度影響的響應(yīng)面圖見圖5。

圖5 蛋白質(zhì)濃度與檸檬酸濃度對乳清蛋白凝膠硬度的影響Fig.5 Effect of protein concentration and citric acid concentration on the hardness of WPI gel

如圖5 所示，在較低的檸檬酸濃度范圍內(nèi)，隨著蛋白質(zhì)濃度的升高，凝膠強(qiáng)度呈逐漸升高的趨勢；但是在較高的檸檬酸濃度下，隨著WPI 濃度的增加呈先上升后下降的趨勢。在WPI 濃度為12%時，隨著檸檬酸濃度逐漸增加，WPI 凝膠硬度有逐漸降低的趨勢。在檸檬酸濃度較低時，蛋白質(zhì)濃度較高時具有最高的凝膠保水性，兩因素具有顯著的相互作用，乳清蛋白對處理后凝膠硬度的影響更大。

兩因素對凝膠保水性影響的響應(yīng)面圖見圖6。

圖6 蛋白質(zhì)濃度與檸檬酸濃度對乳清蛋白凝膠保水性的影響Fig.6 Effect of protein concentration and citric acid concentration on the water holding capacity of WPI gel

如圖6 所示，隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，WPI 的凝膠保水性呈上升趨勢；隨著檸檬酸濃度的增加，WPI 的凝膠保水性呈下降趨勢，且下降速率減緩。乳清蛋白濃度與檸檬酸濃度具有共同作用，乳清蛋白的作用更加有效，在檸檬酸濃度較低時，蛋白質(zhì)濃度較高時具有最高的凝膠保水性。

2.2.4 回歸模型的驗(yàn)證與對照試驗(yàn)

利用軟件尋優(yōu)，得到的具有最佳凝膠特性的工藝條件為蛋白質(zhì)濃度為12%、檸檬酸濃度為0.3%，將混合溶液在50 ℃條件下水浴6 h。在此條件下由響應(yīng)面模型預(yù)測的WPI 的凝膠硬度和保水性分別為1 847.14 g、89.021 9%。為檢驗(yàn)回歸模型的可靠性，采用優(yōu)化得出的工藝條件進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果得到的WPI 的凝膠硬度為1 813.82 g，保水性為88.56%。與模型預(yù)測值非常接近，表明此模型有效，驗(yàn)證了響應(yīng)面模型的正確性。對比不加入檸檬酸、蛋白質(zhì)濃度為12%，其他條件相同的情況下，得到的WPI 的凝膠硬度為15.7 g，保水性為37.68%，可知此檸檬酸處理方法對WPI 的凝膠特性有較大提高。

3 結(jié)論

本研究嘗試使用檸檬酸處理提高乳清蛋白的凝膠特性，通過單因素試驗(yàn)和兩因素五水平的中心復(fù)合響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)探究檸檬酸濃度和乳清蛋白濃度對其凝膠特性的影響，并預(yù)測出最佳優(yōu)化條件。通過驗(yàn)證試驗(yàn)后，結(jié)果表明具有最佳凝膠特性的檸檬酸處理乳清蛋白條件為蛋白質(zhì)濃度為12%，檸檬酸濃度為0.3%；在該條件下，制得的凝膠硬度為1 813.82 g，保水性為88.56%，與模型預(yù)測值1 847.14 g、89.021 9%相近。同時，對比未處理乳清蛋白，最優(yōu)條件下的檸檬酸處理可以顯著改善其凝膠特性。