陳正培，吳婉瑩，梁琳，張銀，向煜，吳錦蘭，熊建文，*

（1.廣西科技大學(xué)鹿山學(xué)院食品與化學(xué)工程系，廣西柳州545616；2.廣西科技大學(xué)后勤管理處，廣西柳州 545006）

百香果（passion fruit），屬于西番蓮科，主產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，1913 年引入我國，目前主要種植于臺灣、福建、廣西、云南等地區(qū)[1-2]。百香果具有汁液豐富，香味濃郁的特征，深受人們的喜愛，并享有“果汁之王”的美譽[3-4]。隨著食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，百香果的利用率得到大幅度的提高，除了食用鮮果以外，還開發(fā)出了百香果飲料、百香果果脯、百香果果籽油等產(chǎn)品[5]。目前有較多研究表明，百香果果籽提取物具有多種生物學(xué)活性，如Kitada M 等的研究表明，百香果果籽中的白皮杉醇可以通過調(diào)節(jié)肥胖患者的胰島素敏感性、血壓和心率來促進人體健康[6]。Maruki-Uchida H 等發(fā)現(xiàn)百香果中的白皮杉醇具有抗氧化、抗衰老的作用，涂于皮膚上具有保濕和緩解疲勞的的功效，因此在開發(fā)抗光老化化妝品具有良好的應(yīng)用前景[7-9]。

植物內(nèi)生菌是重要的微生物資源寶庫，陸小平等分別從香蕉、柑橘中分離到內(nèi)生細菌，對常見的植物病原菌具有一定的拮抗作用[10-11]。張愛梅等從沙棘根瘤、溫郁金、水稻、樟樹、銀杏等植物中分離到具有重要生物學(xué)活性的內(nèi)生菌[12-15]。然而，對百香果籽內(nèi)生菌的研究較少，百香果籽的重要功效成分是否來源于內(nèi)生菌分泌的次級代謝產(chǎn)物尚不清楚，且內(nèi)生菌的存在對食用百香果的人群是否產(chǎn)生影響尚不明確。因此，分離鑒定百香果果籽內(nèi)生菌具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮百香果產(chǎn)于柳州市，主要選擇市售紫色百香果。

蛋白胨、酵母提取物：廣東環(huán)凱微生物有限公司；瓊脂粉：北京索來寶生物有限公司；瓊脂糖、2×Master Mix、Ⅱ型核酸染料、DNA 提取試劑盒：天根生化試劑（北京）有限公司。

UV-1800 型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；BYQ6072 基因擴增儀：杭州博日科技有限公司；Nikon Eclipse E200 光學(xué)顯微鏡：上海衡浩儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

新鮮百香果用去離子水洗凈，去果皮和果汁，剝離出果籽，并用無菌水洗滌2 次，再將約30 粒百香果籽放置在無菌培養(yǎng)皿中，然后用20 mL 75%酒精浸泡15 min～20 min，去掉酒精，用無菌水洗滌果籽5 次，取出果籽并置于無菌研缽中，研碎果籽后加入20 mL 無菌生理鹽水并混勻，取勻漿液于50 mL 無菌離心管中備用。

1.2.2 內(nèi)生菌的分離與純化

在無菌條件下，取100 μL 果籽勻漿液涂布于平板計數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）固體培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h～24 h，挑選單菌落，用平板劃線法純化兩次，獲得候選菌株。

1.2.3 候選菌株的16S r DNA 序列測定

候選菌株接種至LB 液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜后進行菌株DNA 的提取，采用DNA 提取試劑盒提取（方法參考試劑盒說明書）。以DNA 為模板，采用引物16S 27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' 和 16S 1492R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增，PCR產(chǎn)物送至華大基因生物公司進行測序。

1.2.4 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

在GenBank 數(shù)據(jù)庫中用BLAST 程序來搜索同源序列，在系統(tǒng)中查出相應(yīng)微生物，完成鑒定，并挑選與靶序列最相近的參考序列，用于后續(xù)系統(tǒng)分析。用軟件mega6.0 進行序列同源性分析，以及構(gòu)建鄰接樹（neighbor joining，NJ）來進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.5 培養(yǎng)基的選擇

從平板上挑選候選菌株分別接種到pH 值為7.0的LB 液體培養(yǎng)基9.9 mL、PCA 液體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)過夜。然后按1%的接種量接種至對應(yīng)培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，測定菌液濃度（OD600nm）。

1.2.6 最適pH 值的測定

將候選菌株按1 %接種于不同pH 值（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）的 LB 液體培養(yǎng)基中，在 28 ℃、200 r/min 的條件下培養(yǎng)過夜，測定菌液濃度（OD600nm）。

1.2.7 最適生長溫度的測定

將候選菌株按1%接種于pH 值為5.5 的LB 液體培養(yǎng)基中，然后分別置于 15、20、25、30、35、40、45 ℃7 個溫度下，200 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，測定菌液濃度（OD600nm）。

1.2.8 生長曲線的測定

候選菌株按照1%接種到pH 值5.5 的LB 液體培養(yǎng)基中，在35 ℃、200 r/min 的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔 2 h 測定其菌液濃度（OD600nm）。

1.2.9 數(shù)據(jù)的處理和圖形的繪制

采用SPPSS 22.0 進行數(shù)據(jù)處理和Origin 9.1 進行圖形的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌的分離純化及初步鑒定

2.1.1 分離純化

利用PCA 固體培養(yǎng)基，對百香果果籽中的內(nèi)生細菌進行分離，得到的內(nèi)生細菌形態(tài)圖見圖1。

圖1 從百香果果籽中分離的內(nèi)生細菌Fig.1 Endophyte from passion fruit seed

菌落形態(tài)均一，且呈白色。選取3 株特征菌株進行后續(xù)研究，并將其命名為GZ11、GZ23 和GZ27。經(jīng)形態(tài)觀察，該3 株細菌在LB 培養(yǎng)基上的單菌落呈圓形，乳白色不透明，表面光滑偏濕潤，邊緣規(guī)則，無暈環(huán)，菌落型態(tài)小，微凸起。

2.1.2 形態(tài)特征

從百香果果籽中分離到的內(nèi)生細菌經(jīng)革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下進行觀察，細菌形態(tài)圖見圖2。

圖2 百香果果籽內(nèi)生菌鏡檢結(jié)果Fig.2 Microscopic images of endophyte from passion fruit

3 株菌均為球形革蘭氏陽性細菌，菌體直徑約長1.1 μm～1.5 μm，兩端鈍圓。

2.2 百香果果籽內(nèi)生菌的遺傳學(xué)鑒定

2.2.1 PCR 擴增結(jié)果

分別以菌株 GZ11、GZ23、GZ27 的基因組 DNA 為模板，以細菌鑒定通用引物16S rDNA F27 和16S rDNA R1495 進行PCR 擴增，采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產(chǎn)物，擴增成功的PCR 產(chǎn)物在1500bp左右處有明顯條帶，百香果果籽內(nèi)生菌16S rDNA 的PCR 擴增結(jié)果圖見圖3。

圖3 16SrDNA PCR 擴增產(chǎn)物檢測電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR products based on 16SrDNA sequence analysis

PCR 擴增結(jié)果顯示，得到PCR 產(chǎn)物的大小與典型的16S rDNA 片段大小較為一致，可用于測序分析。

2.2.2 百香果果籽內(nèi)生菌16SrDNA 同源性比對結(jié)果

百香果果籽內(nèi)生菌 GZ11、GZ23、GZ27 的 16SrDNA 序列經(jīng)測序后，進行同源性比對，同源性見表1 和圖4。

表1 16SrDNA 同源性比對結(jié)果Table 1 Homological results of lactic acid bacteria by 16SrDNA sequence

3 株受試菌均屬于不動桿菌屬（Acinetobacter），并將其分別命名為：Acinetobacter sp.GZ11、Acinetobacter sp.GZ23 和 Acinetobacter bouvetii GZ27。

2.3 百香果果籽內(nèi)生菌培養(yǎng)條件的研究

2.3.1 培養(yǎng)基的選擇

圖4 菌株系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of the bacterium

按方法“1.2.5”分別用LB、PCA 和牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基對 Acinetobacter sp.GZ11、Acinetobacter sp.GZ23 和Acinetobacter bouvetii GZ27 進行搖床過夜培養(yǎng)，然后測定其OD600nm值，結(jié)果見圖5。

圖5 培養(yǎng)基的選擇Fig.5 Select the preferable medium

從圖5 中對比3 株內(nèi)生菌在該3 種培養(yǎng)基中的生長狀況，結(jié)果顯示3 株內(nèi)生細菌均呈現(xiàn)LB 培養(yǎng)基＞PCA 培養(yǎng)基＞牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的趨勢，通過T 檢驗比較LB 培養(yǎng)基與PCA 培養(yǎng)基之間的差異，P 值為0.000 8＜0.01，具有極顯著性差異。因此在這3 種常用的細菌培養(yǎng)基中，LB 培養(yǎng)基更適合用于這些百香果果籽內(nèi)生細菌的培養(yǎng)。

2.3.2 最適pH 值的測定

按方法“1.2.6”分別在不同pH 值的LB 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)菌株Acinetobacter sp.GZ11、Acinetobacter sp.GZ23 和 Acinetobacter bouvetii GZ27，測定 OD600nm下的吸光值，得到菌株生長的最適pH 值見圖6。

該3 株內(nèi)生細菌在pH 5.5～8.0 之間生長較為良好，其最適pH 值為7.0，但在pH 5.0 以下其生長均受到強烈的抑制。由于百香果果漿的pH 值在2.0～3.0 之間，而百香果果籽內(nèi)生菌的最適pH 值為7.0，這可能是因為百香果果籽表皮阻礙果漿中的酸進入到果籽，為不動桿菌的生長提供良好的微環(huán)境。

圖6 百香果果籽內(nèi)生細菌最適pH 值的測定Fig.6 Optimal value pH of the bacterium from passion fruit seed

2.3.3 最適生長溫度

按方法“1.2.7”分別在不同的溫度下，利用LB 液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)菌株Acinetobacter sp.GZ11、Acinetobacter sp.GZ23 和 Acinetobacter bouvetii GZ27，測定OD600nm下的吸光值，得到菌株的最適生長溫度圖見圖7。

圖7 最適生長溫度的測定Fig.7 Optimal temperature of the bacterium from passion fruit

該3 株菌在培養(yǎng)溫度為20 ℃～35 ℃之間均呈現(xiàn)良好的生長狀況，在該范圍內(nèi)其生長受溫度變化的影響小，屬于中溫型細菌，且最適生長溫度約為25 ℃。但當(dāng)溫度低于15 ℃或高于40 ℃以上時，其生長受到顯著的抑制，即在低溫下和在高溫下對溫度的敏感性明顯增強。

2.3.4 生長曲線

按方法“1.2.8”利用LB 培養(yǎng)基分別測定Acinetobacter sp.GZ11、Acinetobacter sp.GZ23 和 Acinetobacter bouvetii GZ27 的生長曲線，每隔2 h 測定OD600nm下的吸光值，得到菌株的生長曲線圖見圖8。

圖8 生長曲線的測定Fig.8 Growth curve of the bacterium from passion fruit

3 株菌均在接種后的6 h 以內(nèi)生長緩慢，處于適應(yīng)期，該時期細菌主要進行細胞分裂必需物質(zhì)的準(zhǔn)備；在4 h～16 h 范圍內(nèi)快速生長，處于對數(shù)生長期，主要進行細胞分裂；在18 h～20 h 范圍內(nèi)處于平穩(wěn)期，主要進行次級代謝產(chǎn)物的合成；當(dāng)接種時間大于20 h 以后，細菌數(shù)量逐漸減少，代謝活性降低。

3 討論與結(jié)論

百香果果籽提取物具有多種生物學(xué)活性，而這些活性物質(zhì)是否由內(nèi)生菌所產(chǎn)生尚不清楚，本文基于生物資源挖掘的目的對百香果果籽內(nèi)生菌進行了初步探索。利用PCA 培養(yǎng)基對百香果果籽內(nèi)生細菌進行了分離，結(jié)果分離到圓形，乳白色不透明，表面光滑偏濕潤，邊緣規(guī)則，無暈環(huán)，菌落型態(tài)小，微凸起的菌落。通過分析這些內(nèi)生菌的16SrDNA 序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均屬于不動桿菌屬（Acinetobacter）。不動桿菌屬細菌廣泛存在于自然界中，而且功能豐富，是一類重要的生物資源，具有重大的研究價值。劉興凱等[16]對一株具有瓊膠酶的不動桿菌進行了研究，瓊膠酶可催化瓊膠轉(zhuǎn)化為瓊膠寡糖，獲得的瓊膠寡糖具有抑菌、抗衰老、抗淀粉老化、增強免疫和保濕美白等生物活性，在新功能性食品、新藥和高端化妝品的研發(fā)領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景。朱婷婷等[17]分離鑒定出一株苯并芘降解不動桿菌，該菌株用于處理石油污染的土壤或者焦化廢水中的苯并芘，在環(huán)保方面具有重要的意義。劉玉華等篩選出了降烷烴、石油烴、塑化劑等的不動桿菌[18-21]。百香果果籽具有多種生物學(xué)活性的特征，因此鑒定百香果內(nèi)生菌為研究百香果果籽生物活性物質(zhì)的來源奠定了基礎(chǔ)。