李 晶 張紹軍 黃廷榮 徐繼勛

1.湖北省黃石市中醫(yī)醫(yī)院，湖北黃石 43500；2.湖北省孝感市孝南區(qū)朱湖衛(wèi)生院，湖北孝感 432100

《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》中明確表示，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)為檢驗(yàn)過(guò)程中，用于報(bào)告患者樣本被測(cè)量值的每個(gè)測(cè)量程序確定測(cè)量不確定度[1]。目前，測(cè)量不確定度只有“自上而下”和“自下而上”兩種評(píng)定方法，而“自上而下”的測(cè)量不確定度評(píng)定方法是公認(rèn)較為簡(jiǎn)便的唯一方法，但是該法也存在一定的局限性，本研究同時(shí)采用“自上而下”和“自下而上”兩者方法分別評(píng)定測(cè)量不確定度，探討兩者的優(yōu)異，以供臨床實(shí)驗(yàn)室根據(jù)自身情況選擇不確定度的評(píng)定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

德國(guó)羅氏全自動(dòng)免疫電化學(xué)發(fā)光法分析儀E401；羅氏原裝試劑：甲胎蛋白（AFP，批號(hào)：13310803、17674703、21371600）、癌胚抗原（CEA，批號(hào)：24484800、16842403、20394901）、糖類(lèi)抗原199（CA199，批號(hào)：16483403、19394103、23161200）、糖類(lèi)抗原153（CA153，批號(hào)：16122803、19217101、20990000）、糖類(lèi)抗原125（CA125，批號(hào)：16907902、117762、2561800）、總前列腺抗原（TPSA，批號(hào)：17063003、199422、2470450）。采用原裝配套2 水平質(zhì)控品；羅氏原裝配套校準(zhǔn)液。

1.2 人員和環(huán)境

所有測(cè)量過(guò)程均由中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）免疫授權(quán)簽字人嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程完成。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫濕度均在嚴(yán)格的監(jiān)控下。儀器設(shè)備每年校準(zhǔn)2 次，定期保養(yǎng)維護(hù)。

1.3 數(shù)據(jù)來(lái)源及不確定度的測(cè)量方法

1.3.1 批內(nèi)精密度

將六項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的室內(nèi)質(zhì)控物重復(fù)測(cè)定21 次，剔除第1 次數(shù)據(jù)和離群值，計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

1.3.2 批間精密度

收集黃石市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室2017 年8～12 月（1 次/d）室內(nèi)質(zhì)控在控?cái)?shù)據(jù)，共122 d，計(jì)算批間精密度。

1.3.3 衛(wèi)生部室間質(zhì)評(píng)數(shù)據(jù)（PT）計(jì)算不確定度

衛(wèi)生部臨檢中心能力驗(yàn)證活動(dòng)每年2 次數(shù)據(jù)質(zhì)控物由國(guó)家衛(wèi)計(jì)委臨檢中心提供，編號(hào)為：201521～201525、201611～201615、201621～201625、201711～201715、201721～201725、201811～201815。統(tǒng)計(jì)6 次室間質(zhì)評(píng)結(jié)果，根據(jù)以下公式計(jì)算：

urel（Rw）=，其中urel（Rw）為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測(cè)量復(fù)現(xiàn)性引入的相對(duì)測(cè)量不確定度分量，RSD2R,i 為單次PT 的相對(duì)測(cè)量復(fù)現(xiàn)性，mi為單次PT 的實(shí)驗(yàn)室數(shù)量，n 為PT 總數(shù)。

1.3.4 校準(zhǔn)引入的不確定度

校準(zhǔn)品量值溯源性也會(huì)引入測(cè)量不確定度，引用羅氏廠家提供的校準(zhǔn)品不確定度參數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 “自上而下”方法評(píng)定腫瘤標(biāo)志物測(cè)量不確定度

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測(cè)量復(fù)現(xiàn)性引入的不確定度來(lái)源于批間和批內(nèi)精密度數(shù)據(jù)，采用A 類(lèi)方法統(tǒng)計(jì)分析，偏移引入的不確定來(lái)源于PT 數(shù)據(jù)和校準(zhǔn)品量值溯源數(shù)據(jù)，同時(shí)采用A 類(lèi)和B 類(lèi)方法統(tǒng)計(jì)分析。見(jiàn)表1。

2.2 “自下而上”的方法評(píng)定測(cè)量不確定度

2.2.1 儀器設(shè)備引入的測(cè)量不確定度

公開(kāi)資料顯示，黃道龍?jiān)喂睬鄨F(tuán)揚(yáng)州市委秘書(shū)，揚(yáng)州市審計(jì)局副局長(zhǎng)、局長(zhǎng)，揚(yáng)州市國(guó)資委主任等職，2012年退休。黃宇曾任揚(yáng)州市財(cái)政局下屬二十四橋賓館副總經(jīng)理，2016年9月任揚(yáng)州市資源交易中心政府采購(gòu)科科長(zhǎng)。

2.2.1.1 設(shè)備吸光度重復(fù)性引入的不確定度 用國(guó)家一級(jí)吸光度溶液標(biāo)準(zhǔn)物手工加入儀器比色杯中，確認(rèn)無(wú)氣泡，將比色杯放回孵育池，執(zhí)行空白檢查，反復(fù)檢測(cè)20 次，統(tǒng)計(jì)扣除水空白后的吸光度值，計(jì)算其均值為4800，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為6.72，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.14%。

2.2.1.2 試劑艙溫度波動(dòng)引入的不確定度 用經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)的精度為0.1℃的德國(guó)testo 735 溫度檢測(cè)儀探頭放入試劑倉(cāng)中，待溫度穩(wěn)定后，每隔1 min 測(cè)定1 次溫度，檢測(cè)20 次，測(cè)得試劑艙溫度值在（20.0±3.0）℃，溫度波動(dòng)＜2℃。將溫度波動(dòng)認(rèn)為均勻分布，則ɑ（置信區(qū)間半寬度）=1；包含因子，標(biāo)準(zhǔn)不確定度u=ɑ/=0.57℃，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為2.85%。

2.2.1.3 孵育盤(pán)溫度波動(dòng)引入的不確定度 用經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)的精度為0.1℃的溫度檢測(cè)儀探頭放入試劑倉(cāng)中，待溫度穩(wěn)定后，每隔1 min 測(cè)定1 次溫度，檢測(cè)20 次，測(cè)得試劑艙溫度值在（37.0±0.3）℃，溫度波動(dòng)＜2℃。將溫度波動(dòng)認(rèn)為均勻分布，則ɑ=0.1；包含因子，標(biāo)準(zhǔn)不確定度u=ɑ/k=0.=0.057℃，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.15%。

表1 “自上而下”方法評(píng)定六項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的測(cè)量不確定度

2.2.1.4 儀器加樣系統(tǒng)重復(fù)性和穩(wěn)定性引入的不確定度 加樣系統(tǒng)包括試劑針和樣本針裝置，利用羅氏免疫分析儀軟件將樣本針和試劑針的加樣準(zhǔn)確性轉(zhuǎn)換為吸光度值，設(shè)其為三角分布，吸光度均值為135，標(biāo)準(zhǔn)差為2.8，則ɑ=1.4；包含因子，標(biāo)準(zhǔn)不確定度u=ɑ/k=1.4/=0.57，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.42%。

2.2.1.5 攜帶污染率引入的不確定度 低值樣本測(cè)量5 次，后分別進(jìn)行高值1 次檢測(cè)，低值1 次檢測(cè)，重復(fù)3 次，計(jì)算攜帶污染率值，公式：（3 次低值均值-5 次高值均值）/3 次iSAP（羅氏攜帶污染檢測(cè)試劑）均值。計(jì)算的均值為181 ppm，標(biāo)準(zhǔn)差為9 ppm，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.32%。

2.2.2 其他因素引入的測(cè)量不確定度

2.2.2.2 離心機(jī)校準(zhǔn)引入的測(cè)量不確定度 實(shí)驗(yàn)室湖南長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)校準(zhǔn)引用《JJF（浙）1117-2015 醫(yī)用離心機(jī)校準(zhǔn)規(guī)范》[2]，引用離心機(jī)校準(zhǔn)報(bào)告，得標(biāo)準(zhǔn)不確定度9.6 r/min，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.32%。

2.2.2.3 不同批號(hào)試劑引入的測(cè)量不確定度 采用3個(gè)不同批號(hào)分別上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)批號(hào)均采用同一濃度檢測(cè)10 次，采用貝賽爾公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，標(biāo)準(zhǔn)不確定度等于1 倍標(biāo)準(zhǔn)差，公式：u=，其中u 為測(cè)量不確定度，xi為單個(gè)測(cè)量量,xˉ為平均值，n 為測(cè)量次數(shù)。

六項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物不同批號(hào)試劑引入的不確定度經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后為：AFP：（9.99±0.38）ng/mL（k=2），CEA：（5.18±0.21）ng/mL（k=2），CA125：（35.71±1.24）U/mL（k=2），CA153：（22.14±1.17）U/mL（k=2），CA199：（21.67±0.68）U/mL（k=2），TPSA：（4.29±0.18）ng/mL（k=2）；其相對(duì)測(cè)量不確定度為3.84%、3.86%、3.47%、5.29%、3.15%、4.19%。

2.2.2.4 校準(zhǔn)品引入的測(cè)量不確定度 采用B 類(lèi)評(píng)定方法直接引用校準(zhǔn)品溯源性文件中不確定度數(shù)值。見(jiàn)表1。

2.2.2.5 人員引入的測(cè)量不確定度 從事免疫檢驗(yàn)工作人員均是CNAS 授權(quán)簽字人，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的崗前培訓(xùn)和豐富的專(zhuān)業(yè)知識(shí)，人員因素可忽略不計(jì)。

2.2.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

除了試劑、校準(zhǔn)品外，六項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物存在共同的不確定來(lái)源，包括設(shè)備吸光度重復(fù)性，試劑艙溫度波動(dòng)，孵育盤(pán)溫度波動(dòng)，加樣系統(tǒng)重復(fù)性和準(zhǔn)確性，系統(tǒng)攜帶污染率，環(huán)境溫、濕度波動(dòng)，離心機(jī)校準(zhǔn)七大不確定來(lái)源分量，將其合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為14.8，相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度6.6%。對(duì)六項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行全面、系統(tǒng)的分析后，識(shí)別出實(shí)驗(yàn)室可能的不確定度來(lái)源（校準(zhǔn)、試劑、儀器設(shè)備和環(huán)境溫度等）并加以評(píng)定。見(jiàn)表2。

2.3 兩種方法評(píng)定不確定度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

“自下而上”方法評(píng)定六項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的測(cè)量不確定度的結(jié)果與“自上而下”方法評(píng)定的結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.500，P ＞0.05）。

3 討論

隨著人類(lèi)對(duì)測(cè)量質(zhì)量的不斷探索，測(cè)量不確定度在20 世紀(jì)60 年代被引入[3]。經(jīng)過(guò)近60 年的發(fā)展，測(cè)量不確定度被應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，在計(jì)量學(xué)領(lǐng)域中，不確定度被認(rèn)為是測(cè)量結(jié)果本身的一部分[4]，而在臨床檢驗(yàn)中，測(cè)量不確定度則被認(rèn)為是測(cè)量系統(tǒng)檢驗(yàn)結(jié)果的固有屬性[5-7]。

表2 “自下而上”方法評(píng)定六項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的測(cè)量不確定度

目前，測(cè)量不確定度和總誤差的概念一直都是檢驗(yàn)專(zhuān)業(yè)爭(zhēng)論的話題，二者均是對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果和真值出現(xiàn)概率的追求。但是，經(jīng)典的誤差理論并不完全適用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的實(shí)際工作[8]。雖然嚴(yán)孝嶺等[9]認(rèn)為不確定度與總誤差具有數(shù)據(jù)上的一致性，但測(cè)量不確定度具體應(yīng)用于臨床，更能幫助測(cè)量值在醫(yī)療診斷和治療效果監(jiān)測(cè)方面體現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[10]，表現(xiàn)在同一患者前后結(jié)果的比較、醫(yī)學(xué)決定水平和生物參考區(qū)間的應(yīng)用等方面[11]。

國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的測(cè)量不確定度表示指南（GUM）[12]中的“模式辦法”經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn)形成目前的“自下而上”法，是不確定度評(píng)定的金標(biāo)準(zhǔn)。由于“模式方法”計(jì)算繁瑣、過(guò)程復(fù)雜，國(guó)際實(shí)驗(yàn)室推出Nordtest 準(zhǔn)則，采用實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)定。楊振華[13]建議采用“經(jīng)驗(yàn)辦法”即“自上而下”的方法進(jìn)行測(cè)量過(guò)程中的不確定度評(píng)定，之后張曉紅等[14]采用Nordtest 準(zhǔn)則，利用“室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)和室間質(zhì)評(píng)數(shù)據(jù)”評(píng)定了21 項(xiàng)生化項(xiàng)目的測(cè)量不確定度，并認(rèn)為Nordtest 準(zhǔn)則適合目前臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目的不確定度評(píng)估。同年，Magnusson等[15]也依據(jù)Nordtest 準(zhǔn)則采用室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)數(shù)據(jù)完成不確定度評(píng)定。目前，有文章采用質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)、PT數(shù)據(jù)和質(zhì)控品數(shù)據(jù)對(duì)血清腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行測(cè)量不確定度評(píng)定[16-17]，也有報(bào)道[18-19]采用GUM 方法進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)參考方法和分類(lèi)計(jì)數(shù)的不確定度評(píng)估，而未見(jiàn)采用分析各不確定度分量來(lái)源的“自下而上”方法對(duì)全自動(dòng)生化免疫檢測(cè)系統(tǒng)中腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行不確定度評(píng)定的報(bào)道。本研究對(duì)腫瘤標(biāo)志物同時(shí)進(jìn)行兩種方法的不確定度評(píng)定，兩個(gè)方法中均同時(shí)采用A 類(lèi)和B 類(lèi)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法。本研究結(jié)果提示，采用“自下而上”的方法比“自上而下”的方法所得不確定度數(shù)據(jù)一致性偏小，這與楊振華[13]的觀念一致，采用模式辦法所得不確定度往往較小，由于存在忽視某些重要不確定度來(lái)源分量的可能。但是將兩個(gè)方法所得不確定度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較發(fā)現(xiàn)兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。

本研究數(shù)據(jù)可知，采用“自上而下”方法評(píng)定測(cè)量不確定度時(shí)，批間精密度引入的復(fù)現(xiàn)性分量和PT 數(shù)據(jù)引入的偏移不確定度分量是主要的不確定度來(lái)源，校準(zhǔn)和批內(nèi)精密度的影響作用較小，但不可忽略不計(jì)。實(shí)驗(yàn)室可通過(guò)降低批間精密度對(duì)合成不確定度的影響，進(jìn)而改進(jìn)相對(duì)不確定度。采用“自下而上”的方法，不同來(lái)源的不確定度分量對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的影響作用由大到小依次為：系統(tǒng)攜帶污染率、批間試劑的差異、環(huán)境溫濕度的波動(dòng)、試劑艙溫度波動(dòng)、校準(zhǔn)品、加樣的重復(fù)性和準(zhǔn)確性、離心機(jī)的校準(zhǔn)、儀器吸光度的波動(dòng)。可見(jiàn)，檢測(cè)項(xiàng)目的不確定度主要來(lái)源于檢測(cè)系統(tǒng)和環(huán)境的波動(dòng)，其次才是試劑批間的差異。實(shí)驗(yàn)室可以通過(guò)嚴(yán)格監(jiān)控儀器設(shè)備的校準(zhǔn)和提高環(huán)境穩(wěn)定性進(jìn)而降低測(cè)量不確定度，提高檢測(cè)質(zhì)量。

專(zhuān)家[12-13]認(rèn)為采用“自下而上”對(duì)檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行全面分析，識(shí)別每個(gè)可能的不確定度來(lái)源并加以評(píng)定的方法費(fèi)事費(fèi)力。本研究?jī)H引用ISO15189 認(rèn)可準(zhǔn)備階段所完成的儀器校準(zhǔn)報(bào)告、校準(zhǔn)品溯源性報(bào)告、實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)校準(zhǔn)報(bào)告、溫濕度校準(zhǔn)報(bào)告以及不同批號(hào)試劑的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行了“自下而上”方法的評(píng)定。并且將其結(jié)果與被大眾所接受的Nordtest 準(zhǔn)則評(píng)定的不確定度結(jié)果比較，得到了理想的結(jié)果，證明其可行性。此外，由于采用“自上而下”的方法需要6 次PT 數(shù)據(jù)才能完成偏移引入的不確定度評(píng)定[20-22]，對(duì)于每年衛(wèi)生部組織的能力驗(yàn)證只有5 個(gè)樣本的項(xiàng)目，要完成檢測(cè)項(xiàng)目的不確定度評(píng)定需要1 年以上的PT 數(shù)據(jù)，不適用于急需進(jìn)行不確定度評(píng)定的實(shí)驗(yàn)室。本研究中的“自下而上”的方法利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)和部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)即可完成評(píng)定工作，在一定程度上具有實(shí)驗(yàn)室的適用性。

對(duì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的各分量進(jìn)行數(shù)學(xué)合成并不是僅僅為了得到一個(gè)合成不確定度[23]，而是為了查找影響檢測(cè)結(jié)果的主要因素，進(jìn)而提高檢驗(yàn)質(zhì)量，達(dá)到持續(xù)改進(jìn)的目的，以滿(mǎn)足臨床的需求。本研究則以測(cè)量結(jié)果和組成測(cè)量過(guò)程的各因素為兩個(gè)切入點(diǎn)分別進(jìn)行的不確定度分量來(lái)源的分析，明確檢驗(yàn)質(zhì)量提高的方向。因此，本研究中采用的“自上而下”和“自下而上”兩個(gè)方法進(jìn)行不確定度評(píng)估均存在可行性和適用性。