楊佳蕾，尹世敏，陳華蕾

1.國家神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100070；2.火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心，全軍腦卒中醫(yī)療救治研究中心 神經(jīng)內(nèi)科，北京 100088；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院 腫瘤診治中心，北京100015

卒中是我國居民的第一位死亡原因，也是傷殘調(diào)整生命年的首要原因以及壽命損失年的主要原因之一。卒中可以分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中約占87%[1]。缺血性腦卒中的損傷機(jī)制尚未完全清楚，主要與缺血缺氧后血腦屏障破壞、炎性反應(yīng)、細(xì)胞死亡、興奮性毒性物質(zhì)釋放、細(xì)胞內(nèi)鈣超載及氧化應(yīng)激等有關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)細(xì)胞遷移、突觸生長、髓鞘形成、血管生成、神經(jīng)損傷后修復(fù)再生等過程中發(fā)揮了重要作用。在不同生理和病理?xiàng)l件下，各種刺激因素如生長因子、細(xì)胞因子和活性氧等都可以影響MMPs的表達(dá)及活性[2]。在缺血性腦卒中后，MMPs的表達(dá)譜發(fā)生變化，并且參與破壞血腦屏障（blood-brain barrier，BBB），導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡、炎性反應(yīng)、腦水腫、腦出血、髓鞘降解以及神經(jīng)功能缺損[3]。在MMPs家族中，MMP-9的作用尤為顯著。本文對(duì)MMP-9在缺血性腦卒中的損傷及修復(fù)中的作用機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為缺血性腦卒中提供新的診療靶點(diǎn)。

1 MMP概述

MMPs是一類鋅依賴性內(nèi)肽酶，可降解幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分，其作用底物十分廣泛，包括趨化因子、生長因子及其結(jié)合蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制劑以及細(xì)胞內(nèi)蛋白，從而起到相應(yīng)的生理病理作用[4]。人體內(nèi)表達(dá)的MMPs多達(dá)25種，其結(jié)構(gòu)從N端到C端包括以下5個(gè)部分，即信號(hào)肽、前肽、催化結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)和血紅素結(jié)合蛋白樣C端區(qū)[5]。MMPs可以廣義地分為組織型（如MMP-2及MMP-14）和誘導(dǎo)型（MMP-3及MMP-9）。根據(jù)MMPs的結(jié)構(gòu)和底物特異性，可進(jìn)一步分為以下幾種亞型，即明膠酶（gelatinases）、膠原酶（collagenases）、間質(zhì)溶解素（stromelysins）、基質(zhì)溶解素（matrilysins）、膜型 MMP（membrane-type MMP，MT-MMP）和其他類型MMP。MMP-9是MMPs亞家族中的一種，又稱為明膠酶B（gelatinase B）。人MMP-9由染色體20q13.12基因編碼表達(dá)，其酶原的相對(duì)分子質(zhì)量為92 000，經(jīng)過剪切后其活性形式的相對(duì)分子質(zhì)量為83 000。MMP-9可以由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等分泌，主要在細(xì)胞外空間起作用。MMP-9可以分解Ⅳ型膠原蛋白、Ⅴ型膠原蛋白、彈性蛋白、纖維連接蛋白、變性間質(zhì)蛋白等多種ECM成分，在組織發(fā)育、損傷與修復(fù)中起重要作用[6-7]。

2 MMP-9與缺血性腦卒中

MMP-9在正常腦組織中低表達(dá)，但在缺血性腦卒中后表達(dá)增加，通過破壞BBB、促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤及炎性因子釋放、誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞死亡、缺血組織出血轉(zhuǎn)化等諸多機(jī)制參與腦組織損傷。

2.1 MMP-9與血腦屏障

BBB是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織的物理屏障，由內(nèi)皮細(xì)胞及其緊密連接、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞足突以及基膜構(gòu)成，可以阻礙毒性物質(zhì)、炎癥因子、炎細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。構(gòu)成BBB的蛋白質(zhì)分子如緊密連接蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、白細(xì)胞黏附分子、基底膜蛋白等，對(duì)調(diào)控其通透性起重要作用[8]。在腦缺血早期，MMP-9主要由中性粒細(xì)胞分泌，之后以小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主。缺血區(qū)局部的神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也可過表達(dá)MMP-9[9-10]。腦缺血后4～6 h MMP-9活性顯著升高，48 h達(dá)到高峰，72 h或更長時(shí)間恢復(fù)至基線水平。由于動(dòng)物研究模型不同，MMP-9改變的時(shí)程也有所變化，但既往研究報(bào)道MMP-9的活性增加時(shí)程與血腦屏障降解、通透性增加密切相關(guān)[9-11]。

真核細(xì)胞中存在由纖維蛋白網(wǎng)構(gòu)成的細(xì)胞骨架，可以維持細(xì)胞形態(tài)并影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，其中由肌動(dòng)蛋白構(gòu)成的微絲具有細(xì)胞連接與屏障功能。腦組織缺血缺氧誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)上調(diào)可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞中的微絲發(fā)生斷裂或重構(gòu)，進(jìn)而增加BBB的通透性[12]。MMP-9在分解BBB基底膜蛋白的同時(shí)，降低了血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致血管源性水腫、出血轉(zhuǎn)化和死亡率增加[13-14]。MMP-9還可以誘導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)，調(diào)控各種細(xì)胞因子和炎癥趨化因子活性，如TNF-α、ICAM-1、CXCL12等[7,15]。與此同時(shí)，促炎因子迅速激活腦內(nèi)組織型免疫細(xì)胞即小膠質(zhì)細(xì)胞，并廣泛募集炎癥細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、不同亞型的T細(xì)胞和其他炎性細(xì)胞。其中，中性粒細(xì)胞最早滲入腦組織并釋放MMP-9[11]。但是，既往研究表明，中性粒細(xì)胞可以表達(dá)癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1（carcinoembryonic antigen-related celladhesion molecule 1，CEACAM1）。采用CEACAM1敲除小鼠制作腦缺血模型，分泌MMP-9的中性粒細(xì)胞增加導(dǎo)致血腦屏障破壞加劇。由此可見調(diào)控CEACAM1+中性粒細(xì)胞與分泌MMP-9的中性粒細(xì)胞的亞群平衡可能成為治療靶點(diǎn)[16]。周細(xì)胞是神經(jīng)血管單元的組成部分，對(duì)維持BBB完整性起重要作用。既往研究結(jié)果證明，缺血性腦卒中早期周細(xì)胞是神經(jīng)血管單元中最易受損且最早死亡的細(xì)胞，其死亡可以直接導(dǎo)致BBB完整性受損。另一方面，在體雙光子成像顯示，血管內(nèi)血液外滲主要發(fā)生在周細(xì)胞胞體與毛細(xì)血管壁密切接觸的部位，而這一分布不均勻的滲漏主要與周細(xì)胞分布不均以及周細(xì)胞在炎癥刺激下分泌的MMP-9有關(guān)[17-18]。由此可見，缺血性腦卒中后MMP-9可通過多種途徑直接或間接破壞BBB、增加血管通透性，同時(shí)缺血灶局部產(chǎn)生的趨化因子促使血液循環(huán)中的炎細(xì)胞浸潤，加重炎癥反應(yīng)引起的組織損傷，故MMP-9介導(dǎo)的BBB破壞是引起腦缺血損傷的重要機(jī)制之一。

2.2 MMP-9與神經(jīng)細(xì)胞死亡

MMP-9介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡與ECM的破壞有關(guān)。ECM是由膠原蛋白、彈性蛋白、纖維連接蛋白和蛋白聚糖組成的非細(xì)胞性三維分子網(wǎng)絡(luò)。ECM不僅為神經(jīng)細(xì)胞提供物理支撐，還能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、生長、遷移和分化[19]。在腦缺血后，過表達(dá)的MMP-9降解ECM，進(jìn)而破壞神經(jīng)細(xì)胞與ECM間的相互作用，使其與ECM的黏附性下降并脫離，激活死亡受體介導(dǎo)的外源性信號(hào)通路或線粒體參與的內(nèi)源性信號(hào)通路，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。這種由于細(xì)胞與ECM分離或相互作用發(fā)生異常而誘發(fā)的細(xì)胞程序性死亡又稱為失巢凋亡[20]。除此之外，腦缺血后產(chǎn)生的一氧化氮介導(dǎo)S-亞硝基化（S-nitrosylation）反應(yīng)激活MMP-9可以直接引起神經(jīng)元凋亡，而給予MMP抑制劑GM6001或明膠酶抑制劑SB-3CT可以阻斷神經(jīng)元凋亡、減小腦梗塞體積、改善神經(jīng)功能[21-22]。除了局灶腦缺血可以引發(fā)大量神經(jīng)元凋亡，全腦缺血后部分區(qū)域如海馬、皮層特定亞層也會(huì)發(fā)生選擇性神經(jīng)元死亡。在全腦缺血后，海馬MMP-9表達(dá)顯著上調(diào)，而采用廣譜MMP抑制劑BB-94或敲除MMP-9后神經(jīng)元死亡顯著減少[23]。上述研究表明，MMP-9可以通過直接或間接途徑誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡，局灶給予MMP-9特異性抑制劑可能為減少神經(jīng)元死亡、減輕神經(jīng)功能損傷提供新的治療方法。

2.3 MMP-9與出血轉(zhuǎn)化

出血轉(zhuǎn)化是缺血性腦卒中的嚴(yán)重并發(fā)癥，可以引起神經(jīng)功能的突然惡化，既往研究提示MMP-9的過表達(dá)與出血轉(zhuǎn)化關(guān)系密切。對(duì)于急性腦出血且未采用重組組織型纖溶酶原激活劑（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）溶栓的患者，有研究對(duì)比了出血轉(zhuǎn)化及非出血轉(zhuǎn)化患者血漿中MMP-9的含量，發(fā)現(xiàn)出血轉(zhuǎn)化組外周血MMP-9的含量明顯升高，并且通過多因素分析校正其他危險(xiǎn)因素發(fā)現(xiàn)，急性腦出血患者發(fā)病24 h內(nèi)血漿MMP-9水平可以作為發(fā)生腦缺血后出血轉(zhuǎn)化的獨(dú)立預(yù)測因素[24-25]。對(duì)于急性腦出血且采用rt-PA的患者，rt-PA在改善卒中預(yù)后的同時(shí)，也在一定程度上增加了出血轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)。rt-PA靜脈溶栓前，患者外周血MMP-9水平不但是溶栓后出血轉(zhuǎn)化最強(qiáng)有力的預(yù)測因子，并且其水平高低與出血轉(zhuǎn)化程度有明確相關(guān)性[26]。既往有前瞻性研究驗(yàn)證了溶栓前MMP-9≥140 ng/mL可以預(yù)測rt-PA靜脈溶栓后的出血轉(zhuǎn)化事件[27]。機(jī)制研究提示，rt-PA可以通過低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（low-density lipoprotein receptor related protein，LRP）上調(diào)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的MMP-9 mRNA，進(jìn)而增加蛋白水平，破壞BBB并導(dǎo)致出血轉(zhuǎn)化[28]。除此之外，諸多基礎(chǔ)疾病如高血壓、糖尿病和血脂異常等均可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞并降低連接完整性，促進(jìn)溶栓治療后MMP-9誘導(dǎo)的血管破裂。綜上，MMP-9可以預(yù)測出血轉(zhuǎn)化發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，有助于評(píng)價(jià)溶栓治療安全性，與MMPs抑制劑的聯(lián)合使用可在一定程度上減少出血轉(zhuǎn)化并改善預(yù)后。

2.4 MMP-9與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子

基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）可與 MMPs結(jié)合并抑制其活性。目前已發(fā)現(xiàn)的TIMP家族成員包含TIMP-1～TIMP-4，每種TIMP以非特異的方式與MMPs進(jìn)行1∶1結(jié)合，形成TIMP-MMP復(fù)合物，通過與MMP活性位點(diǎn)的Zn2+相互作用激活其水解過程。4種TIMP對(duì)MMP-9均有抑制作用，其中TIMP-1的作用尤為顯著。采用TIMP-1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因鼠制作腦缺血模型，其MMP-9水平顯著低于野生型小鼠，BBB損傷及梗塞程度均減輕；反之，采用TIMP-1敲除小鼠制作腦缺血模型，可以引起MMP-9活性增加，進(jìn)而加重組織損傷[29]。TIMPs/MMPs表達(dá)平衡還與缺血損傷程度及并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。采用小鼠大腦中動(dòng)脈梗塞再灌注及rt-PA溶栓模型發(fā)現(xiàn)，在腦缺血后不同時(shí)段，TIMPs與MMPs蛋白表達(dá)譜發(fā)生變化，而rt-PA的使用可以導(dǎo)致TIMPs/MMPs含量失衡[30]。TIMPs作為MMPs的內(nèi)源性抑制劑，具有一定的腦保護(hù)作用，可以為新藥研發(fā)提供重要思路。

3 治療

目前，已經(jīng)有較多研究探討了抑制MMPs以減輕腦組織損傷的治療方法，如MMPs抑制劑SB-3CT、BB-1101、Ro28-2653等。SB-3CT是一種競爭性MMP-2和MMP-9的雙重抑制劑，可減輕局灶性缺血性腦損傷。BB-1101是一種廣譜MMPs抑制劑，可以在減輕DNA氧化損傷的同時(shí)，保護(hù)BBB的緊密連接，防治出血轉(zhuǎn)化并發(fā)癥。Ro28-2653是一種新型廣譜MMPs抑制劑，可以在腦缺血48 h顯著減輕腦損傷[5]。除了MMPs抑制劑，物理療法（無創(chuàng)性迷走神經(jīng)刺激、常壓高氧治療、局部低溫治療等）、臨床藥物（如去甲斑蝥素、米諾環(huán)素、黃體酮等）、化合物（L-902、前列腺素EP4受體激動(dòng)劑688、尼克酰胺單核苷酸等）以及中藥提取物都有一定的MMPs抑制作用，羥肟酯類抑制劑、非羥肟酸鹽抑制劑以及針對(duì)結(jié)合位點(diǎn)的藥物和免疫治療也已取得了進(jìn)展[31]。深入認(rèn)識(shí)MMPs在腦缺血損傷機(jī)制中的作用，有助于研發(fā)新的神經(jīng)保護(hù)策略，為探索更安全、有效的治療方法奠定基礎(chǔ)。