吳海霞 田志芳

摘要：以銀杏（Ginkgo biloba L.）果實（白果）為原料，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化白果多糖的提取工藝，并分析白果多糖的抑菌活性。以多糖得率為指標(biāo)，通過單因素試驗及響應(yīng)面分析，探討液料比、提取溫度及提取時間等因素對白果多糖得率的影響，從而建立白果多糖的提取工藝模型，得出其最佳提取工藝條件;結(jié)合牛津杯法及二倍稀釋法，分析白果多糖的抑菌活性及最小抑菌質(zhì)量濃度。結(jié)果表明，白果多糖的最佳提取工藝條件如下：液料比45 ml∶1 g，95 ℃浸提3.0 h，在該條件下多糖得率為19.67%。抑菌試驗結(jié)果表明，白果多糖對細(xì)菌有一定的抑制活性，對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的抑制活性最強，最小抑菌質(zhì)量濃度為2.50 mg/ml;白果多糖對大腸桿菌（Escherichia coli）的抑制活性也較強，當(dāng)白果多糖質(zhì)量濃度為15.00 mg/ml時，抑菌圈直徑約為2.25 cm;白果多糖對真菌幾乎無抑制活性，因而不具有廣譜抑菌活性。

關(guān)鍵詞：銀杏果實（白果）;多糖;響應(yīng)面分析;抑菌活性

中圖分類號：S792.950.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）06-1551-08

Abstract：Ginkgo biloba seed was used as raw material， the conditions of extracting polysaccharides were optimized based on response surface method （RSM）， and the antibacterial activity was studied. The yield of polysaccharide was used as the index， single factor tests and RSM were performed to study the effects of liquid-to-solid ratio， extraction temperature and extraction time on polysaccharide yield. The mathematical model of polysaccharides extraction was established， and the optimum extraction conditons were obtained. The antibacterial activity and minimum inhibitory concentration of polysaccharides were analyzed by Oxford cup method and double dilution method. The results showed that the optimum extraction conditons were as follows： liquid-to-solid ratio 45∶1（ml/g）， extraction temperature 95 ℃ and extraction time 3.0 h. Under the optimum extraction conditions， the yield of polysaccharide was 19.67%. The results of antibacterial test indicated that polysaccharide from Ginkgo biloba seed showed the strongest antimicrobial activity against Bacillus subtilis， and the minimum inhibitory concentration was 2.50 mg/ml. The polysaccharide from Ginkgo biloba seed also had strong antibacterial activity against Escherichia coli. When the mass concentration of polysaccharide was 15.00 mg/ml， the antibacterial diameter was 2.25 cm. But the polysaccharide has no inhibitory activity against fungi and has no broad-spectrum antimicrobial activity.

Key words：Ginkgo biloba L. fruit（Ginkgo biloba seed）;polysaccharide;response surface method;antibacterial activity

銀杏（Ginkgo biloba L.）的果實俗稱白果，又名鴨腳子、靈眼、佛指柑[1]。隨著銀杏種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大，白果的產(chǎn)量也隨之增加，民間有“白果有毒”[2-3]的說法，從而使白果的加工利用受到限制，嚴(yán)重影響了銀杏產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此亟需研究和挖掘具有高新技術(shù)含量的白果深加工產(chǎn)品。多糖是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高分子化合物，具有多種生物活性[4-7]，在生物體內(nèi)起著重要作用。大量研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉、外種皮中的多糖具有免疫調(diào)節(jié)[8]、抗腫瘤[8-9]、抗衰老[10-11]等生物活性。也有研究發(fā)現(xiàn)，很多植物來源的多糖具有抑菌活性，例如姚以才等[12]研究發(fā)現(xiàn)，蘆根多糖對酵母菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉均有不同的抑菌活性;Jiang等[13]以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及大腸桿菌為供試菌，研究了花生水溶性粗多糖的抑菌活性，認(rèn)為當(dāng)其質(zhì)量濃度為12.5 mg/ml時，可以抑制革蘭氏陽性菌的生長;蔡銘等[14]、袁海娜[15]、胡國元等[16]、孟俊龍等[17]、萬艷娟等[18]、陳燦輝等[19]也分別對黑木耳多糖、仙人掌多糖、金針菇多糖、香菇多糖、南瓜多糖、竹筍多糖等的抑菌活性進(jìn)行了分析。但是目前有關(guān)白果多糖抑菌活性的相關(guān)研究仍較少[20-21]。

在前期的研究中，筆者已經(jīng)對白果蛋白[22]、白果酚酸[3]的抑菌活性進(jìn)行了探討。本研究在對白果多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對白果多糖的抑菌活性進(jìn)行分析，以期為挖掘白果價值、促進(jìn)白果的應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

本試驗所用白果為大佛指，購自江蘇省泰州市集泰農(nóng)產(chǎn)品有限公司。將白果冷凍、干燥、粉碎后過40目篩，用石油醚脫色、脫脂后得到白果粉，備用。

本試驗所用主要試劑石油醚、無水乙醇、丙酮、乙醚、三氯乙酸、硝酸鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、氯化鉀（分析純）與高溫淀粉酶、糖化酶（化學(xué)純），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、虎紅瓊脂粉等（分析純），購自上海博微生物科技有限公司。

本試驗所用2種細(xì)菌[大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）]和3種真菌[戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）、魯氏毛霉（Mucor rouxianus）、黑根霉（Rhizopus nigricans）]由運城學(xué)院食品微生物與發(fā)酵實驗室提供;另外2種細(xì)菌[枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）]和另外3種真菌[產(chǎn)紫青霉（Penicillium purpurogenum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、沙門柏干酪青霉（Penicillium camemberti）]由南京林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程實驗室提供。所有細(xì)菌均用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，戴爾凱氏有孢圓酵母用虎紅瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余真菌均用察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2主要儀器

R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，產(chǎn)自瑞士BUCHI;Lambda 35紫外可見分光光度計，產(chǎn)自美國PerkinEimer;2-16k臺式高速冷凍離心機，產(chǎn)自德國SIGMA;ALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥機，產(chǎn)自德國Christ;HHS-250B恒溫恒濕培養(yǎng)箱，產(chǎn)自南京恒裕儀器設(shè)備制造有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1白果多糖的制備（1）白果多糖的浸提流程：脫脂白果粉→95 ℃水浴浸提并加0.1%高溫α-淀粉酶酶解約1 h（通過KI定性檢測判斷原料中的淀粉是否完全水解）→加0.1%糖化酶→95 ℃保溫浸提→過濾，取上清液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→4 000 r/min離心10 min，取上清液→調(diào)節(jié)pH值為4.62 →靜置過夜除蛋白質(zhì)→4 000 r/min離心10 min，取上清液→用3倍體積的95%乙醇沉淀、過夜→5 000 r/min離心10 min，取沉淀→分別用無水乙醇、無水乙醚、無水丙酮洗滌沉淀→-40 ℃冷凍干燥約48 h→白果粗多糖。

（2）白果多糖精制流程：白果粗多糖復(fù)溶于蒸餾水→4 000 r/min離心10 min，取上清液→Sevag法脫蛋白質(zhì)→透析→旋蒸濃縮→分級醇沉→9 000 r/min離心10 min→收集沉淀（50%～80%醇沉）→無水丙酮、無水乙醚洗滌→風(fēng)干→冷凍干燥→白果精制多糖，醇沉過程中用的醇為乙醇。其中，Sevag法脫蛋白質(zhì)的步驟：按1 g∶18 ml的料液比將粗多糖充分復(fù)溶于蒸餾水中，4 000 r/min離心10 min后取上清液;將上清液與Sevag試劑（三氯甲烷、正丁醇的體積比為4∶1）按2∶1的體積比混合，充分振蕩30 min，進(jìn)行脫蛋白質(zhì)處理，3 000 r/min離心2 min，取上清液。重復(fù)多次上述脫蛋白質(zhì)操作，直至中間的蛋白質(zhì)層消失并且于280 nm紫外檢測無明顯吸收峰。

分級醇沉的步驟：將復(fù)溶脫蛋白質(zhì)后的多糖溶液蒸發(fā)濃縮至原體積的1/5，往其中加入無水乙醇，使其終濃度為50%，靜置過夜，9 000 r/min高速離心10 min，取上清液并量體積后，繼續(xù)加入無水乙醇，使其終濃度為80%，靜置過夜后于9 000 r/min高速離心10 min，收集沉淀得50%～80%醇沉級分。

（3）白果多糖得率的計算：白果多糖得率=[粗多糖質(zhì)量（g）/原料質(zhì)量（g）]×100%。

（4）精制白果多糖純度的分析：采用考馬斯亮藍(lán)法對步驟（2）中得到的精制白果多糖中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行分析測定（回歸模型為Y=6.400x+0.009，R2=0.998 0，其中x為牛血清蛋白含量，Y為吸光度），并計算其含量，測定波長為595 nm;采用蒽酮-硫酸法對精制白果多糖中的白果多糖含量進(jìn)行分析測定（回歸模型為Y=0.616x-0.007 3，R2=0.998 5，其中x為白果多糖含量，Y為吸光度），并計算其純度，測定波長為630 nm。結(jié)果表明，該白果多糖中的蛋白質(zhì)含量為1.03%，白果多糖純度為92.39%±0.01%。

1.3.2單因素試驗分別稱取5.0 g脫脂白果粉于500 ml錐形瓶中，以蒸餾水為提取液，設(shè)置不同液料比（15 ml∶1 g、25 ml∶1 g、35 ml∶1 g、45 ml∶1 g、55 ml∶1 g）、不同浸提時間（1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h、5.0 h）、不同浸提溫度（45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃、85 ℃、95 ℃）及不同提取次數(shù)（ 1次、2次、3次），按照方法1.3.1中的白果多糖提取工藝路線對白果多糖進(jìn)行水浴浸提和乙醇沉淀，冷凍干燥后稱質(zhì)量，考察不同因素對白果多糖得率的影響。

1.3.3響應(yīng)面優(yōu)化試驗應(yīng)用Design-Expert 7.0軟件，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗結(jié)果，選取對多糖得率有顯著影響的3個因素[液料比（x1）、浸提時間（x2）、浸提溫度（x3）]為自變量，采用響應(yīng)面分析法設(shè)計3因素3水平試驗方案，以多糖得率為指標(biāo)，對多糖提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗因素與水平的設(shè)置見表1。根據(jù)試驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，建立回歸模型。

1.3.4抑菌活性研究（1）菌懸液的制備。采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行細(xì)菌接種，于37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)活化;細(xì)菌菌懸液的制備采用麥?zhǔn)媳葷岱ǎ{(diào)節(jié)OD540為0.15，制備活菌量約為108CFU/ml的細(xì)菌菌懸液，備用。取滅菌竹簽，在各真菌平板上挑取真菌孢子或菌絲于裝有10 ml無菌水的離心管中，渦旋振蕩混勻，得真菌菌懸液，備用。

（2）抑菌活性及最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）的分析。用牛津杯法進(jìn)行抑菌活性試驗，用2倍稀釋法分析最小抑菌質(zhì)量濃度。制備帶菌平板并按正三角形排列放置牛津杯，將各0.2 ml不同質(zhì)量濃度梯度的多糖溶液加入牛津杯中，以同體積的無菌水作空白對照。于（4±1） ℃冰箱中進(jìn)行4 h擴(kuò)散處理后，將細(xì)菌于37 ℃培養(yǎng)24 h，將真菌于28 ℃培養(yǎng)72 h，觀察各培養(yǎng)皿中菌落的生長情況并用十字交叉法記錄抑菌圈直徑，以幾乎無菌生長（抑菌圈直徑≥3.3 cm）的最低多糖溶液質(zhì)量濃度作為MIC[23]。每組試驗重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1液料比對白果多糖得率的影響液料比是影響物質(zhì)溶出的關(guān)鍵因素之一，在活性成分的浸提過程中，適當(dāng)增加溶劑用量，可有效增加物質(zhì)的溶出量。將白果粉分別以15 ml∶1 g、25 ml∶1 g、35 ml∶1 g、45 ml∶1 g和55 ml∶1 g的液料比與蒸餾水混合攪勻后，于90 ℃水浴浸提5.0 h。如圖1所示，多糖得率隨液料比的增大而提高，當(dāng)液料比為45 ml∶1 g時，多糖得率最高，為18.48%，顯著高于液料比為35 ml∶1 g時的多糖得率（P<0.05）;隨著液料比繼續(xù)增加，多糖得率的變化不顯著，說明此時物質(zhì)擴(kuò)散已達(dá)平衡狀態(tài)，繼續(xù)增加液料比對提高多糖得率的影響不大，并且溶劑用量的增大會極大增加后期的濃縮負(fù)荷及乙醇沉淀成本。綜上，選擇45 ml∶1 g的液料比進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.1.2浸提時間對白果多糖得率的影響浸提過程主要通過原料顆粒與浸提液的充分接觸而實現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的溶出。在一定的提取條件下，浸提時間的長短對目標(biāo)物質(zhì)是否能夠充分溶出有重要影響。從圖2可以看出，當(dāng)浸提時間為1.0～3.0 h時，隨著浸提時間的延長，多糖得率從12.34%提高至18.52%，并且各處理間的多糖得率差異顯著（P<0.05）;進(jìn)一步延長浸提時間至4.0～5.0 h后，多糖得率的變化趨于平緩，可見更長浸提時間對多糖得率的影響不顯著。適宜的浸提時間有利于原料顆粒細(xì)胞的細(xì)胞膜破裂，從而促進(jìn)多糖溶出，提高多糖得率，但是當(dāng)物質(zhì)溶出達(dá)到平衡后，浸提時間的繼續(xù)延長反而會增加能耗，降低效率，并且增加了雜質(zhì)溶出的機會。綜上，選擇3.0 h的浸提時間進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.1.3浸提溫度對白果多糖得率的影響在一般情況下，目標(biāo)化合物在溶劑中的溶解度隨著溫度的升高而提高。研究發(fā)現(xiàn)，較高的溫度能極大地減弱由范德華力、氫鍵等引起的溶質(zhì)與基質(zhì)之間的相互作用力，加速溶質(zhì)分子的解析，從而使溶質(zhì)從基質(zhì)中快速溶出。從圖3可以看出，多糖得率隨著浸提溫度的升高而不斷提高，在45～85 ℃溫度范圍內(nèi)，隨著浸提溫度的升高，多糖得率先顯著提高（P<0.05），之后趨于平緩，當(dāng)浸提溫度由85 ℃提高至95 ℃時，多糖得率的變化不顯著。主要是由于溫度的升高可以加速多糖類物質(zhì)的滲透、擴(kuò)散等，使其更容易被提取出來，但是溫度過高容易對多糖的結(jié)構(gòu)和性能產(chǎn)生影響。綜上，本試驗選擇85 ℃的浸提溫度進(jìn)行后續(xù)白果多糖的浸提試驗。

2.1.4浸提次數(shù)對白果多糖得率的影響為了使原料得到充分利用，白果粉用蒸餾水浸提1次后，過濾浸提液，取上清液，然后將沉淀按照方法1.3.1的浸提工藝路線依次進(jìn)行2次、3次、4次浸提。如圖4所示，浸提1次后，白果粉的多糖得率為18.41%，重復(fù)浸提1次（浸提2次）后累計多糖得率為21.27%，較浸提1次的多糖得率顯著提高（P<0.05），但浸提3次、4次后的累計多糖得率分別為21.51%、21.71%，與浸提2次的結(jié)果無顯著差異。由此可見，從提高效率、經(jīng)濟(jì)節(jié)約的角度考慮，選擇浸提2次為宜。

2.2響應(yīng)面優(yōu)化浸提工藝試驗結(jié)果分析

2.2.1回歸模型的建立及方差分析根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果（表2），用Design Expert軟件對多糖得率進(jìn)行回歸擬合，建立如下回歸模型：Y=19.21+0.36x1+0.53x2+2.76x3-0.64x1x2-0.83x1x3-1.70x21-2.07x22-1.39x23，式中，Y為多糖得率，x1、x2、x3分別為液料比、浸提時間、浸提溫度。

方差分析和顯著性檢驗結(jié)果（表3）表明，回歸模型自變量中的一次項x2、x3，交互項x1x3及二次項x21、x22、x23 這6項均為極顯著項，一次項x1、交互項x1x2 項為顯著項，表明液料比、浸提時間、浸提溫度均對多糖得率有顯著或極顯著影響。由表3還可以看出，失擬F值為0.97，說明使用該模型進(jìn)行擬合的效果很好;失擬項的P>0.050 0，表明使用該模型時其他因素對試驗結(jié)果的干擾較小;多糖得率回歸模型的P<0. 000 1，表明該回歸模型能很好地預(yù)測白果多糖的提取情況。

2.2.2不同因素交互對白果多糖得率的影響由表3可知，多糖得率回歸模型中的交互項x1x2（液料比與浸提時間的交互）作用影響顯著，x1x3（液料比與浸提溫度的交互）作用影響極顯著，因而對其進(jìn)行交互作用響應(yīng)面分析。

2.2.2.1液料比與浸提時間交互的影響由圖5可以看出，當(dāng)浸提溫度在0水平（85 ℃）、液料比為35 ml∶1 g～40 ml∶1 g時，隨著浸提時間的延長，多糖得率先緩慢升高后略微降低;當(dāng)液料比為40 ml∶1 g～55 ml∶1 g時，隨著浸提時間的延長，多糖得率呈現(xiàn)明顯的先升后降的趨勢;當(dāng)浸提時間為2.0 h時，隨著液料比的不斷增大，多糖得率呈現(xiàn)先緩慢升高后緩慢降低的趨勢，當(dāng)浸提時間延長至3.0 h時，多糖得率隨著液料比的增大呈現(xiàn)顯著的先升后降的趨勢。當(dāng)多糖得率較高時，液料比及浸提時間均在0水平附近。

2.2.2.2液料比與浸提溫度交互的影響由圖6可以看出，當(dāng)浸提時間為0水平（3.0 h）、液料比為35 ml∶1 g～55 ml∶1 g時，隨著浸提溫度的升高，多糖得率顯著提高;當(dāng)浸提溫度為75～95 ℃，液料比的變化對多糖得率的影響不明顯，當(dāng)浸提溫度較低時，隨著液料比增大，多糖得率先升高后略有降低，當(dāng)浸提溫度較高時，多糖得率較高。

2.2.3響應(yīng)面優(yōu)化及驗證試驗運用Design-Expert 7. 0軟件，在設(shè)置多糖得率為極大值的條件下，得到多糖浸提的最優(yōu)理論條件如下：液料比43.31 ml∶1 g，浸提時間3. 15 h，浸提溫度95 ℃，在此條件下的多糖得率預(yù)測值為20.66%。結(jié)合實際情況，對最優(yōu)理論浸提條件進(jìn)行調(diào)整，得到最佳浸提條件如下：液料比45 ml∶1 g，浸提時間3.0 h，浸提溫度95 ℃，在此條件下經(jīng)3次試驗驗證得出，多糖得率為19.67%±0.39%，與預(yù)測值（20.66%）間的誤差較小，且每組試驗結(jié)果均處于95%可信度區(qū)間（19.61%～21.70%），表明所得回歸模型可以較好地擬合白果多糖的浸提情況。

2.3抑菌活性分析

如表4所示，白果多糖對枯草芽孢桿菌（B.subtilis）的抑制活性最強，當(dāng)白果多糖質(zhì)量濃度為0.15 mg/ml時，其抑菌圈直徑即達(dá)（1.95±0.12） cm;隨著白果多糖質(zhì)量濃度的不斷增加，其抑菌圈直徑顯著增大（P<0.05），最小抑菌質(zhì)量濃度為2.50 mg/ml。白果多糖對大腸桿菌（E.coli）的抑制活性也較強，當(dāng)白果多糖質(zhì)量濃度為5.00 mg/ml時，抑菌圈直徑為2.25 cm。此外，白果多糖對綠膿假單胞菌（P.aeruginosa）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）也有一定的抑制作用，當(dāng)白果多糖質(zhì)量濃度為10.00 mg/ml時，抑菌圈直徑均約為1.60 cm。本試驗同時測定白果多糖對戴爾凱氏有孢圓酵母（T.delbrueckii）、魯氏毛霉（M.rouxianus）、黑根霉（R.nigricans）、產(chǎn)紫青霉（P.purpurogenum）、黑曲霉（A.niger）、沙門柏干酪青霉（P.camemberti）6種真菌的抑制活性，發(fā)現(xiàn)白果多糖對這6種真菌均沒有表現(xiàn)出明顯的抑制活性。因此認(rèn)為，白果多糖不具有廣譜抑菌活性。

3結(jié)論

采用響應(yīng)面分析法對白果多糖的浸提工藝進(jìn)行優(yōu)化并建立白果多糖浸提的回歸模型。結(jié)果表明，液料比、浸提時間及浸提溫度對白果多糖得率有顯著或極顯著影響。結(jié)合回歸模型及實際情況得到白果多糖提取的最優(yōu)條件如下：液料比45 ml∶1 g，浸提時間3.0 h，浸提溫度95 ℃，在此條件下白果多糖得率為19.67%±0.39%，與預(yù)測值的誤差較小。

抑菌試驗結(jié)果表明，白果多糖具有較強的抑菌活性，對革蘭氏陽性細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）、革蘭氏陰性細(xì)菌（大腸桿菌、綠膿假單胞菌）均有抑制活性，其中對枯草芽孢桿菌的抑制活性較強，最小抑菌質(zhì)量濃度為2.50 mg/ml，對大腸桿菌也有較強的抑制活性，當(dāng)白果多糖質(zhì)量濃度為10.00 mg/ml時，抑菌圈直徑約為2.61 cm，在相同質(zhì)量濃度（10.00 mg/ml）條件下，白果多糖對綠膿假單胞菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為1.50～1.60 cm。此外，由于白果多糖對真菌幾乎無抑制活性，因此不具有廣譜抑菌活性。

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（責(zé)任編輯：徐艷）