毛旖川，周強，朱默，汪靈杰，郭凌川，李勇剛

醒后卒中是急性腦卒中的一種特殊類型，是指患者在睡眠中發(fā)生的卒中。由于患者發(fā)病時間不明確，常被排除在溶栓治療之外。目前，臨床上常采用DWI與T2-FLAIR的不匹配來觀察缺血半暗帶的存在與否及范圍，并推測大致發(fā)病時間，但其準確性尚有待提高。臨床上迫切需要尋找新的能準確預測醒后卒中患者動脈栓子形成時間、栓子成分及可溶性的定量影像學分析方法。MRI T1-mapping及T2-mapping技術能夠定量評估病變組織的不同成分及水含量的差異，有望區(qū)分不同性質(zhì)與成分的動脈栓子。本研究初步探討MRI T1-mapping及T2-mapping技術用于兔頸總動脈血栓定量測量的可行性，為進一步開展腦卒中患者動脈栓子成分及形成時間MRI評估的臨床研究奠定技術基礎。

材料與方法

1．實驗動物及模型制作

選用健康雄性新西蘭大白兔20只，清潔級，2～3月齡，體重1.5～2.0 kg，隨機分為4組，分別為4.5 h組、6.0 h組、8.0 h組及12.0 h組，每組5只。實驗用兔均由蘇州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。實驗動物使用經(jīng)蘇州大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準。

頸總動脈血栓模型采用頸總動脈內(nèi)注射凝血酶的方法建立。具體方法如下：新西蘭大白兔肌肉注射速眠新(0.2 mL/kg)及耳緣靜脈注射1%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)麻醉后，取頸部正中切口，沿右側胸鎖乳突肌外側緣分離出右側頸總動脈(圖1)，頸總動脈中段兩端放置血管夾，中間長度約15 mm，微量注射器穿刺針抽取凝血酶10U及兔夾閉頸總動脈段內(nèi)自體血，混合30～60 s，隨后注射至夾閉的頸總動脈管腔內(nèi)，5分鐘后先松開近端血管夾，再過5 min后松開遠端血管夾。止血后逐層縫合肌肉與皮膚，術后肌肉注射青霉素40萬單位。MRI及手術病理發(fā)現(xiàn)局部頸總動脈血栓形成為建模成功。

2．磁共振檢查

動物麻醉:各組兔頸總動脈血栓模型建立后根據(jù)相應的時間點進行MRI掃描，掃描前先經(jīng)耳緣靜脈注射地西泮(安定)1 mL，然后肌肉注射速眠新0.2 mL/kg。

MRI掃描序列及參數(shù)：MRI檢查采用Siemens Skyra 3.0T磁共振成像系統(tǒng)，16通道膝關節(jié)線圈，兔子取俯臥位，頭先進。掃描序列包括3D-TOF、T1WI、T2WI黑血、T1-mapping及T2-mapping序列。主要掃描參數(shù)：①3D-TOF序列，TR 20 ms，TE 3.11 ms，視野150 mm×150 mm，層厚1 mm，層數(shù)96層，層間距0 mm，掃描時間2 min 33 s；②冠狀面T1WI黑血序列，TR 650 ms，TE 23 ms，視野150 mm×150 mm，層厚0.8 mm，層數(shù)10層，層間距0 mm，掃描時間53 s；③橫軸面T1WI黑血序列，TR 731 ms，TE 10 ms，視野150 mm×150 mm，層厚2 mm，層數(shù)8層，層間距0 mm，掃描時間5 min 51 s；④橫軸面T2WI黑血序列，TR 678 ms，TE 61 ms，視野150 mm×150 mm，層厚2 mm，層數(shù)8層，層間距0 mm，掃描時間2 min 32 s；⑤T1-mapping序列，翻轉角分別為5°和26°，TR 15 ms，TE 2.49 ms，視野160 mm×160 mm，層厚2 mm，層數(shù)8層，層間距0 mm,掃描時間2 min 34 s；⑥T2-mapping序列，TE分別為11.2、22.4、33.6、44.8、56 ms，TR 1950 ms，視野160 mm×160 mm，層厚2 mm，層數(shù)8層，層間距0 mm，掃描時間5 min 37 s。

圖像分析:所有圖像均上傳至PACS工作站，由2位有經(jīng)驗的影像診斷醫(yī)師分別對MRI圖像進行質(zhì)量評價。根據(jù)圖像有無偽影及變形、是否能分辨血栓等對圖像質(zhì)量進行評分：1分，圖像偽影較多，變形嚴重，不能顯示血栓，不能用于診斷；2分，圖像有少許偽影，可分辨血栓，不影響診斷；3分，圖像質(zhì)量非常好，無偽影，血栓顯示清晰。

T1值及T2值的測量：在Siemens Skyra 3.0T的工作站上直接打開T1-mapping的原始圖像及偽彩圖，首先預覽T1-mapping的原始圖像，觀察血栓的走行及大小，然后將原始圖像與偽彩圖對應，在原始圖像選擇血栓中心位置及合適的大小勾畫ROI，在偽彩圖相應位置測量T1值。以同樣的方法測量T2值。

3.病理學檢查

MRI檢查結束后，經(jīng)兔耳緣靜脈注射肝素(200 U/kg)抗凝，以空氣栓塞法處死實驗兔。解剖并游離右側頸總動脈血栓，以4%的多聚甲醛液固定，石蠟包埋，行常規(guī)HE染色，鏡下觀察。

4.統(tǒng)計學分析

結 果

1.兔頸總動脈血栓模型成功率及病理檢查結果

經(jīng)病理證實，20只兔子均建模成功。兔頸總動脈血栓肉眼觀察均呈紅色血凝塊，大小0.5～1.0 cm，邊緣略不規(guī)則。各組血栓切片HE染色鏡下顯示淡粉色的纖維蛋白網(wǎng)羅大量紅細胞，混雜有核細胞成分(圖2)。

2.MRI圖像質(zhì)量評價及定量MRI測量

兩位醫(yī)師對20只頸總動脈血栓模型兔的MRI各序列圖像質(zhì)量評分均在2分以上，各序列圖像質(zhì)量主觀評分結果的一致性較好(表1)。

兔頸總動脈血栓在3D-TOF圖像上均表現(xiàn)為管腔內(nèi)低信號的充盈缺損(圖3)；T1WI、T2WI黑血序列圖像上血栓均表現(xiàn)為高信號(圖4～5)；T1-mapping原

表1 不同MRI序列圖像質(zhì)量評分結果

始圖像上血栓表現(xiàn)為相對低信號，T1-mapping偽彩圖可清楚顯示血栓(圖6)；T2-mapping原始圖像上血栓表現(xiàn)為高信號，T2-mapping偽彩圖可顯示血栓(圖7)。

建模后4.5 h、6.0 h、8.0 h及12.0 h組血栓T1值及T2值的平均值見表2。T1值各時間點組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。4.5 h組與6.0 h組的T2值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，余各時間點組之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，表3)。

表2 不同時間點血栓T1值及T2值

表3 各組間血栓T1值與T2值多重比較的P值

討 論

醒后卒中血管內(nèi)栓子的來源主要是心源性栓子和動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)斑塊破裂后局部血栓形成或脫落的斑塊，大腦中動脈是血管栓塞最常見的部位。人大腦中動脈的管徑與家兔的頸總動脈管徑相近，本實驗構建新西蘭大白兔頸總動脈血栓模型并進行MR成像研究，初步評估MRI T1-mapping及T2-mapping技術用于顱頸動脈血栓評價的圖像質(zhì)量及判斷血栓形成時間的可行性，為進一步開展醒后卒中的臨床MRI定量研究奠定基礎。

目前，常用的動脈血栓動物模型建立的方法包括自體血栓栓塞法、光化學法及球囊損傷結合高脂飲食飼養(yǎng)法。本研究采用了操作簡便、建模時間短的自體血栓栓塞法。自體血栓栓塞法通常為在目標血管內(nèi)注射凝血酶或通過介入的方法在特定血管放置自體血栓。筆者對凝血酶注射法進行改良，抽取頸總動脈內(nèi)的自體血與凝血酶混合后注射到兩端夾閉的頸總動脈內(nèi)。改進的凝血酶法在注射器中將自體血與凝血酶混合，形成一種高凝狀態(tài)，一方面減少了穿刺時動脈血外溢，另一方面凝血酶能使形成的血栓塊更好地固縮，以防自溶[1]。改良的凝血酶法一方面保證了血栓形成的成功率，另一方面克服了血管介入操作的技術難題，為血栓定量MRI測量研究提供了簡單易行的動物模型建模方法。

本研究中，MRI T1-mapping及T2-mapping成像在保證圖像信噪比的前提下，采用大矩陣、小視野進行掃描，提高了圖像的空間分辨率并降低了測量誤差。結果表明T1-mapping及T2-mapping的圖像質(zhì)量較高，掃描時間短，能夠滿足臨床診斷要求。

T1-mapping及T2-mapping是MRI定量測量最新發(fā)展起來的技術，相關研究表明T1-mapping及T2-mapping技術能較敏感地反映組織成分及含水量的細微變化[2,3]。Caspar等[4]采用T1-mapping和T2-mapping技術研究心內(nèi)血栓的T1值和T2值的變化，發(fā)現(xiàn)形成時間小于一周的新鮮心內(nèi)血栓的T1值平均值為(911±177)ms，小于形成時間大于一個月的陳舊性心內(nèi)血栓(1169±107)ms；心內(nèi)血栓的T2值兩者無明顯差異(73.8±7.3)ms vs (71.9±10.9)ms。目前，尚未見有關T1-mapping及T2-mapping技術在腦卒中動脈栓子MR成像方面的研究報道。

多項研究發(fā)現(xiàn)發(fā)病后3.0～4.5 h靜脈使用重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)溶栓治療仍然有效[5-7]，認為AIS溶栓時間窗可延長至發(fā)病4.5 h內(nèi)。6 h是目前臨床上使用尿激酶溶栓的時間窗[8]。根據(jù)國際慣例以“最后正常”的時間計算發(fā)病時間窗，醒后卒中的發(fā)病時間窗與正常人的睡眠時間大致相同，通常為8～12 h。因此本研究選取了血栓形成后4.5 h、6.0 h、8.0 h及12.0 h等較早期的時間點作為關鍵的時間點進行分析。

血栓主要由紅細胞、血小板及纖維蛋白構成，各成分的構成比不同，則血栓的可溶性及硬度也大不相同。臨床研究表明，血栓內(nèi)紅細胞含量越高，溶栓效率及血管再通率越高[9,10]。心源性栓子形成時間較長，硬度及溶栓難度較大；AS斑塊破裂后局部血栓形成時間短，硬度及溶栓難度小。血栓的形成時間、成分、可溶性與臨床治療密切相關。血栓形成后不同時間點含水量會發(fā)生變化，隨著紅細胞萎縮脫水，纖維蛋白收縮增強，血清析出，使得血栓中的水分逐漸減少。血栓形成早期，紅細胞內(nèi)的血紅蛋白會經(jīng)歷氧合血紅蛋白-脫氧血紅蛋白-正鐵血紅蛋白的變化并導致血栓MRI信號的變化。血栓形成晚期，血栓逐漸機化，由新生結締組織、殘存的纖維蛋白及細胞碎片取代紅細胞、血小板及纖維蛋白，血栓MRI信號也隨之發(fā)生改變[11]。

本研究是對形成時間較早(12 h以內(nèi))的血栓進行研究，發(fā)現(xiàn)血栓的T1值和T2值隨時間推移呈逐漸下降的趨勢。在該時期內(nèi)血栓的含水量逐漸減少，故T1值與T2值表現(xiàn)為逐漸縮短。此時，紅細胞內(nèi)的氧合血紅蛋白向脫氧血紅蛋白轉變，脫氧血紅蛋白為順磁性物質(zhì)，能夠縮短T1值與T2值。脫氧血紅蛋白縮短T2值的效應較T1值顯著，這可能是T2值變化的差異較T1值顯著的原因。4.5 h組與6.0 h組未有明顯的變化可能是由于兩組之間的時間間隔較短以及實驗樣本量較小的緣故。

本研究仍存在一定局限性：①樣本量小且只研究了12 h內(nèi)血栓信號的變化；②研究對象為動物模型的血栓，跟患者的實際血栓類型存在一定差異；③僅用HE染色證實血栓的病理，沒有進一步分析血栓成分。

綜上所述，采用改良的凝血酶法建立兔頸總動脈血栓模型，操作簡單易行，建模成功率高。MRI T1-mapping及T2-mapping技術對兔頸總動脈內(nèi)血栓成像的圖像質(zhì)量良好，能夠滿足臨床診斷要求，并且初步驗證了定量MRI技術可以顯示動脈血栓形成時間的變化。定量MRI T1-mapping及T2-mapping技術應用于醒后卒中腦動脈栓子形成時間及成分的判斷具有理論及技術上的可行性，為后續(xù)研究不同時間點血栓及不同性質(zhì)栓子的臨床MRI評估奠定了技術基礎。