許國(guó)洋，高廣亮，余遠(yuǎn)迪，牟 豪，付利芝，沈克飛，白運(yùn)川，楊 柳*

(1. 重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2. 重慶市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，重慶 402460；3. 酉陽(yáng)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，重慶 酉陽(yáng) 409800)

【研究意義】羊口瘡又稱羊傳染性膿皰(Orf)，是由羊傳染性膿皰病毒引起的一種接觸性人獸共患病，主要感染山羊和綿羊，也可感染馴鹿和駱駝等野生動(dòng)物，偶爾感染人類[1-2]。羊傳染性膿皰病毒屬于痘病毒科副痘病毒屬，對(duì)紫外線、乙醚和氯仿較為敏感，潮濕和高溫環(huán)境可導(dǎo)致其活性降低[3-4]。羊傳染性膿皰在山羊和綿羊中的發(fā)病率較高，各個(gè)階段的羊均可感染，春秋季節(jié)多發(fā)[5]。該病主要侵染羊的口唇部、尾根部、乳房等，受感染部位常出現(xiàn)丘疹、水皰、膿皰和結(jié)成疣狀結(jié)痂，破損后常繼發(fā)感染多種病原菌，加速病情惡化，造成動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降、進(jìn)食困難、食欲廢絕等，嚴(yán)重者出現(xiàn)死亡，是引起羔羊死亡的主要病原之一[6-7]。目前，開展的羊傳染性膿皰病原學(xué)研究較多，但國(guó)內(nèi)尚無可有效防治該病的商品化疫苗產(chǎn)品[8]，因此，開展羊傳染性膿皰的病原學(xué)研究依然十分必要。【前人研究進(jìn)展】McKeever D J等研究綿羊的口瘡病毒，主要闡述了口瘡病毒感染綿羊后對(duì)其皮膚組織的損傷機(jī)制[9]。周銘等將痂皮中的病毒在犢牛睪丸細(xì)胞中進(jìn)行盲傳，發(fā)現(xiàn)盲傳至第4代開始出現(xiàn)細(xì)胞病變[10]。 高晶暉等利用犢牛睪丸細(xì)胞對(duì)痂皮中的羊傳染性膿皰病毒進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)盲傳至第5代出現(xiàn)細(xì)胞病變[11]。于永忠等利用MDBK細(xì)胞從患病山羊口唇部痂皮中分離到一株羊傳染性膿皰病毒，同時(shí)，開展了動(dòng)物回歸試驗(yàn)，但僅對(duì)攻毒后羔羊的臨床癥狀和血常規(guī)進(jìn)行了檢測(cè)[12]。目前，關(guān)于羊傳染性膿皰病毒的組織分布及病毒載量未見報(bào)道。此外，筆者通過長(zhǎng)期對(duì)重慶地區(qū)羊傳染性膿皰的研究發(fā)現(xiàn)從痂皮樣品分離純化疫苗候選毒株概率較低，這可能與痂皮中病毒的含量、死活及其細(xì)胞適應(yīng)性有關(guān)。此外，口唇部創(chuàng)口暴露于外界環(huán)境，常導(dǎo)致病原菌的混合感染，產(chǎn)生的內(nèi)毒素和外毒素給病毒在細(xì)胞上的純化培養(yǎng)造成潛在威脅。【本研究切入點(diǎn)】為了解決以上難題，筆者嘗試對(duì)病死羔羊的多個(gè)組織進(jìn)行羊傳染性膿皰病毒的常規(guī)PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其舌、上顎、尾根部、淋巴結(jié)、鼻甲骨等組織均出現(xiàn)陽(yáng)性樣本，檢出率有一定差異，但表明這些組織中可能有病毒的存在，這可能與個(gè)體差異、發(fā)病程度和檢測(cè)方法有關(guān)，而關(guān)于羊傳染性膿皰病毒在羔羊體內(nèi)的分布情況未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬利用免疫組化方法和相對(duì)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)病毒在羔羊體內(nèi)分布情況進(jìn)行分析，以期為羊傳染性膿皰疫苗候選毒株的分離純化及其致病機(jī)制的深入研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

組織病毒基因組提取試劑盒、2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，TransStrat?Top Green qPCR SuperMix 熒光定量試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司，設(shè)計(jì)引物F1L-F/F1L-R進(jìn)行羊傳染性膿皰F1L基因的常規(guī)PCR擴(kuò)增，引物F1L-f/F1L-r進(jìn)行相對(duì)熒光定量PCR時(shí)F1L基因的擴(kuò)增，引物GAPDH-f/GAPDH-r進(jìn)行相對(duì)熒光定量PCR時(shí)內(nèi)參基因GAPDH的擴(kuò)增，序列均由生工生物工程有限公司合成。

1.2 動(dòng)物攻毒

選取4只未接種羊痘疫苗的健康斷奶羔羊，避免羊痘疫苗產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)，羔羊由重慶某羊場(chǎng)提供。隨機(jī)選取3只羔羊，在其口腔下唇粘膜和尾根部皮膚進(jìn)行羊傳染性膿皰病毒的劃痕接種，接種量為0.2 mL/只(TCID50=10-4.5/0.1 mL)，接種后，輕輕搓揉，使病毒液充分吸附，1只羔羊接種PBS 0.2 mL，設(shè)為對(duì)照組。正常飼喂，觀察記錄羔羊發(fā)病情況。

1.3 樣品處理

待山羊出現(xiàn)明顯的羊傳染性膿皰病毒感染癥狀時(shí)，放血處死，采集唇部、上顎、鼻甲骨、頸前淋巴結(jié)、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腸系膜淋巴結(jié)和尾根部組織樣品，各取5 g，利用組織勻漿機(jī)研磨處理，3000 r/min離心10 min，取上清提取基因組，利用F1/R1引物，擴(kuò)增山羊傳染性膿皰病毒F1L全長(zhǎng)基因序列，進(jìn)行PCR鑒定；對(duì)PCR鑒定為陽(yáng)性的組織樣品，另取5 g固定，參照褚秀玲等[13]的方法處理樣品，并送往重慶醫(yī)科大學(xué)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色分析。

1.4 組織病毒載量測(cè)定與分析

1.4.1 組織病毒載量測(cè)定 利用組織病毒基因組提取試劑盒提取各組織樣品基因組，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，每個(gè)組織樣品基因做3個(gè)重復(fù)孔，熒光定量PCR反應(yīng)體系為：2×qPCR SuperMix 10 μl，F(xiàn)1L-F/GAPDH-f(10 μmol/L) 0.5 μl，F(xiàn)1L-R/GAPDH-r (10 μmol/L) 0.5 μl，Template DNA 2 μl，RNase Free dH2O 7 μl；反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，61 ℃延伸35 s，40個(gè)循環(huán)；相對(duì)熒光定量PCR數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法處理。

表1 引物序列信息

1.4.2 病毒增殖情況分析 依據(jù)不同組織中病毒載量情況，對(duì)病毒載量最高的組織樣品和痂皮樣品進(jìn)行研磨處理，制備病毒懸液，按10 %接種量，感染OFTu細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變情況，對(duì)比分析高病毒載量的組織樣品和痂皮中病毒的增殖情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

試驗(yàn)組羔羊在攻毒后10 d均出現(xiàn)典型的臨床癥狀，唇部?jī)?nèi)側(cè)和尾根部出現(xiàn)皰疹，14 d唇部均開始出現(xiàn)疣狀結(jié)痂(圖1)，對(duì)照組正常。

A.唇部病變(10 d)；B.尾根部病變(10 d)；C.唇部病變(14 d)A.Lip lesions(10 days)；B.Tail root lesion(10 days)；C.Lip lesions(14 days)

2.2 羊傳染性膿皰病毒的組織分布

利用引物F1L-F/F1L-R對(duì)采集的樣品組織進(jìn)行羊傳染性膿皰病毒的PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組羔羊的唇部、上顎、鼻甲骨、腸系膜淋巴結(jié)、頸前淋巴結(jié)和尾根部均檢出羊傳染性膿皰病毒，而心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟均為陰性(圖2)。

M：DL2000 DNA marker；1.唇部；2.上顎；3.鼻甲骨；4.頸前淋巴結(jié)；5.心臟；6.肝臟；7.脾臟；8.肺臟；9.腎臟；10.腸系膜淋巴結(jié)；11.尾根部M：DL2000 DNA marker；1.Lip; 2.Palate; 3.Turbinate bone; 4.Anterior cervical lymph nodes; 5.Heart; 6.Liver; 7.Spleen; 8.Lung; 9.Kidney; 10.Mesenteric lymph node; 11.Tail root

2.3 免疫組化

通過對(duì)不同組織的免疫化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組羔羊唇部、上顎鼻甲骨、頸前淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)和尾根部組織細(xì)胞中均出現(xiàn)陽(yáng)性印跡(圖3)，可見棕黃色顆粒彌散性分布，其中，唇部、尾根部、鼻甲骨、上顎反應(yīng)強(qiáng)烈，為強(qiáng)陽(yáng)性，頸前淋巴結(jié)表達(dá)量適中，腸系膜淋巴結(jié)表達(dá)量較低。

A：唇部；B：上顎；C：鼻甲骨；D：頸前淋巴結(jié)；E：腸系膜淋巴結(jié)；F：尾根部A:Lip; B: Palate; C: Turbinate; D: Anterior cervical lymph node; E: Mesenteric lymph node; F: Root of tail

2.4 組織病毒載量

對(duì)陽(yáng)性組織樣品進(jìn)行相對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性檢出率均為100 %。羊傳染性膿皰病毒在唇部、口腔上額、鼻甲骨、頸前淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、尾根部的含量(單位：2-△△Ct)分別為(17.59±0.14)、(22.73±0.1)、(24.41±1.9)、(2.75±0.16)、(0.15±0.02)、(19.29±0.51)，即在唇部、口腔上顎、尾根部的含量較高，在鼻甲骨的含量最高，在頸前淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)的含量較低。

2.5 病毒增殖情況

將處理后的鼻甲骨和唇部痂皮病毒懸液接種OFTu細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)在48 h均開始出現(xiàn)少量細(xì)胞的變圓脫落，細(xì)胞間隙變寬，72 h出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，其中，鼻甲骨病毒懸液引起的細(xì)胞病變更為明顯，而對(duì)照組未見細(xì)胞病變(圖4)。盲傳3代后，測(cè)定鼻甲骨源和唇部痂皮源病毒TCID50分別為10-4.1和10-5.8。

A. 對(duì)照(72 h)；B. 鼻甲骨病毒懸液(72 h)；C. 唇部痂皮病毒懸液(72 h)A. Control(72 hours); B. Virus suspension of nasal turbinate(72 hours); C. Virus suspension of lip epidermal(72 hours)

3 討 論

羊傳染性膿皰可引起山羊和綿羊的口唇部、乳房和尾根部等產(chǎn)生丘疹、水泡和疣狀結(jié)痂，對(duì)羔羊危害較大，防控不及時(shí)，常導(dǎo)致繼發(fā)感染，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡，威脅養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展。目前，國(guó)內(nèi)尚無商品化羊傳染性膿皰疫苗，因此對(duì)羊傳染性膿皰疫苗候選毒株的研究十分關(guān)鍵。在羊傳染性膿皰病毒分離純化中，采集的樣品多為口唇部痂皮組織[14-15]，樣品受支原體、真菌和細(xì)菌等污染風(fēng)險(xiǎn)較大，若處理不當(dāng)會(huì)給病毒在細(xì)胞上的增殖造成嚴(yán)重干擾。目前，關(guān)于羊傳染性膿皰病毒的分離鑒定研究報(bào)道較多，但多數(shù)僅對(duì)痂皮組織中的病毒進(jìn)行初步的細(xì)胞培養(yǎng)。筆者研究發(fā)現(xiàn)，山羊感染口瘡病毒后常繼發(fā)感染多動(dòng)物鏈球菌、金黃色葡萄球菌和溶血性曼氏桿菌[16]，由于樣品比較特殊，長(zhǎng)期暴露于外界環(huán)境中，因此，殘留在痂皮組織中的病原菌內(nèi)毒素與外毒素可能對(duì)病毒的純化培養(yǎng)造成干擾。本研究對(duì)攻毒后羔羊的不同組織器官進(jìn)行病毒定位及載量分析，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組羔羊唇部、上顎、鼻甲骨、腸系膜淋巴結(jié)、頸前淋巴結(jié)和尾根部均檢出羊傳染性膿皰病毒，而唇部、上顎、鼻甲骨和尾根部的病毒載量較高，其中，鼻甲骨病毒含量最高。綜上所述，通過對(duì)攻毒后羊傳染性膿皰病毒在羔羊體內(nèi)的組織定位及病毒載量分析，首次明確了山羊傳染性膿皰病毒可在在患病羔羊的多個(gè)組織中定殖，其在鼻甲骨中含量最高，且該組織中的病毒更易在OFTu細(xì)胞中增殖，為山羊傳染性膿皰疫苗候選毒株的分離純化及其致病機(jī)制的深入研究提供數(shù)據(jù)支撐。