馬春霞，黃 婷，盧 敏，陸專靈，謝宗升，雷愛瑩，陳福艷 ，熊建華* ，黎 銘*

(1.廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001；2.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院/廣西遺傳育種與健康養(yǎng)殖遺傳重點(diǎn)試驗(yàn)室，廣西 南寧 530021；3.廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/北部灣大學(xué)海洋學(xué)院，廣西 欽州 535011)

【研究意義】凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)又稱南美白對(duì)蝦，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱十足目對(duì)蝦屬對(duì)蝦科，是世界各地的主要養(yǎng)殖對(duì)蝦品種[1]，也是三大養(yǎng)殖對(duì)蝦(凡納濱對(duì)蝦、日本斑節(jié)對(duì)蝦和羅氏沼蝦)品種中單產(chǎn)最高的蝦種。凡納濱對(duì)蝦具有個(gè)體大、生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)需求低、抗病力強(qiáng)及對(duì)水環(huán)境因子變化適應(yīng)能力強(qiáng)和離水存活時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，自引進(jìn)我國(guó)以來(lái)，已逐漸成為集約化高產(chǎn)養(yǎng)殖的優(yōu)良品種，并在我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要地位[2-3]。白便病是目前危害凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)最嚴(yán)重的一種疾病，主要由細(xì)菌、寄生蟲、毒素及投喂過(guò)量等因素引起[4-7]。雖然白便病已經(jīng)流行多年，但目前仍未找到有效的預(yù)防控制藥物和治療方法[8-9]。因此，分析凡納濱對(duì)蝦的抗病基因及抗病機(jī)制，對(duì)開發(fā)凡納濱對(duì)蝦抗“白便病”藥物及促進(jìn)沿海對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，其病害機(jī)理及防治技術(shù)一直深受關(guān)注[4，9-10]。凡納濱對(duì)蝦屬較低等水生動(dòng)物，生長(zhǎng)發(fā)育的生命周期較短，機(jī)體各器官系統(tǒng)形成迅速，新陳代謝水平較高，器官結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，在養(yǎng)殖過(guò)程中較易發(fā)病[11]。凡納濱對(duì)蝦對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境有一定要求，水環(huán)境條件惡劣會(huì)直接影響其鰓結(jié)構(gòu)，病原體較易感染鰓部而影響其生長(zhǎng)發(fā)育[10]。蝦病暴發(fā)或長(zhǎng)期帶毒蔓延不僅造成較大經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)使對(duì)蝦種質(zhì)退化[11-12]。以往對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖病害的防控主要依靠抗生素及各種化學(xué)藥物，雖然這些藥物對(duì)細(xì)菌性疾病和寄生蟲疾病有一定效果，但對(duì)病毒性疾病效果不理想，且存在嚴(yán)重的藥物殘留及產(chǎn)生耐藥菌株等問(wèn)題[13-15]?？咕氖且活惥哂幸志钚缘亩嚯奈镔|(zhì)，具有多種優(yōu)點(diǎn)，包括安全無(wú)毒、抗菌譜廣、穩(wěn)定性好、殺菌濃度低、分子質(zhì)量小和致敏性弱等，已成為生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[16-17]。已有報(bào)道稱，抗菌肽已作為凡納濱對(duì)蝦、羅非魚、錦鯉進(jìn)入草魚等水產(chǎn)動(dòng)物的免疫增強(qiáng)劑和促生長(zhǎng)劑應(yīng)用[18-21]，且應(yīng)用前景廣闊。【本研究切入點(diǎn)】WAP是存在于凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的一個(gè)抗菌肽(Crustin)基因，但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于其功能及表達(dá)物應(yīng)用的研究鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】開展凡納濱對(duì)蝦WAP基因克隆表達(dá)及抗病功能研究，分析WAP基因在凡納濱對(duì)蝦組織中的表達(dá)特性，為凡納濱對(duì)蝦抗白便病藥物的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 對(duì)蝦 健康凡納濱對(duì)蝦樣品由廣西防城港SPF凡納濱對(duì)蝦良種場(chǎng)提供，白便病凡納濱對(duì)蝦樣品由北海某對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)提供，規(guī)格為4～5 g/尾。收集對(duì)蝦的眼柄、血細(xì)胞、腮、肝胰腺、心臟、胃、肌肉、神經(jīng)、腸道、后盲囊和表皮組織，分別置于裝有1.0 mL RNA Later保存液的1.5 mL離心管中，低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，存放于-80 ℃冰箱備用。

1.1.2 試驗(yàn)試劑和耗材 TransZol UP Plus RNA Kit 試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，第一鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，DNA膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司，0.22 μm無(wú)菌濾器和透析袋購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，Ni-IDA親和層析膠購(gòu)自美國(guó)Novagen公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純；PCR管和槍頭等耗材購(gòu)自美國(guó)Fisher公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 定量PCR儀(德國(guó)Biometra公司)；Allegra 21R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)Sorval公司)；Biologic LP層析系統(tǒng)、Mini Protean II垂直平板電泳系統(tǒng)、Gel Doc2000成像系統(tǒng)、水平電泳系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)；PTC-200基因擴(kuò)增儀(美國(guó)MJ Research公司)；320-S pH計(jì)(美國(guó)Mettler Toledo公司)；MultiTemp III 恒溫水浴鍋、Hofer ΜV-25紫外透射儀(美國(guó)Amersham Pharmacia公司)；超凈工作臺(tái)(中國(guó)蘇凈集團(tuán))；NANODROP2000(美國(guó)Thermo公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank(AY464465.1)公布的WAP基因序列，通過(guò)Primer 5設(shè)計(jì)普通PCR及熒光定量PCR引物(表1)。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.2.2 總RNA樣品提取 參照TransZol UP Plus RNA Kit試劑盒說(shuō)明提取凡納濱對(duì)蝦的11個(gè)組織總RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。所得RNA樣品用分光光度計(jì)分別在260和280 nm處測(cè)定含量，取吸光比值(A260∶A280)大于1.8的RNA樣品進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2.3 RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄 cDNA合成采用20.0 μl逆轉(zhuǎn)錄體系。在反應(yīng)管中加入RNA模板3.0 μl，Reaction Mix(4×)2.0 μl，RNase-free H2O 3.0 μl，放入PCR儀42 ℃ 2 min，取出；加入Reaction Stopper(5×) 2.0 μl；5×All-in-one Matter Mix 4.0 μl，RNase-free H2O 6.0 μl。擴(kuò)增程序：25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min，4 ℃結(jié)束，cDNA第一鏈合成，取出置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴(kuò)增WAP基因表達(dá)區(qū)域片段 PCR反應(yīng)體系按照表2所示的用量置于0.2 mL PCR離心管中，加ddH2O混合定容至20.0 μl(均放在冰盒子上操作)。將裝有樣品的PCR離心管放入PCR儀中按下列程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行39個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存結(jié)束。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0 %瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件：110 V電泳20 min。電泳結(jié)束后對(duì)凝膠進(jìn)行成像系統(tǒng)檢測(cè)。

表2 PCR反應(yīng)體系

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系10.0 μl：PowerUpTMSYBR?Master Mix 5.0 μl，LV-WAP2-F 1.0 μl，LV-WAP2-R 1.0 μl，ddH2O 2.0 mL，cDNA模板1.0 μl；輕彈八連管管底將溶液混合，6000 r/min短暫離心。擴(kuò)增程序：93 ℃ 3 min；93 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 1 min。WAP基因的表達(dá)量經(jīng)內(nèi)參基因EF-1α(NCBI登錄號(hào)GU136229)均一化處理數(shù)值后使用Livak(2-ΔΔCT)標(biāo)準(zhǔn)化方法計(jì)算。

1.2.6 WAP融合蛋白的表達(dá) ①基因合成。pET-32a(+)-WAP測(cè)序驗(yàn)證采用基于PAS(PCR-based accurate synthesis)的方法合成WAP基因表達(dá)區(qū)全長(zhǎng)片段，將其連接至pET32a(+)載體，獲得的重組質(zhì)粒pET32a-WAP轉(zhuǎn)入TOP10克隆菌株，挑取陽(yáng)性克隆子測(cè)序。質(zhì)粒酶切鑒定酶切體系：質(zhì)粒3.00 μl，內(nèi)切酶XhoI 0.25 μl，內(nèi)切酶ApaI 0.25 μl，10×Buffer 1.00 μl，加ddH2O定容至10.0 μl。②重組質(zhì)粒pET32a-WAP轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Arctic Express。將1.0 μl重組質(zhì)粒加入100.0 μl感受態(tài)細(xì)菌中，置冰上20 min；42 ℃熱激90 s，迅速置冰中5 min，加入600.0 μl LB培養(yǎng)液；37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)1 h，離心后全部涂布于含50.0 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。③IPTG誘導(dǎo)WAP融合蛋白表達(dá)。挑取轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基上的單克隆接種于含50.0 μg/mL Amp的3.0 mL LB培養(yǎng)液試管中，37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜；次日按1∶100接種于50.0 μg/mL Amp的30.0 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)至菌體OD600為0.6～0.8；取出1.0 mL培養(yǎng)物，10 000 r/min室溫離心2 min，棄上清液，用100.0 μl 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀；向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)4 h，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)；取出1.0 mL培養(yǎng)物，10 000 r/min室溫離心2 min，棄上清液，用100 μl 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀；剩余培養(yǎng)物4000 r/min離心10 min，棄上清液，用PBS重懸菌體沉淀；重懸液進(jìn)行超聲波破碎后，分別取上清液與沉淀液加入上樣緩沖液重懸；進(jìn)行12 % SDS-PAGE檢測(cè)分析，考馬斯亮藍(lán)染色顯帶。④融合蛋白Ni柱親和純化。利用低壓層析系統(tǒng)，上清液以0.5 mL/min流速上樣至Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA-Sepharose Cl-6B親和層析柱；用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 mL/min流速?zèng)_洗，至流出液OD280達(dá)基線；用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mmol/LTris-HCl，20 mmol/L咪唑，0.15 mol/L NaCl，pH 8.0)以1.0 mL/min流速?zèng)_洗，至流出液OD280達(dá)基線；用Ni-IDA ELution-Buffer(20 mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L咪唑，0.15 mmol/L NaCl，pH 8.0)以1.0 mL/min流速洗脫目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20 mmol/L Tris-HCl、0.15 mol/L NaCl、pH 8.0進(jìn)行透析過(guò)夜；進(jìn)行12 % SDS-PAGE分析。⑤Western blotting鑒定。取純化蛋白樣品上樣5.0 μl；上樣完畢后，聚丙烯酰胺凝膠先90 V跑完積層膠，再將電壓升至200 V直到電泳結(jié)束；電泳結(jié)束后取下凝膠進(jìn)行恒壓100 V轉(zhuǎn)膜，約1.5 h，恒流250 mA；電轉(zhuǎn)結(jié)束后，取下膜先用PBST洗滌4次，每次洗5 min；將膜置于5 %脫脂奶粉封閉液中37 ℃下封閉1 h；用封閉液稀釋一抗(鼠抗His抗體)，將膜放在一抗稀釋液中4 ℃孵育過(guò)夜；次日將膜取出用PBST洗膜4次，每次洗5 min；用含5 %牛奶的封閉液稀釋二抗(羊抗鼠)，膜在二抗中37 ℃反應(yīng)1 h；反應(yīng)完畢后將膜取出置于干凈盒子中洗膜4次，每次洗5 min。ECL顯影，曝光。

1.2.7 重組蛋白與細(xì)菌多糖(LPS/PGN/LTA)結(jié)合分析 設(shè)計(jì)酶標(biāo)板布局，每孔加4.0 μg LPS/PGN/LTA，37 ℃過(guò)夜；微孔板60 ℃下放置 30 min，然后用BSA(1.0 mg/mL)200.0 μl、37 ℃包被2 h；TBS洗3遍；用純化的重組WAP蛋白(終濃度為0～25.0 μg/mL)200.0 μl加入相應(yīng)反應(yīng)孔，37 ℃孵育3 h，TBS洗4遍；加入HRP標(biāo)記抗HIS抗體(1∶3000)100.0 μl/孔，孵育1 min，TBS洗4遍；按100.0 μl/孔的量加入平衡室溫的TMB Solution顯色液，37 ℃避光孵育15 min；在450 nm處讀取數(shù)據(jù)。重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 WAP基因在凡納濱對(duì)蝦組織的表達(dá)分布情況

利用RT-PCR對(duì)凡納濱對(duì)蝦眼柄、血細(xì)胞、鰓、肝胰腺、心臟、胃、肌肉、神經(jīng)、腸道、后盲囊和表皮進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WAP基因在11個(gè)組織均有表達(dá)(圖1)，表達(dá)量排序?yàn)檠?xì)胞>鰓>心臟>后盲囊>肌肉>腸道>胃>神經(jīng)>表皮>眼柄>肝胰腺。其中，在血液細(xì)胞的表達(dá)量最高，在表皮、眼柄和肝胰腺的表達(dá)量較低。

1：血細(xì)胞；2：鰓；3：心臟；4：后盲囊；5：肌肉；6：腸道；7：胃；8：神經(jīng)；9：表皮；10：眼柄；11：肝胰腺1：Hemocytes；2：Gill；3：Heart；4：Cecum；5：Muscle；6：Intestines；7：Stomach；8：Nerve；9：Epidermis；10：Eyestalk；11：Hepatopancreas

2.2 WAP基因在感染病原凡納濱對(duì)蝦與健康凡納濱對(duì)蝦中的表達(dá)變化

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果(圖2)表明，WAP基因在感染白便病凡納濱對(duì)蝦鰓組織的表達(dá)量是健康凡納濱對(duì)蝦表達(dá)量的5.9258倍，二者間差異顯著(P<0.05，下同)，在患白便病凡納濱對(duì)蝦腸道組織的表達(dá)量是健康凡納濱對(duì)蝦表達(dá)量的1.5147倍，二者間差異顯著。說(shuō)明感染白便病后凡納濱對(duì)蝦的WAP基因表達(dá)量顯著上升。

不同組織圖柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Different lowercase letters on the bar of the different tissues represented significant difference(P<0.05)

M：Marker；Line 1：酶切前質(zhì)粒；Line 2：酶切后質(zhì)粒M：Marker；Line 1：Plasmid before enzyme digestion；Line 2：Plasmid after enzyme digestion

2.3 WAP蛋白重組表達(dá)結(jié)果

2.3.1 重組表達(dá)載體雙酶切鑒定結(jié)果 將基于PAS合成的WAP基因表達(dá)區(qū)全長(zhǎng)片段連接至pET32a(+)載體，獲得重組質(zhì)粒pET32a-WAP，經(jīng)XhoI和ApaI雙酶切，結(jié)果(圖3)顯示，第二泳道有兩條條帶，一條為載體條帶，一條為目的基因條帶，表明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3.2 WAP融合蛋白表達(dá)鑒定結(jié)果 使用 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白WAP，優(yōu)化表達(dá)條件，將誘導(dǎo)條件調(diào)整至 37 ℃，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)WAP融合蛋白呈可溶形式表達(dá)(圖4)。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：未誘導(dǎo)；2：誘導(dǎo)后；3：誘導(dǎo)破碎后上清；4：誘導(dǎo)破碎后沉淀M：Protein molecular mass standard；1：Uninduced；2：Induced；3：Induced supernatant after crushing；4：Induced precipitation after crushing

2.3.3 WAP融合蛋白純化鑒定結(jié)果 利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，經(jīng)Ni柱親和純化后的SDS-PAGE檢測(cè)分析結(jié)果表明，融合蛋白存在于上清液中，如箭頭所示(圖5)；通過(guò)Western blotting鑒定分析，發(fā)現(xiàn)融合蛋白處在14～25 kD之間，位置如箭頭所示(圖6)。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：流出液 ；2：洗脫液M：Molecular standards for proteins；1：Effluent；2：Eluent

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：純化后樣品M：Protein molecular mass standard；1：Purified sample

2.5 WAP融合蛋白與細(xì)菌多糖的結(jié)合作用

將WAP融合蛋白與細(xì)菌多糖(LPS/PGN/LTA)混合，ELISA檢測(cè)結(jié)果(圖7)顯示，隨著WAP融合蛋白濃度的增加，除BSA對(duì)照組外其余各檢測(cè)孔的OD均增加，且呈線性比率關(guān)系。相同WAP融合蛋白濃度下，各檢測(cè)孔OD表現(xiàn)為PGN>LPS>LTA，且差異極顯著(P<0.01)。說(shuō)明WAP融合蛋白與細(xì)菌多糖(LPS/PGN/LTA)具有直接結(jié)合作用，且細(xì)菌多糖(LPS/PGN/LTA)結(jié)合WAP融合蛋白的能力排序?yàn)镻GN>LPS>LTA。

圖7 WAP融合蛋白與細(xì)菌多糖結(jié)合作用分析結(jié)果Fig.7 WAP fusion protein expression binds to bacterial polysaccharides

3 討 論

Crustins是富含半胱氨酸的陽(yáng)離子抗菌肽，在N端包含一個(gè)富含甘氨酸、半胱氨酸或脯氨酸的區(qū)域，在C端包含WAP蛋白結(jié)構(gòu)域[22-23]。已有研究表明，甲殼類Crustins具有蛋白酶抑制和抗菌活性[24-27]。對(duì)蝦Crustins主要在血細(xì)胞表達(dá)，由于血細(xì)胞在其他組織的滲透及黏附，導(dǎo)致其他組織也常檢測(cè)到Crustins存在[27-28]。但并非所有的Crustins都在血細(xì)胞中表達(dá)，日本囊對(duì)蝦的MjCRS8和MjCRS9只在腮組織表達(dá)，斑節(jié)對(duì)蝦的Crustin Pm 5主要在眼柄表達(dá)，在血液不表達(dá)[29-30]；甲殼類動(dòng)物抗菌肽主要在血細(xì)胞表達(dá)，然后通過(guò)血循環(huán)參與識(shí)別、吞噬、細(xì)胞毒性和黑化等過(guò)程，在抵御入侵微生物方面發(fā)揮重要作用[31]。本研究用RT-PCR檢測(cè)WAP基因在凡納濱對(duì)蝦組織的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WAP基因在11個(gè)被檢組織均有表達(dá)分布，其中在血細(xì)胞的表達(dá)量最高，在表皮、眼柄和肝胰腺的表達(dá)量較低，與Liu等[27]、Smith[28]的研究結(jié)果一致。作為Crustins家族的一員，WAP基因在凡納濱對(duì)蝦血液中最高量表達(dá)，推測(cè)其可能參與機(jī)體抗病作用。

白便病是目前凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)常見的一種疾病。本研究對(duì)比分析患白便病凡納濱對(duì)蝦與健康凡納濱對(duì)蝦的WAP基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)前者鰓和腸道組織的WAP基因表達(dá)量升高，據(jù)此推斷WAP基因表達(dá)與對(duì)蝦白便病具有某種程度的聯(lián)系，作為一個(gè)抗病基因，WAP基因可能具有抗對(duì)蝦白便病作用。對(duì)蝦白便病的病因目前仍存在多種假說(shuō)，藻毒素、微生物感染、微孢子蟲、飼料霉變及投喂過(guò)量等因素均可能促使其發(fā)生[5]。但通過(guò)解剖和病理切片分析發(fā)現(xiàn)，患白便病對(duì)蝦的肝胰腺結(jié)構(gòu)和功能受損，腸道黏膜脫落[6]，說(shuō)明患病對(duì)蝦炎癥較嚴(yán)重。由于甲殼類的Crustins具有抗微生物作用[32-34]，WAP蛋白被大量表達(dá)并通過(guò)血液被運(yùn)輸至炎癥部位，而有利于消除病原微生物。因此，WAP基因表達(dá)量上升可能是對(duì)蝦機(jī)體應(yīng)對(duì)白便病炎癥及抵抗外源微生物入侵的一種保護(hù)反應(yīng)。

為了進(jìn)一步明確WAP蛋白與抗微生物相關(guān)，本研究構(gòu)建pET32a-WAP表達(dá)載體，經(jīng)重組表達(dá)獲得WAP融合蛋白。據(jù)報(bào)道，重組Crustins在體外具有細(xì)菌結(jié)合性能，斑節(jié)對(duì)蝦的Crustin Pm 1和Crustin Pm 7、中國(guó)對(duì)蝦的Fc-Lec 2、日本囊對(duì)蝦的MjCru I-1及LPS、PGN和LTA均具有細(xì)菌結(jié)合特性[25，27，35]。Crustin特殊的分子結(jié)構(gòu)使其帶正電荷，且可能通過(guò)靜電吸引作用與細(xì)菌的細(xì)胞膜相互作用，進(jìn)而整合成脂質(zhì)雙分子層，形成膜孔或膜破裂[28，36]。Liu等[27]通過(guò)電鏡觀察證實(shí)MjCru I-1與K.pneumoniae共孵育后引起K.pneumoniae菌壁破碎及菌體萎縮。本研究發(fā)現(xiàn)，WAP融合蛋白同樣具有與LPS、PGN和LTA結(jié)合的特性，推斷WAP蛋白可結(jié)合到革蘭氏陽(yáng)性或陰性細(xì)菌，說(shuō)明WAP蛋白可能參與了抗菌作用。

自瑞典科學(xué)家Boman于20世紀(jì)80年代首次發(fā)現(xiàn)天蠶素(Cecropins)以來(lái)，人類在植物、昆蟲、魚類、鳥類、哺乳動(dòng)物、真菌和細(xì)菌等體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了上千種在結(jié)構(gòu)與功能方面具有復(fù)雜多樣性的抗菌肽[17]。除抗微生物作用外，Crustins還具有生理應(yīng)激、創(chuàng)傷修復(fù)、組織再生及蛻皮等重要生物學(xué)功能[26，28，37]。因此，WAP基因在對(duì)蝦白便病發(fā)展過(guò)程是否發(fā)揮了生理應(yīng)激、創(chuàng)傷修復(fù)及組織再生作用，尚有待進(jìn)一步探究。本研究雖證實(shí)患白便病凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)WAP基因表達(dá)量升高，但未確定WAP蛋白對(duì)白便病具有特異性作用，WAP蛋白的作用也許僅是眾多抗病因子中的一員。同樣，WAP蛋白與細(xì)菌表面的結(jié)合，也未具體確定到某種細(xì)菌，而這些細(xì)菌是否與對(duì)蝦白便病有密切關(guān)聯(lián)也有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

WAP基因與凡納濱對(duì)蝦抗病免疫功能密切相關(guān)，WAP蛋白在開發(fā)凡納濱對(duì)蝦抗病藥物方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。