駱輝，王雪濤，廖果，謝偉，羅旭，陰文奇，周遠成*

（1.畜科生物工程有限公司，畜禽生物制品四川省重點實驗室，四川省動物生物制品工程技術研究中心，四川 成都 610200；2.四川省樂山市動物疫病預防控制中心，四川 樂山 614000）

豬偽狂犬?。≒R）是由偽狂犬病毒（PRV）所引起的豬、牛、羊等多種家畜和野生動物以發(fā)熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎為主要癥狀的一種高度接觸性傳染病。豬是該病的天然宿主、主要儲存宿主和傳染源，無論是新生仔豬、育肥豬，還是成年種豬均可感染PRV，從而造成巨大的經濟損失[1-2]。2 周齡內仔豬感染PRV 后死亡率較高，有的可達100%，常伴有腹瀉、嘔吐及共濟失調、角弓反張等神經癥狀；斷奶仔豬也能引起死亡，但主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)癥狀，也有部分豬出現(xiàn)神經癥狀、腹瀉、嘔吐等，耐過的仔豬往往發(fā)育不良，成為僵豬；育肥豬感染后可出現(xiàn)體溫升高、呼吸困難，主要以呼吸道癥狀為主，死亡率較低；成年豬感染后不發(fā)病或僅表現(xiàn)為體溫升高等輕微癥狀，呈隱性感染，長期帶毒或排毒，成為最危險的傳染源；妊娠母豬感染后會導致流產、產死胎和木乃伊胎等；種豬感染可致不育、睪丸腫脹，母豬返情、屢配不孕等[3-4]。

2011 年以來，我國多個省份出現(xiàn)免疫PRV疫苗的豬場發(fā)生豬偽狂犬病的案例，發(fā)病率和死亡率明顯上升，且出現(xiàn)了新的發(fā)病特征，給中國養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的損失，引起了業(yè)內高度重視[5]。本試驗分別從國內多個地區(qū)采集了11份疑似豬偽狂犬病的病料，開展PRV流行毒株的分離與鑒定，并對不同地區(qū)分離的流行毒株進行基因同源性分析和毒力試驗，為豬偽狂犬病的防控提供新的試驗數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 病料來源 2015～2018 年，從四川南充、遂寧等地共采集豬偽狂犬病毒疑似陽性病料6 份，從湖北不同養(yǎng)殖場共采集豬偽狂犬病毒疑似陽性病料2 份，從江西不同養(yǎng)殖場共采集豬偽狂犬病毒疑似陽性病料3份，共計11份。所有疑似陽性病料都保存于畜禽生物制品四川省重點實驗室。

1.2 細胞與試劑 PK-15細胞，由畜禽生物制品四川省重點實驗室提供；新生牛血清、DMEM 細胞培養(yǎng)基均購自GIBCO 公司；TAKARA MiniBest Viral RNA∕DNA Extraction Kit試劑盒購自TAKARA公司；豬偽狂犬病毒gB、gE ELISA抗體檢測試劑盒購自IDEXX公司；PCR檢測相關試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 試驗動物 8～9 周齡豬偽狂犬病毒gB、gE ELISA 抗體呈陰性的健康試驗豬，購自成都某豬場。

2 方法

2.1 病料處理 將采集的病料組織加液氮研磨后，用無血清的DMEM培養(yǎng)液按1∶5混合制成組織懸液，放置-70℃以下冰箱中凍融1次，以12000r∕min離心10 min，取上清液使用0.45 μm 濾膜過濾后，再次以12 000 r∕min 離心30 min，取上清液進行病毒分離。取0.5 mL 處理好的組織液接種致密單層的PK-15傳代細胞，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1h，倒掉病毒液，加入無血清DMEM培養(yǎng)液；再次置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細胞是否出現(xiàn)CPE，同時設正常細胞對照。連續(xù)觀察5日，若未出現(xiàn)CPE，則取細胞培養(yǎng)液再次接種長滿單層的PK-15 細胞進行盲傳，直至出現(xiàn)CPE。當CPE 達75%以上時，取培養(yǎng)液上清繼續(xù)接種長滿單層的PK-15 細胞進行病毒傳代。當接種病毒的細胞出現(xiàn)CPE 后，連續(xù)傳代5 次，所有收獲的病毒液于-80 ℃保存。

2.2 外源病毒檢驗 取出現(xiàn)CPE 以后代次的病毒液，按TAKARA MiniBest Viral RNA∕DNA Extraction Kit 試劑盒的方法提取核酸，分別以本實驗室建立的豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬細小病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、支原體的PCR檢測方法進行病毒核酸檢測。

2.3 病毒含量測定 將分離的PRV 流行毒株，用無血清DMEM 培養(yǎng)液進行10 倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-74 個稀釋度，分別接種于已長成良好單層、棄去細胞培養(yǎng)液的96孔PK-15細胞培養(yǎng)板，每個稀釋度接種6 孔，每孔0.1 mL，同時設正常細胞對照。置37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h 后，每孔補加含4%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液0.1 mL。再次置37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察5日，根據(jù)Reed-Muench法計算TCID50。

2.4 病毒中和試驗鑒定 將分離的豬偽狂犬病毒流行毒株，用無血清DMEM培養(yǎng)液分別稀釋成103TCID50∕mL的病毒懸液，與56 ℃滅活30 min的豬偽狂病毒特異性血清等量混合，置37 ℃作用1 h；接種于已長滿單層PK-15細胞并棄去細胞培養(yǎng)液的12 孔培養(yǎng)板，每孔0.2 mL，同時設病毒對照和正常細胞對照（每組2 孔）。置37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h 后，每孔補加含2%新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)液3 mL，再次置37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察5日，記錄各孔CPE情況。

2.5 不同流行毒株主要基因序列分析 根據(jù)PRV 基因組特征設計引物擴增gB、gC、gD、gE 基因序列全部或部分片段，陽性擴增產物送成都擎科梓熙生物技術有限公司進行序列測定（表1），使用DNAstar 和MEGA 7.0 分析軟件進行核苷酸和氨基酸序列的差異比較，并構建遺傳進化樹。

2.6 毒力試驗 將鑒定合格的豬偽狂犬病毒流行毒株，每個毒株選用1 個代次進行毒力試驗。將待檢病毒稀釋成106.0TCID50∕mL，每個分離株接種8～9 周齡PRV gB、gE 抗體呈陰性的健康仔豬5 頭，每頭滴鼻接種3 mL。接種前觀察2～3 日，每日定時測體溫1 次，取其平均值作為基礎體溫。接種后連續(xù)觀察21日，每日定時測量體溫1次，觀察試驗豬精神、食欲是否正常，是否出現(xiàn)呼吸困難、神經癥狀等偽狂犬病相關臨床癥狀，同時記錄試驗豬死亡情況。

表1 PRV主要結構蛋白擴增引物序列信息

3 結果

3.1 病毒分離結果 從11份豬偽狂犬病疑似陽性病料中共分離到6 株病毒，其中從四川采集的6 份病料中分離到3 株病毒，分別命名為SCHS株、SCM1 株、SCY1 株；從湖北采集的2 份病料中分離到1株病毒，命名為HBA1株；從江西采集的3 份病料中分離到2 株病毒，命名為JXHS 株與JXN1株。

3.2 外源病毒檢測結果 從四川分離的3 株病毒中，SCHS 株與SCM1 株僅PRV 檢測結果為陽性，其余檢測結果均為陰性，SCY1株的PRV與支原體檢測結果均為陽性。從湖北分離的HBA1株的PRV、PCV2 與支原體檢測結果均為陽性。從江西分離的JXHS 株僅PRV 檢測結果為陽性，JXN1 株的PRV 和PCV2 檢測結果均為陽性。病毒純凈性檢驗結果見表2。

表2 豬偽狂犬病毒分離株的PCR檢測結果

3.3 病毒含量測定結果（表3） SCHS株與JXHS株在PK-15 細胞上適應良好，F(xiàn)5～F10 代的最高病毒含量分別為107.4TCID50∕mL、107.75TCID50∕mL；SCM1 株、SCY1 株、HBA1 株、JXN1 株F5～F10 代的最高病毒含量在106.4TCID50∕mL左右。

3.4 中和試驗鑒定結果 用純凈性檢驗僅PRV呈陽性的SCHS株、SCM1株、JXHS 株進行中和試驗鑒定，結果顯示3 株分離病毒均能被豬偽狂犬病毒特異性血清中和。

表3 豬偽狂犬病毒分離株的病毒含量測定結果

3.5 不同毒株主要基因序列分析 使用所設計的引物成功擴增出6個分離毒株的部分gB、gC基因和全長gD、gE 基因，對擴增陽性產物進行序列測定，獲得了6 個毒株的主要結構蛋白基因序列。通過DNAstar 軟件分析，發(fā)現(xiàn)所分離毒株HBA1、JXN1、SCY1 的gB 擴增片段核苷酸序列與JS-2012株的同源性為100%，其余毒株的gB擴增片段核苷酸序列與JS-2012株的同源性為99.7%～99.9%，與Bartha 株的同源性在95.4%～95.6%之間。JXHS、SCHS、JXN1 的gC 基因與JS-2012 株的同源性為100%，其余毒株的gC基因與JS-2012株的同源性為99.5%～99.8%；所有分離毒株的gC 基因與Bartha 株的同源性均在90.7%～91.2%之間。SCY1 株、SCM1 株、JXHS 株的gD 基因與JS-2012 株的同源性為100%，其余毒株的gD 基因與JS-2012株的同源性為99.8%或99.9%；所有分離毒株的gD基因與Bartha株的同源性在98.7%～98.9%之間。所有分離毒株的gE 基因與JS-2012株的核苷酸同源性在99.1%～99.8%之間。

選擇近年來我國流行的PRV 流行毒株和PRV 經典毒株的相應序列，構建gB、gC、gD 和gE基因序列的遺傳進化樹，結果顯示4 個主要結構蛋白基因序列的分析結果一致，PRV 呈現(xiàn)2 個不同基因型分支，即：以Bartha株為代表的基因1型和我國分離株形成的基因2型。本試驗分離的毒株均為基因2 型毒株，與當前我國主要流行毒株的遺傳關系接近。

3.6 不同毒株的毒力試驗結果 用純凈性檢驗僅PRV呈陽性的SCHS株、SCM1株、JXHS株進行毒力試驗，結果顯示3 個流行毒株均能導致8～9周齡試驗豬100%（5∕5）發(fā)病。用SCHS 株攻毒后全部試驗豬（5∕5）都出現(xiàn)呼吸道癥狀，觀察期內有3∕5 死亡；用SCM1 株攻毒后有4∕5 的試驗豬出現(xiàn)呼吸道癥狀，觀察期內有1∕5 死亡；用JXHS 株攻毒后有2∕5 的試驗豬出現(xiàn)呼吸道癥狀，觀察期內全部存活。不同毒株的毒力試驗結果見表4。

表4 豬偽狂犬病毒不同分離株的毒力試驗

4 結論與討論

2011 年前后在全國范圍內出現(xiàn)了新的豬偽狂犬病疫情，主要表現(xiàn)為突發(fā)性大面積種豬流產，育肥豬致死性感染，豬群gE 抗體陽性率突然升高，部分豬場的gE 抗體陽性率高達100%。疫情發(fā)生的地區(qū)不同、免疫狀況不同而呈現(xiàn)出不同的臨床表現(xiàn)。免疫狀況較好的豬場，大多無明顯臨床癥狀，但豬群gE 陽性率突然升高；免疫狀況較差的豬場，主要表現(xiàn)為種豬大面積流產、仔豬腹瀉、育肥豬出現(xiàn)呼吸道癥狀與急性死亡[6]。

新疫情發(fā)生以后，全國多個實驗室分離到新的豬偽狂犬病毒流行毒株，經過致病力試驗、免疫保護試驗和分子流行病學研究，一致認為新流行的豬偽狂犬病毒株在主要毒力基因gE、gI以及與免疫保護相關的基因gB、gC、gD上存在多個位點的變異[7-9]。從我國不同地區(qū)分離的新流行毒株，與目前廣泛使用的豬偽狂犬病活疫苗Bartha K61 毒株位于不同的基因亞型，動物試驗與中和抗體檢測均證實Bartha K61 毒株對我國豬偽狂犬病免疫保護的效果較差，其保護力低于50%，而使用流行毒株構建的基因缺失疫苗能夠為仔豬提供100%的免疫保護[10-12]。本試驗分離的6株豬偽狂犬病毒主要基因位點與國內豬偽狂犬病毒流行毒株JS-2012 株的同源性均在99%以上；與Bartha K61 株gB 基因的同源性約為95%，與gC 基因的同源性在90.7%～91.2%，與gD 基因的同源性在98.7%～98.9%。基于主要基因位點的遺傳進化分析結果顯示，豬偽狂犬病毒已呈現(xiàn)2個不同的基因型分支，即：以Bartha株為代表的基因1型和我國流行的基因2型。本試驗分離的毒株均為基因2 型毒株，與當前我國主要流行毒株的遺傳關系接近。

豬偽狂犬病毒只有一個血清型，但不同毒株在毒力和生物學特征等方面存在差異。本試驗分離的豬偽狂犬病毒SCHS 株、SCM1 株與JXHS株無外源病毒污染，滴鼻感染8～9 周齡試驗仔豬，均能導致試驗豬全部（5∕5）出現(xiàn)體溫反應，但不同毒株的毒力存在較大差異。SCHS株攻毒后全部（5∕5）出現(xiàn)呼吸道癥狀，觀察期內有3∕5死亡；SCM1株攻毒后有4∕5出現(xiàn)呼吸道癥狀，觀察期內有1∕5 死亡；JXHS 株攻毒后有2∕5 出現(xiàn)呼吸道癥狀，觀察期內全部存活。

SCHS、SCM1、JXHS 這3 個純凈的豬偽狂犬病毒流行毒株均能導致易感動物發(fā)病，成功地構建了豬偽狂犬病流行毒株的攻毒模型。本試驗有助于進一步評價不同毒株活疫苗對我國當前PRV流行毒株的攻毒保護效果，為豬偽狂犬病疫苗的評價，滅活疫苗及新型弱毒疫苗的研發(fā)提供新的依據(jù)。