楊道茂， 陳煌

(1. 華僑大學(xué) 化工學(xué)院， 福建 廈門 361021；2. 廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司， 福建 廈門 361022)

出于對食品安全的考慮，消費(fèi)者對天然來源產(chǎn)品的需求日益提高.按照美國和歐洲的立法，天然香辛料是指其原料來源于動物、植物或通過物理、酶和微生物的處理方式獲得的,且?guī)в蟹枷阄兜幕衔颷1-2].天然來源的化合物比化學(xué)合成的化合物具有更高的市場價值，因此，通過生物轉(zhuǎn)化或酶解工藝獲得天然生物香料就具有很高的市場研發(fā)價值[3].(+)-檸檬烯為結(jié)構(gòu)最簡單的環(huán)狀單萜類化合物，主要分布于葡萄柚、檸檬、酸橙，橘子中，為柑橘加工廠的副產(chǎn)物檸檬精油的主要成分.研究表明，由檸檬烯出發(fā)，共有6條代謝途徑可以生成一系列香料型含氧衍生物[4-15].底物和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的價格差異巨大[16]，通過生物轉(zhuǎn)化作用可以實(shí)現(xiàn)檸檬烯的結(jié)構(gòu)改造，從而達(dá)到產(chǎn)業(yè)增值的目的.生物轉(zhuǎn)化檸檬烯的一個關(guān)鍵因素是大量微生物的篩選分離.為此，國內(nèi)外很多科學(xué)家開展了大量的菌株篩選工作，Rottava等[17]在生物轉(zhuǎn)化檸檬烯和α-蒎烯的研究中，從405株菌株中選用193株進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化檸檬烯，有8株能利用檸檬烯生成松油醇，有1株青霉屬微生物最高產(chǎn)量達(dá)3 450 mg·L-1.Bicas等[18]從柑橘加工廠環(huán)境中分離到238株菌株，僅有70株能在以檸檬烯為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長.本文對近海海洋真菌生物轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯進(jìn)行研究.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

1) 試劑.(+)-檸檬烯(純度為96%，穩(wěn)定型，美國Acros Organic公司)；GF254硅膠板(50 mm×100 mm，山東省青島海洋化工有限公司)；無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，其他試劑均為分析純.

2) 儀器.N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA公司)；GCMS-QP2010 Ultra型氣質(zhì)聯(lián)用儀(FID檢測器，附美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)局(NIST)11.0化學(xué)數(shù)據(jù)庫，日本Shimadzu公司).

1.2 近海海域海洋真菌菌株篩選

首先，從福建省廈門市環(huán)島路沙灘上采集海水浸泡的海藻、浮木、貝殼等材料，用無菌海水洗凈.然后，取2 g材料浸泡于10 g無菌海水中，并粉碎、靜置；取1 mL上清液涂布于用海水配制的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(內(nèi)含20～50 μg·mL-1的青霉素和鏈霉素)中，于30 ℃下培養(yǎng)2～3 d后，按照菌落形態(tài)的差異，挑選單菌株劃線分離，直到獲得單菌落為止.最后，將各單菌落保存到斜面?zhèn)溆?

1.3 生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

挑選上述分離到的30株真菌置于沙保氏培養(yǎng)基(40 g·L-1葡萄糖，10 g·L-1蛋白胨，1 L陳海水，pH值自然)中，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn).用接種環(huán)挑取實(shí)驗(yàn)菌的菌絲或孢子，每株真菌接種到2個250 mL的錐形瓶中，每個錐形瓶接100 mL培養(yǎng)基，于30 ℃，150 r·min-1下培養(yǎng)6 d.然后，在其中一個錐形瓶中加入1 mL檸檬烯底物溶液(V(檸檬烯)∶V(乙醇)=1∶1，檸檬烯的最終體積分?jǐn)?shù)為0.5%)作為實(shí)驗(yàn)組，另外一瓶作為菌株對照組,不做其他處理.同時,單獨(dú)取一無菌培養(yǎng)基加入等量底物溶液，設(shè)置為底物對照組，即該培養(yǎng)基內(nèi)只含體積分?jǐn)?shù)為0.5%的底物溶液，而不接種任何菌株.在相同條件下，錐形瓶繼續(xù)培養(yǎng)4 d.生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將各菌株的發(fā)酵液用濾紙過濾，濾液用100 mL乙酸乙酯萃取2次，并合并萃取液，經(jīng)無水硫酸鈉脫水后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1.5 mL左右；將濃縮液置于1.5 mL的離心管中，用10 000g的相對離心力離心10 min，取上層有機(jī)相用于產(chǎn)物成分分析.

1.4 產(chǎn)物成分分析

將底物對照組、菌株實(shí)驗(yàn)組和菌株對照組樣品進(jìn)行薄層色譜(TLC)點(diǎn)板預(yù)檢測.顯色劑為香草醛-硫酸-乙醇顯色劑(15 g香草醛溶于250 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的濃硫酸-乙醇溶液中)；展開劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=15∶4或V(氯仿)∶V(甲醇)=10∶1的溶液.

將菌株實(shí)驗(yàn)組與底物對照組間存在差異的樣品進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析.GC-MS的檢測條件:色譜柱為Rxi-5sil MS(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱箱溫度為60 ℃，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，柱流量為1 mL·min-1，分流比為1∶2，進(jìn)樣量為1 μL.升溫程序?yàn)椋褐鶞?0 ℃×3 min→升溫速度10 ℃·min-1→柱溫150 ℃×5 min→升溫速度20 ℃·min-1→柱溫250 ℃×3 min.質(zhì)荷比(m/z)掃描范圍為40～200.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌株分離純化

在菌落初篩階段共篩選出80株真菌，其中，65株為霉菌，15株為酵母菌.對菌株進(jìn)行編號(1～80)，并保存于4 ℃冰箱中備用.

(a) V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=15∶4 (b) V(氯仿)∶V(甲醇)=10∶1圖1 菌株萃取液的TLC結(jié)果Fig.1 TLC result of extracts from strains

2.2 菌株萃取液的TLC檢測

挑選出30株菌株，將其底物對照組、菌株實(shí)驗(yàn)組和菌株對照組的萃取液分別進(jìn)行TLC實(shí)驗(yàn)，判斷是否出現(xiàn)差異點(diǎn).結(jié)果表明，大部分菌株對照組的TLC板上無斑點(diǎn).在TLC的比對結(jié)果中，23，27，36，41號菌株可能具有生物轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯的能力.菌株萃取液的TLC結(jié)果，如圖1所示.圖1中：Lim為底物對照組；ct為菌株對照組.

由圖1可知：培養(yǎng)4 d后， 底物對照組有5個明顯的斑點(diǎn)(比移值Rf分別為0.14，0.49，0.62，0.75，0.86);當(dāng)Rf=0.54時，23，36號菌株出現(xiàn)1個明顯的斑點(diǎn)，與底物對照組進(jìn)行比對，推測這2株菌具有生物轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯能力.

由圖1還可知：41號菌株出現(xiàn)的4個主要斑點(diǎn)均與底物重合，其他部分略有些差異，推測該菌株可能具有一定的生物轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯能力；當(dāng)Rf=0.20時，27號菌株的實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)1個紅色斑點(diǎn)，經(jīng)與菌株對照組比對，表明該紅點(diǎn)為菌株自身代謝產(chǎn)物，其余位置只出現(xiàn)3個主要斑點(diǎn)，與底物對照組差異較大，由此推測27號菌株可能具有一定的生物轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯能力.

2.3 菌株萃取液的GC-MS檢測

將23，27，36，41號菌株的萃取液進(jìn)行GC-MS檢測(代謝產(chǎn)物的GC-MS分析工作主要借助華僑大學(xué)材料學(xué)院宋秋玲教授課題組儀器完成)，其總離子流色譜圖，如圖2所示.圖2中：δ為相對強(qiáng)度；1～6代表可辨識的化合物峰信號;tR為各化合物峰的保留時間.

(a) 23號菌株 (b) 27號菌株

(c) 36號菌株 (d) 41號菌株圖2 菌株萃取液的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of extracts from strains

由圖2可知：23,36號菌株的峰信號1(tR=7.78 min)相對強(qiáng)度最大，底物(檸檬烯)信號(tR=5.64 min)較弱，表明這兩株菌株能轉(zhuǎn)化底物，生成峰信號1所代表的化合物，該結(jié)果與圖1的TLC判斷結(jié)果一致；27,41號菌株中的峰信號2(tR=5.40 min)和峰信號3(tR=5.61 min)的相對強(qiáng)度均比底物信號更大，說明27,41號菌株也能轉(zhuǎn)化底物，生成其他一系列化合物，該結(jié)果與圖1的TLC判斷結(jié)果一致.

圖3 暫定的菌株生物轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.3 Tentatively identified chemical structure of metabolitesby biotransformation of (+)-limonene

通過NIST化學(xué)數(shù)據(jù)庫檢索，并結(jié)合生物轉(zhuǎn)化檸檬烯的作用機(jī)理，暫定出4株菌株生物轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，如圖3所示.各菌株主要代謝產(chǎn)物準(zhǔn)確的化學(xué)結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證.

3 討論

菌株來源于福建省廈門市近海海域腐爛的沉積木、海藻等組織，按照海洋真菌定義，只要是在海洋環(huán)境中分離，并能在海水鹽度(或略低于海水鹽度)的培養(yǎng)基中正常生長的真菌，都可以稱為海洋真菌或海洋生真菌.因此，實(shí)驗(yàn)來源的真菌都屬于兼性海洋真菌[19].

目前，關(guān)于生物轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯的微生物報道很多，主要有以下5類：1) 細(xì)菌，如惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)[20-22]、海洋弧菌(Vibriocholerae，Listonelladamsela，Vibrioalginolyticus)[23]；2) 酵母菌，如解脂耶氏酵母(YarrowialipolyticaATCC 18942)[13]；3) 真菌，如植物內(nèi)生真菌(Phomopsissp.)[6]、柑橘綠霉(PenicilliumdigitatumDSM 62840)[10]、尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum152B)[15]；4) 微藻(Chlorella，Oocystis，Chlamydomonas和Synechococcus)[7]；5) 斜紋夜蛾的幼蟲(Spodopteralitura)[24].然而，目前較少有關(guān)于利用海洋真菌完成生物轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯方面的報道.

利用海洋真菌生活環(huán)境產(chǎn)生的獨(dú)特催化特性進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其代謝產(chǎn)物與文獻(xiàn)報道的陸地微生物代謝產(chǎn)物的差異較大，例如，未檢測出比較常見的香芹酮、檸檬烯-1， 2-二醇、紫蘇醇、紫蘇酸等代謝產(chǎn)物.這說明利用海洋真菌生物轉(zhuǎn)化檸檬烯還有待深入研究.

從廈門近海海域分離了80株真菌，其中，65株為霉菌，15株為酵母菌.在選取的30株兼性海洋真菌中，23,27,36,41號菌株具有生物轉(zhuǎn)化檸檬烯的能力，但其菌株種屬還有待進(jìn)一步確定.4株菌株生物轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯的主要代謝產(chǎn)物暫定為異辣薄荷烯酮、波斯菊萜、1，3，8-孟三烯、4-萜烯醇、二氫香芹酮、香芹醇.23，36號菌株的主要代謝產(chǎn)物異辣薄荷烯酮具有進(jìn)一步研究開發(fā)的價值.