李書國， 童 格，葉 明，鄧娟娟，邵 文

1)三峽大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究所 湖北宜昌 443003 2)宜昌市中心人民醫(yī)院老年病科 湖北宜昌 443003

血管平滑肌細(xì)胞衰老與多種心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生有關(guān)，動(dòng)脈粥樣硬化、腦卒中等疾病發(fā)生時(shí)均伴隨有血管平滑肌細(xì)胞衰老[1]。血管平滑肌細(xì)胞分布于動(dòng)脈中層，血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)能夠誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞衰老，導(dǎo)致血管組織功能障礙[2]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silence information regulator 1,SIRT1)是Sirtuin蛋白家族的成員之一，具有調(diào)控細(xì)胞代謝、抵抗應(yīng)激、調(diào)控胚胎發(fā)育等多種作用，在成人及胚胎組織中廣泛表達(dá)[3]。研究[4-6]顯示，SIRT1具有抵抗衰老相關(guān)疾病的作用，在神經(jīng)退行性疾病、心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮保護(hù)作用；SIRT1能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞衰老。本實(shí)驗(yàn)采用Ang Ⅱ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞衰老，探討SIRT1過表達(dá)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞衰老的影響，為明確SIRT1在動(dòng)脈粥樣硬化血管平滑肌細(xì)胞衰老中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑6周齡SD雄性大鼠25只，體重150～180 g，購自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自美國Cell Signaling Technology公司，P21抗體購自美國Santa Cruz公司,Ang Ⅱ購自美國Millipore公司，P53抗體購自美國Abcam公司，HRP標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SIRT1抗體購自上海士鋒生物科技有限公司，PI細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，PCR試劑購自美國Invitrogen公司；SIRT1過表達(dá)慢病毒載體(Lv-SIRT1)和陰性對(duì)照慢病毒載體(Lv-NC)由上海銳賽生物技術(shù)有限公司構(gòu)建。

1.2血管平滑肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)[7]SD雄性大鼠斷頸處死，取胸腹主動(dòng)脈，剔除脂肪及血管外膜后剪碎，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入含有體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，5 d后去除組織塊，加含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。取第3代細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分為對(duì)照組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+Lv-NC組、Ang Ⅱ+Lv-SIRT1組，每組3個(gè)復(fù)孔。Ang Ⅱ+Lv-NC組、Ang Ⅱ+Lv-SIRT1組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照慢病毒載體和SIRT1過表達(dá)慢病毒載體；Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+Lv-NC組、Ang Ⅱ+Lv-SIRT1組給予100 nmoL/L的Ang Ⅱ培養(yǎng)液培養(yǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老；按照常規(guī)方法進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，MOI=30，轉(zhuǎn)染后3 d觀察其轉(zhuǎn)染效率高于90%。設(shè)置僅用培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照。

1.4qRT-PCR檢測(cè)SIRT1mRNA表達(dá)水平取各組細(xì)胞培養(yǎng)2 d后，加入Trizol提取細(xì)胞中的總RNA，步驟同試劑盒說明書。DEPC水溶解RNA。用cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以SYBR進(jìn)行qRT-PCR。引物序列：SIRT1上游5’-CGGCTGCCA CAGCGTCAT-3’，下游5’-ACAATCTGCCACAGGGT CAT-3’；GAPDH上游5’-ACAACTTTGGCATTGTG GAA-3’，下游5’- GATGCAGGGATGATGTTCTG-3’。反應(yīng)條件：94 ℃，10 min；94 ℃，20 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s，共40個(gè)循環(huán)，根據(jù)目的基因的Ct值，用公式2-ΔΔCt計(jì)算SIRT1表達(dá)水平。

1.5Western blot法檢測(cè)SIRT1蛋白表達(dá)水平取各組細(xì)胞培養(yǎng)2 d后，添加150 μL的RIPA裂解液，置冰上裂解15 min。4 ℃高速離心，吸取上清，用BCA法定量。配制100 g/L的分離膠和50 g/L的濃縮膠。每個(gè)上樣孔中添加40 μg蛋白樣品，80 V電壓電泳30 min，蛋白電泳至分離膠和濃縮膠的分界處，調(diào)整電壓到120 V，蛋白電泳至距離底部邊緣約1 cm時(shí)，停止電泳。將PVDF膜裁剪成凝膠大小，浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中30 min，300 mA的電流轉(zhuǎn)膜50 min。PVDF膜經(jīng)過50 g/L脫脂奶粉封閉以后，浸泡于1∶1 000稀釋的一抗和1∶4 000稀釋的二抗中進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，ECL發(fā)光，Image J掃描。GAPDH作為內(nèi)參，以SIRT1與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為SIRT1蛋白的表達(dá)水平。

1.6β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老取各組細(xì)胞培養(yǎng)2 d，PBS洗滌，每孔加1 mL固定液，室溫下固定10 min，PBS洗滌，添加β-半乳糖苷酶染色液，以膜封板后，37 ℃孵育過夜。顯微鏡下觀察，藍(lán)色細(xì)胞為陽性細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)目的百分比。

1.7Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中P21、P53蛋白的表達(dá)取各組細(xì)胞培養(yǎng)2 d后，采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中P21、P53蛋白水平，步驟同1.5。

1.8PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期取各組細(xì)胞培養(yǎng)2 d后，添加體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，4 ℃過夜。離心后，收集細(xì)胞，添加含有50 mg/L PI的PBS溶液500 μL，4 ℃反應(yīng)30 min。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0分析，各組血管平滑肌細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)、β-半乳糖苷酶陽性率、P21、P53蛋白表達(dá)和細(xì)胞周期分布的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組血管平滑肌細(xì)胞中SIRT1表達(dá)的比較見表1。

表1 各組血管平滑肌細(xì)胞中SIRT1表達(dá)的比較(n=3)

2.2各組血管平滑肌細(xì)胞中β-半乳糖苷酶陽性率和P21、P53蛋白表達(dá)水平比較見表2和圖1。

表2 各組血管平滑肌細(xì)胞中β-半乳糖苷酶陽性率和P21、P53蛋白表達(dá)水平比較(n=3)

1～4：分別為對(duì)照組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+Lv-NC組、Ang Ⅱ+Lv-SIRT1組

2.3各組血管平滑肌細(xì)胞周期分布比較見表3。

表3 各組血管平滑肌細(xì)胞周期分布比較(n=3) %

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是多種心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，而血管平滑肌細(xì)胞衰老是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的早期標(biāo)志[8]。血管平滑肌細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生時(shí)遷移至內(nèi)膜，并在壞死泡沫細(xì)胞周圍聚集，形成纖維帽，進(jìn)而誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生[9-10]。Ang Ⅱ是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的誘導(dǎo)因子，可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞衰老[11-12]。本研究結(jié)果顯示，Ang Ⅱ處理后的血管平滑肌細(xì)胞β-半乳糖苷酶陽性率升高，提示成功構(gòu)建了血管平滑肌細(xì)胞體外衰老模型。

SIRT1是存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的與Sir2同源的保守蛋白，在人體骨骼肌、腦、心臟等組織中的表達(dá)水平最高，在胰腺、卵巢、腎臟等組織中也有不同程度的表達(dá)[13-14]。SIRT1具有抵抗氧化應(yīng)激、減少細(xì)胞凋亡等多種作用，其在動(dòng)脈粥樣硬化組織中表達(dá)下調(diào)；SIRT1表達(dá)水平與總膽固醇、低密度脂蛋白水平呈負(fù)相關(guān)[15-16]。在肝癌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、胰島β細(xì)胞等多種細(xì)胞中SIRT1與細(xì)胞能量代謝和壽命有關(guān)[17-19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SIRT1過表達(dá)可以抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞衰老，提示SIRT1在動(dòng)脈粥樣硬化血管平滑肌細(xì)胞衰老中發(fā)揮抑制作用。

P21、P53是細(xì)胞衰老的標(biāo)志蛋白[20]。有研究[21]表明，SIRT1具有去乙?；疨53蛋白的第382個(gè)賴氨酸殘基的作用，SIRT1可能通過抑制P53蛋白的表達(dá)抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和激活。P21是P53的下游靶基因，細(xì)胞內(nèi)P53表達(dá)下調(diào)可以抑制P21的表達(dá)。P21還是一種細(xì)胞周期抑制因子，可以抑制細(xì)胞周期蛋白E活性，使細(xì)胞周期停滯在G1期，而細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)變是細(xì)胞衰老的特征之一[22]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，衰老誘導(dǎo)后的血管平滑肌細(xì)胞中P21、P53蛋白表達(dá)水平升高，G0/G1期細(xì)胞比例升高；SIRT1過表達(dá)細(xì)胞中P21、P53蛋白表達(dá)水平降低，G0/G1期細(xì)胞比例降低。以上結(jié)果提示SIRT1可能通過降低P53、P21蛋白表達(dá)減輕Ang Ⅱ?qū)ρ芷交〖?xì)胞周期的阻滯作用。

總之，SIRT1參與動(dòng)脈粥樣硬化血管平滑肌細(xì)胞衰老的發(fā)生，SIRT1過表達(dá)能夠抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞衰老，可能與細(xì)胞中P53和P21表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為研究SIRT1調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化血管平滑肌細(xì)胞衰老機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為研究動(dòng)脈粥樣硬化分子發(fā)病機(jī)制提供了參考。