宿利清，王立紅，賀 嵐，付秀華

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 呼和浩特 010059

有研究[1-3]報(bào)道，微小RNA(miRNA)的異常表達(dá)在肺成纖維細(xì)胞的異常增殖和膠原蛋白的合成中發(fā)揮著重要作用，并逐漸成為肺纖維化的研究熱點(diǎn)。miR-155是一種與肺部疾病關(guān)系密切的miRNA，已被證實(shí)在肺纖維化過程中表達(dá)上調(diào)，具有促進(jìn)肺纖維化的作用[4-6]，但臨床上以miR-155為靶點(diǎn)的肺纖維化治療的實(shí)驗(yàn)依據(jù)尚不充分。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，miR-155可通過靶向調(diào)控Smad5促進(jìn)腎臟的纖維化，但其是否通過靶向調(diào)控Smad5參與肺纖維化過程尚不清楚。因此，本研究通過構(gòu)建miR-155低表達(dá)的人胚肺成纖維細(xì)胞HELF，觀察miR-155與Smad5的靶向關(guān)系以及兩者在HELF細(xì)胞增殖、凋亡和膠原蛋白(Col-Ⅰ和Col-Ⅲ)合成中的作用，以期為以miR-155為靶點(diǎn)的肺纖維化治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑Trizol試劑、Lipofectamine 2000、cDNA合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，α-MEM培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒和Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。胰蛋白酶、二甲基亞砜、青霉素、鏈霉素和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。qRT-PCR試劑盒和PCR引物購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。β-actin抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。Col-Ⅰ抗體、Col-Ⅲ抗體、山羊抗鼠/兔IgG二抗和si-Ctrl、si-Smad5均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，Smad5抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。Smad5 3’-UTR野生型(Smad5-WT)、突變型(Smad5-MUT)質(zhì)粒和miR-155模擬物、miR-155抑制劑及其相應(yīng)的陰性對(duì)照均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司。miR-155上游引物序列為5’-CTCGTGGTAATGCTAATT GTGA-3’，下游引物序列為5’-GTGCAGGGTC CGAGGT-3’；內(nèi)參U6上游引物序列為5’-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3’，下游引物序列為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。Smad5上游引物序列為5’-GTGGCATATAGGCAGGAGGA-3’，下游引物序列為5’-AACCTGAGCCACAATGAACC-3’；內(nèi)參β-actin上游引物序列為5’-GGCGGCAACACCATG TACCCT-3’，下游引物序列為5’-AGGGGCCG GACTCGTCATACT-3’。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染人胚肺成纖維細(xì)胞HELF購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。HELF細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、青-鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基。置于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37 ℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HELF細(xì)胞以適當(dāng)密度(2.5×105個(gè)/孔)鋪于6孔板上，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞達(dá)80%融合度時(shí)將細(xì)胞分為對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染組)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑陰性對(duì)照)、anti-miR-155組(轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑)，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后，更換成含血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.33組細(xì)胞中miR-155mRNA表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè)采用Trizol法提取對(duì)照組、anti-miR-NC組和anti-miR-155組HELF細(xì)胞的總RNA，并參照cDNA合成試劑盒說明書步驟合成cDNA。以cDNA為模板，U6和β-actin為內(nèi)參，按照PCR試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，并采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-155的表達(dá)水平。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性120 s；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.43組細(xì)胞增殖的CCK-8法檢測(cè)取繼續(xù)培養(yǎng)48 h后的對(duì)照組、anti-miR-NC組和anti-miR-155組HELF細(xì)胞，加入CCK-8試劑10 μL/孔，反應(yīng)1 h后，上酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.53組細(xì)胞凋亡的雙染法檢測(cè)收集繼續(xù)培養(yǎng)48 h后的對(duì)照組、anti-miR-NC組和anti-miR-155組HELF細(xì)胞，并以PBS洗滌2次。以500 μL的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后，參照凋亡試劑盒依次加入Annexin V-FITC和PI試劑各5 μL。避光條件下反應(yīng)15 min后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.63組細(xì)胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)向待測(cè)的對(duì)照組、anti-miR-NC組和anti-miR-155組HELF細(xì)胞中加入RIPA細(xì)胞裂解液，于冰上裂解30 min，離心取上清液，加入蛋白上樣緩沖液煮沸變性5 min。取變性蛋白樣品50 μg行SDS-PAGE凝膠電泳。轉(zhuǎn)PVDF膜后，以50 g/L脫脂奶粉溶液于37 ℃下封閉1 h后，加入特異性一抗(按1∶1 000稀釋)于4 ℃下反應(yīng)過夜。洗膜后，加入二抗(按1∶2 000稀釋)于37 ℃下反應(yīng)2 h。再次洗膜后，加入化學(xué)發(fā)光劑顯色曝光，凝膠成像系統(tǒng)掃描，以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件分析目的條帶的灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7miR-155和Smad5靶向關(guān)系的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及各組細(xì)胞中Smad5mRNA和蛋白表達(dá)的檢測(cè)采用TargetScan(http://www.targetscan.org)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-155的靶基因可能為Smad5。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HELF細(xì)胞，以適當(dāng)密度接種至24孔板上，常規(guī)培養(yǎng)達(dá)75%融合度時(shí)，將細(xì)胞分為miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-155模擬物陰性對(duì)照)和miR-155組(轉(zhuǎn)染miR-155模擬物)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑陰性對(duì)照)、anti-miR-155組(轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑)，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書，并以海腎質(zhì)粒的熒光值為內(nèi)參，檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性。采用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Smad5 mRNA和蛋白的表達(dá)。

1.8Smad5沉默逆轉(zhuǎn)miR-155低表達(dá)對(duì)HELF細(xì)胞增殖、凋亡、Smad5、膠原蛋白合成的作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HELF細(xì)胞，以適當(dāng)密度接種至24孔板上，常規(guī)培養(yǎng)達(dá)75%融合度時(shí)，將細(xì)胞分為anti-miR-NC組、anti-miR-155組、anti-miR-155+si-Ctrl組(共轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑和si-Ctrl)和anti-miR-155+si-Smad5組(共轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑和si-Smad5)，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。48 h后，分別檢測(cè)4組細(xì)胞的吸光度、凋亡率和細(xì)胞中Smad5、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)比較各組細(xì)胞中miR-155、吸光度值、凋亡率和細(xì)胞中Smad5、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達(dá)水平的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.13組細(xì)胞中miR-155表達(dá)水平、吸光度值和凋亡率的比較結(jié)果見表1。由表1可知，轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑后，HELF細(xì)胞中miR-155 mRNA的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑陰性對(duì)照的HELF細(xì)胞中的miR-155 mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CCK-8和流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，anti-miR-155組細(xì)胞的吸光度值降低，凋亡率升高(P<0.05)；anti-miR-NC組細(xì)胞的吸光度值和凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 3組細(xì)胞中miR-155表達(dá)水平、細(xì)胞的吸光度值和凋亡率的比較(n=3)

2.23組細(xì)胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達(dá)的比較結(jié)果見表2。由表2可知，與對(duì)照組相比，anti-miR-NC組細(xì)胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表達(dá)水平無明顯改變(P>0.05)；而anti-miR-155組中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.05)。

表2 3組細(xì)胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達(dá)的比較(n=3)

2.3各組細(xì)胞的熒光素酶活性和細(xì)胞中Smad5mRNA、蛋白表達(dá)的結(jié)果見表3。由表3可知，miR-155組細(xì)胞的熒光素酶活性較miR-NC組降低；而anti-miR-155組細(xì)胞的熒光素酶活性較anti-miR-NC組均升高(P<0.05)。miR-155組和anti-miR-155組細(xì)胞的熒光素酶活性較相應(yīng)對(duì)照miR-NC、anti-miR-NC組均無明顯改變(P>0.05)。miR-155組細(xì)胞中Smad5 mRNA和蛋白的表達(dá)水平低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-155組細(xì)胞中Smad5 mRNA和蛋白的表達(dá)高于anti-miR-NC組(P<0.05)。

表3 各組細(xì)胞的熒光素酶活性和細(xì)胞中Smad5 mRNA、蛋白表達(dá)水平的比較(n=3)

2.4Smad5沉默逆轉(zhuǎn)miR-155低表達(dá)對(duì)HELF細(xì)胞增殖、凋亡及膠原蛋白合成的作用結(jié)果見表4。由表4可知，與anti-miR-NC組相比，只轉(zhuǎn)染miR-155抑制物下調(diào)miR-155表達(dá)后，HELF細(xì)胞的吸光度值和Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白的表達(dá)水平均降低，而Smad5蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率均升高(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染si-Smad5后，miR-155低表達(dá)對(duì)HELF細(xì)胞的上述作用均受到抑制。

表4 各組細(xì)胞的吸光度值、凋亡率和細(xì)胞中Smad5、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達(dá)水平的比較(n=3)

3 討論

miRNAs是一類廣泛分布于機(jī)體組織和細(xì)胞中的單鏈小分子RNA，可通過與靶基因mRNA的3′UTR區(qū)域結(jié)合，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，導(dǎo)致靶基因的沉默，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物過程，與癌癥、閉塞性疾病和神經(jīng)性疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[8-10]。miR-155是一種多功能的miRNA，位于人21q21染色體上，可通過調(diào)控多種靶基因參與細(xì)胞的增殖、凋亡過程。例如：下調(diào)miR-155表達(dá)可通過靶向SOCS3抑制淋巴瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中上調(diào)的miR-155可通過靶向eNOS發(fā)揮促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的作用[12]。同時(shí)，miR-155也可通過多種途徑參與纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展過程。如：miR-155敲除可通過靶向腫瘤蛋白p53抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖和分化，減少膠原沉積，進(jìn)而可改善左心室功能，減少梗死面積[13]。miR-155在心梗后的纖維化過程中也發(fā)揮著重要作用，其可通過靶向調(diào)控TP53INP1的表達(dá)，促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的增殖、膠原合成和表型轉(zhuǎn)化，并抑制成纖維細(xì)胞凋亡[14]。

Smads蛋白家族是TGF-β超家族中一類重要的細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞增殖和凋亡過程中發(fā)揮中重要作用[15-16]； Smad5是Smads家族中的重要成員，位于第5號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)1帶，被證實(shí)可通過介導(dǎo)BMP-7信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮保護(hù)機(jī)體腎臟纖維化的作用，且miR-155可通過靶向調(diào)控Smad5促進(jìn)糖尿病腎病腎臟纖維化[7,17]。肺纖維化的分子機(jī)制十分復(fù)雜，肺成纖維細(xì)胞的過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積是肺纖維化的重要病理特征。膠原蛋白Col-Ⅰ和Col-Ⅲ是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，可由成纖維細(xì)胞分泌合成[18]。因此，探討成纖維細(xì)胞增殖、凋亡和膠原蛋白合成的分子機(jī)制對(duì)闡明肺纖維化發(fā)生發(fā)展機(jī)制具有重要意義。盡管已有研究[6]指出，miR-155可通過靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子LXRα發(fā)揮保護(hù)肺纖維化的作用，但miR-155是否可通過靶向Smad5參與肺成纖維細(xì)胞增殖、凋亡和膠原合成的調(diào)控機(jī)制并不清楚。本研究首先通過轉(zhuǎn)染miR-155抑制物建立miR-155低表達(dá)的人胚肺成纖維HELF細(xì)胞株，采用常規(guī)生物學(xué)手段觀察miR-155低表達(dá)對(duì)HELF細(xì)胞增殖、凋亡和膠原合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-155低表達(dá)能夠抑制HELF細(xì)胞增殖和Col-Ⅰ、Col-Ⅲ膠原蛋白的合成。這一結(jié)果反向印證了早期Kurowska-Stolarska等[6]發(fā)現(xiàn)的miR-155高表達(dá)的小鼠原代肺成纖維細(xì)胞的增殖活力和膠原合成能力增強(qiáng)的結(jié)論。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-155低表達(dá)可促進(jìn)HELF細(xì)胞凋亡。同時(shí)，采用TargetScan軟件預(yù)測(cè)并通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-155可與Smad5 3’UTR區(qū)域結(jié)合并負(fù)向調(diào)控Smad5表達(dá)；轉(zhuǎn)染si-Smad5成功沉默Smad5表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)miR-155低表達(dá)對(duì)HELF細(xì)胞增殖、凋亡和膠原合成的作用明顯削弱。提示，miR-155可通過靶向Smad5調(diào)控肺成纖維細(xì)胞增殖、凋亡和膠原蛋白的合成，進(jìn)而參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-155在肺纖維化過程中發(fā)揮著重要作用，其低表達(dá)可通過靶向調(diào)控Smad5表達(dá)來抑制成纖維細(xì)胞增殖、膠原蛋白合成，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究?jī)H從體外細(xì)胞水平上探討了miR-155在成纖維細(xì)胞增殖、凋亡和膠原蛋白合成的作用，后續(xù)仍需從體內(nèi)動(dòng)物水平上加以驗(yàn)證，為miR-155成為肺成纖維化治療的靶點(diǎn)提供新的參考依據(jù)。