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成骨細(xì)胞源性外泌體的分離提取和鑒定

2020-02-27 09:40蔡則成楊紹兵張彥龍梁思敏
寧夏醫(yī)學(xué)雜志 2020年12期
關(guān)鍵詞:膜蛋白外泌體源性

蔡則成,楊紹兵,馬 榮,張彥龍,梁思敏

脊柱結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性感染性疾病,以進(jìn)行性骨質(zhì)破壞為主要病理特征[1],破骨細(xì)胞在脊柱結(jié)核骨質(zhì)破壞的發(fā)生發(fā)展中起著極其重要的作用。正常情況下,成骨細(xì)胞形成新骨,破骨細(xì)胞吸收舊骨,二者相輔相成,保持著骨骼的健康生長(zhǎng)[2]。近年來(lái),外泌體的研究受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,作為細(xì)胞間通訊的主要媒介,通過(guò)信息傳遞,調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的生物學(xué)行為。成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的交互作用,是否也通過(guò)外泌體來(lái)完成,目前報(bào)道不多。本研究旨在體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞,分離提取成骨細(xì)胞源性外泌體,并對(duì)其表征與表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定,進(jìn)而為后期成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的相互作用的研究提供前期基礎(chǔ),為脊柱結(jié)核的基礎(chǔ)研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料:胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(以色列Biological Industries公司),青-鏈霉素、胰蛋白酶(美國(guó)Invitrogen公司),成骨細(xì)胞(K7M2-wt,中科院細(xì)胞庫(kù)),CD9抗體、AKP抗體(英國(guó)Abcam公司),亞超速低溫離心機(jī)(美國(guó)BeckmanAJ-30I),透射電子顯微鏡(日本Hitachi H-9500)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)及收集:成骨細(xì)胞(K7M2-wt)在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素-鏈霉素、90% DMEM中的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),并置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行增殖。

1.2.2 差速離心法收集成骨細(xì)胞源性外泌體:①配制無(wú)外泌體培養(yǎng)基。將胎牛血清進(jìn)行離心15 min(100 000 g、4 ℃),去除血清中的外泌體,然后按10%胎牛血清、100 U/mL青-鏈霉素及DMEM的比例配制完成。②將成骨細(xì)胞分別接種至10 cm培養(yǎng)皿中(7×106/皿,3皿),在培養(yǎng)24 h后,待細(xì)胞貼壁后將培養(yǎng)基更換為無(wú)外泌體培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后收集上清液,用過(guò)濾器(孔徑0.22 μm)進(jìn)行過(guò)濾后,采用亞超速低溫離心機(jī)離心10 min(4 ℃,300 g)后取上清液;繼續(xù)離心10 min(4 ℃,2 000 g),取上清液;繼續(xù)離心30 min(4 ℃,100 00 g),取上清液;繼續(xù)離心90 min(4 ℃,140 000 g),棄上清液,所得沉淀即為外泌體。③用PBS緩沖液洗滌沉淀并重懸后,140 000 g再次離心90 min,再次用100 μl PBS緩沖液重懸沉淀,于-80 ℃低溫保存,備用。

1.2.3 外泌體的鑒定:①透射電子顯微鏡觀察(TEM)形態(tài)。在室溫條件下,在銅網(wǎng)上輕輕滴入外泌體懸液10 μl,吸附1 min,并干燥1 min后,用濾紙從側(cè)面吸干多余的液體,用醋酸雙氧鈾室溫染色1 min,吸干染液并自然干燥12 h 后在TEM下觀察外泌體的形態(tài)。②WB檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白。取20 μl 外泌體,加入3.5 μl 6XSDS-PAGE上樣緩沖液,沸水變性5 min,立即冰上孵育靜置;然后進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)印至PVDF膜,封閉1 h;一抗4 ℃過(guò)夜孵育(稀釋度:CD9為1∶2 000,AKP為1∶2 500),PBST洗滌3次,每次5 min;二抗孵育2 h,PBST洗滌3次,每次5 min,最后顯色成像。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞的培養(yǎng):顯微鏡下觀察,成骨細(xì)胞培養(yǎng)24 h后可貼壁,細(xì)胞呈梭形、三角形或不規(guī)則圓形,呈鋪路石狀,并且有集落樣生長(zhǎng)趨勢(shì),集落中心細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞核居中或偏于細(xì)胞一側(cè),見圖1(目錄后)。

2.2 成骨細(xì)胞源性外泌體的鑒定:透射電鏡下,以差速離心法提取成骨細(xì)胞源性外泌體為圓形或接近圓形,直徑在30~100 nm,與文獻(xiàn)[3]報(bào)道的外泌體形態(tài)、大小基本一致。通過(guò)WB檢測(cè)其跨膜蛋白CD9和來(lái)源細(xì)胞的特異性蛋白AKP表達(dá)陽(yáng)性,見圖2(目錄后)。

3 討論

脊柱結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種慢性感染性疾病,是最常見的骨關(guān)節(jié)結(jié)核,主要的病理特征為進(jìn)行性的椎骨破壞,從而導(dǎo)致脊柱失穩(wěn)、畸形,甚至并發(fā)截癱,嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量,社會(huì)危害性大[1]。這種病理變化與破骨細(xì)胞的異常增殖和活化有著密切關(guān)系,但確切機(jī)制目前并未研究清楚,可能與免疫調(diào)節(jié)、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子或細(xì)胞通訊等的作用有關(guān)[4]。在骨微環(huán)境中成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的作用是相輔相成的,脊柱結(jié)核破骨細(xì)胞的異常增殖是否與成骨細(xì)胞有關(guān),目前亦無(wú)統(tǒng)一結(jié)論。

外泌體是細(xì)胞內(nèi)部的囊泡結(jié)構(gòu),幾乎所有細(xì)胞均可分泌,具有脂質(zhì)雙層膜,是一類粒徑為30~120 nm,有典型的“茶托”形態(tài),含有來(lái)源細(xì)胞的部分蛋白質(zhì)、核酸及降解片段等成分,作為細(xì)胞間通訊的主要介質(zhì),可以將這些內(nèi)部信息傳遞給靶細(xì)胞,調(diào)控靶細(xì)胞的生物學(xué)行為[5]。基于外泌體的理論知識(shí),我們?cè)O(shè)想破骨細(xì)胞的形成是否與成骨細(xì)胞的調(diào)控有關(guān),成骨細(xì)胞是否通過(guò)外泌體途徑誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成。為了驗(yàn)證此假設(shè),我們前期進(jìn)行了成骨細(xì)胞源性外泌體的提取分離和鑒定。

由于外泌體的體積、密度較小,將其與細(xì)胞中的其它成分進(jìn)行分離的難度大,而且不同的分離方法得到的外泌體理化性質(zhì)亦不相同,目前差速離心法是分離外泌體的“金標(biāo)準(zhǔn)”,也是實(shí)驗(yàn)中最廣泛的方法[6]。差速離心法的基本原理是:因外泌體的在細(xì)胞培養(yǎng)液中的重量非常小,離心的過(guò)程中,重量大的非外泌體物質(zhì)較早地沉淀在底部,而外泌體需要更大的離心力才能沉淀,并且脂蛋白、蛋白質(zhì)等物質(zhì)聚集在一起可以共同沉淀[7]。故本研究采用最經(jīng)典的差速離心法來(lái)提取、分離成骨細(xì)胞釋放的外泌體,研究證實(shí)此方法可行。文獻(xiàn)報(bào)道,在觀察外泌體的大小與形態(tài)時(shí),多推薦采用透射電子顯微鏡(TEM),它是將經(jīng)過(guò)加速和聚集的電子束投射在樣品上,從而出現(xiàn)立體角散射。目前TEM的分辨率可達(dá)到0.2 nm,遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于外泌體的粒徑,并且有研究發(fā)現(xiàn)在TEM下,差速離心法獲得的外泌體直徑多在30~100 nm,形態(tài)與大小均一,但是試劑盒獲得外泌體卻無(wú)法達(dá)到良好的觀測(cè)結(jié)果[8]。本研究采用所提取的成骨細(xì)胞來(lái)源的外泌體,在TEM下呈“茶托樣”外觀,直徑在30~100 nm,符合外泌體的一般特性,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]。

通常來(lái)說(shuō),外泌體的蛋白質(zhì)組成與其來(lái)源細(xì)胞有著密切的關(guān)系,雖然來(lái)源的細(xì)胞種類非常多,但是不同的細(xì)胞所分泌的外泌體可以表達(dá)部分相同的蛋白質(zhì),如膜轉(zhuǎn)運(yùn)融合蛋白(annexins、RAN、GTpases)、跨膜蛋白(CD63、CD81、CD9)、熱休克蛋白(Hsp70、Hsp90)等。此外,還可以表達(dá)與來(lái)源細(xì)胞相同的特異性蛋白,如A33(結(jié)腸上皮細(xì)胞來(lái)源)、MHC-Ⅱ(抗原提呈細(xì)胞來(lái)源)等[9]。本研究通過(guò)WB的方法測(cè)試成骨細(xì)胞源性外泌體表達(dá)跨膜蛋白CD9與來(lái)源細(xì)胞的特異性蛋白AKP的表達(dá)情況,結(jié)果證明成骨細(xì)胞源性外泌體高表達(dá)跨膜蛋白CD9和來(lái)源細(xì)胞的特異性蛋白AKP,與外泌體的基本特征一致[10]。

綜上所述,采用差速離心法成功獲取了成骨細(xì)胞來(lái)源外泌體,其外觀、大小及跨膜蛋白的表達(dá)具有外泌體的一般特性,并高表達(dá)成骨細(xì)胞特異性蛋白AKP,為后期成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞相互作用的研究提供了前期基礎(chǔ)。

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