柳興源，李菁媛，楊靜

0 引言

胰腺癌是一種惡性程度高，診斷和治療都很困難，且預(yù)后極差的消化道惡性腫瘤[1]，但腫瘤發(fā)生的具體分子網(wǎng)絡(luò)機制尚未完全闡明。研究腫瘤發(fā)生的潛在機制可能是延長患者生存時間的關(guān)鍵。近年來，基于高通量平臺的基因分析已成為一種具有廣泛臨床應(yīng)用前景的工具，如腫瘤的分子診斷和分類、腫瘤反應(yīng)和患者預(yù)后的預(yù)測等。微陣列技術(shù)探索與胰腺癌發(fā)生有關(guān)的基因表達產(chǎn)物，揭示了數(shù)百個參與腫瘤發(fā)生過程的差異表達基因（DEGs），在識別新的治療靶點方面具有潛在的作用。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析和實驗方法，對胰腺癌進展過程中的DEGs進行了鑒定和驗證，進行了包括細胞成分（CC），生物過程（BP）和分子功能（MF）的GO分析、KEGG通路分析并且進行了蛋白-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，探討了可能在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的Hub基因，并在一些胰腺癌組織中用反轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）證實這些Hub基因的mRNA水平在胰腺癌組織中有差異表達。

1 資料與方法

1.1 微陣列數(shù)據(jù)集

GSE15471、GSE16515、GSE28735、GSE62165是從NCBI GEO數(shù)據(jù)庫下載的胰腺癌基因芯片數(shù)據(jù)集。

1.2 DEGs的篩選

使用GEO2R交互式網(wǎng)絡(luò)工具識別在不同實驗條件下差異表達的基因，并用LIMMA軟件包識別數(shù)據(jù)集中的DEGs，這些數(shù)據(jù)已經(jīng)處理、歸一化和轉(zhuǎn)化。只有l(wèi)og|FC|＞1且adj.P.Value＜0.05的基因被認為是有統(tǒng)計學(xué)意義的DEGs。此外，選擇性的將DEGs分為兩組：上調(diào)差異表達基因（uDEGs）和下調(diào)的差異表達基因（dDEGs），使用韋恩圖工具（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）分別得到了所識別的uDEGs和dDEGs的共同交集。

1.3 DEGs的GO分析和KEGG分析

本研究使用DAVID對兩組DEGs進行了顯著性富集分析，以P＜0.05為判定標準。

1.4 構(gòu)建生物網(wǎng)絡(luò)

為了評估被識別的DEGs之間的相互作用，我們將它們映射到STRING數(shù)據(jù)庫并構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape，使用Cytoscape插件cytohubba和mcode對網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點和子網(wǎng)絡(luò)進行預(yù)測和探索。

1.5 Hub基因的生存分析

GEPIA是一種交互式探索生存相關(guān)性的工具，包含多項癌癥研究的生存數(shù)據(jù)。采用Kaplan Meier圖和Log rankP值評估兩組患者的總生存率，Log rankP＜0.05為截止標準，對Hub基因進行了生存分析，以驗證結(jié)果。

1.6 患者樣本

2019年1月—2019年6月在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院采集14例胰腺癌標本；此外，收集了6例嚴重胰腺損傷并需要手術(shù)治療的正常成人胰腺組織標本，用于研究的人群特征見表1。在應(yīng)用組織樣本之前，所有患者均獲得知情同意。本研究符合“赫爾辛基宣言”的規(guī)定，并得到了錦州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準。標本由臨床病理學(xué)家根據(jù)消化系統(tǒng)腫瘤WHO分類（WHO Classification of Tumors of the Digestive System）2012第四版進行組織學(xué)分級。每個活檢標本分為兩個部分，一部分用于常規(guī)組織學(xué)診斷，另一部分用于本研究。

表1 JMU研究人群的臨床病理特征Table 1 Clinicopathological characteristics of JMU study population

1.7 反轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）

首先用TRIzol?試劑（Invitrogen?）從組織中提取總RNA，而后PrimeScript? RT-PCR試劑盒（TakaraBio）合成mRNA cDNA。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）采用7500實時熒光PCR系統(tǒng)（Thermo Fisher）。先在95?C下變性10 min，而后在95?C下進行40個循環(huán)15 s，然后在60?C下用SYBR?綠色混合物進行1 min的變性，以GAPDH作為內(nèi)源性對照。所用到的引物序列參見表2。

表2 RT-qPCR引物序列Table 2 Primer sequence of RT-qPCR

2 結(jié)果

2.1 DEGs的篩選

共有245 個基因被鑒定為GSE 15471、GSE16515、GSE28735、GSE62165之間的DEGs，其中181個基因表達上調(diào)，64個基因表達下調(diào)，見圖1。

圖1 四個mRNA表達譜(GSE15471、GSE16515、GSE28735、GSE62165)中uDEGs(A)和dDEGs(B)的Venn圖Figure 1 Venn diagram of uDEGs(A) and dDEGs(B) in four mRNA expression profiles (GSE15471,GSE16515,GSE28735 and GSE62165)

2.2 功能和路徑富集分析

GO分析表明uDEGs和dDEGs在生物過程、細胞成分、分子功能中分別富集，結(jié)果見表3。

2.3 基于KEGG通路富集分析

KEGG分析結(jié)果表示，uDEGs與ECM-receptor interaction、Focal adhesion、Amoebiasis、PI3KAkt signaling pathway信號通路密切相關(guān)。而dDEGs與Pancreatic secretion、Protein digestion and absorption、Complement and coagulation cascades、ErbB signaling pathway信號通路密切相關(guān)。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

用篩選出的DEGs構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖2A。在STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中，可見網(wǎng)絡(luò)中共有206個節(jié)點和747條邊。用mcode插件篩選出的結(jié)果見圖2B。用cytohubba按網(wǎng)絡(luò)特征對節(jié)點進行排序，從DEGs中篩選出Top 25的差異基因包括FN1、ALB、EGF、MMP9、COL1A1、POSTN、COL3A1、FBN1、BGN、VCAN、MMP14、MMP1、MET、MMP7、RUNX2、PLAU、ITGA2、THBS2、MMP12、KRT19、LCN2、COL5A2、COL12A1、COMP、ITGA3。

表3 與胰腺癌相關(guān)的差異表達基因的GO分析Table 3 GO analysis of differentially expressed genes associated with PAAD

2.5 Hub基因的生存分析

在Top 25的基因中用GEPIA預(yù)測，其中MMP14、MMP1、MET、PLAU、ITGA2、KRT19、COL12A1、ITGA3的過表達可能與胰腺癌患者生存不良有關(guān)（P＜0.05），見圖3。

2.6 用RT-qPCR驗證Hub基因

本研究旨在確定基因芯片分析中識別的DEGs是否可以非選擇性地應(yīng)用于臨床胰腺癌患者。RTqPCR實驗結(jié)果表明，MMP14、MMP1、MET、PLAU、ITGA2、KRT19、COL12A1、ITGA3基因表達明顯上調(diào)，與基因芯片分析結(jié)果一致。RTqPCR結(jié)果驗證了這些Hub基因在人胰腺癌組織中的mRNA水平高于對照組，提示這8個Hub基因可能是胰腺癌患者的新的基因特征，見圖4。

圖2 使用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建DEGs的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(A);蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進行模塊分析后得到的重要模塊(B)Figure 2 Protein-protein interaction (PPI) network diagram of DEGs(A) constructed using STRING database and important module(B) obtained using PPI network

圖3 Kaplan-Meier曲線評估Hub基因?qū)AAD患者的預(yù)后意義Figure 3 Prognostic significance of Hub gene interaction in PAAD patients evaluated by Kaplan-Meier curves

3 討論

盡管目前胰腺癌的治療方法取得了進展，但胰腺癌仍然是一種頑固性癌癥，揭示胰腺癌的發(fā)病和分子機制對于預(yù)防、診斷和治療胰腺癌具有重要意義。目前，隨著DNA芯片和高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展，使在基因水平上對包括癌癥在內(nèi)的疾病進行研究成為可能。微陣列基因表達譜已被廣泛應(yīng)用于探索與腫瘤發(fā)生、診斷和治療有關(guān)的DEGs。

腫瘤進展過程中的惡性轉(zhuǎn)化是由一系列的基因改變引起的，在這項研究中，我們從GSE15471、GSE16515、GSE28735、GSE62165中提取數(shù)據(jù)，并利用生物信息學(xué)分析方法在胰腺癌和正常組織之間鑒定了181個uDEGs和64個dDEGs。

結(jié)果表明，由uDEGs和dDEGs主要參與細胞黏附、內(nèi)皮細胞分化、膠原原纖維組織、細胞遷移的正向調(diào)控、蛋白水解作用、活性氧代謝等過程都是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和化療抵抗發(fā)生的重要機制，這同部分研究是一致的[2-4]。此外，uDEGs富集的KEGG通路包括ECM-receptor interaction、Focal adhesion、Amoebiasis，這些通路在患者預(yù)后[5]和癌細胞增殖[6]中起著重要的作用。dDEGs參與的Pancreatic secretion、Protein digestion and absorption、Complement and coagulation cascades通路，它們在胰腺癌的發(fā)生和生長中起著重要作用[7]。

圖4 RT-qPCR法對臨床樣本MMP14、MMP1、MET、PLAU、ITGA2、KRT19、COL12A1、ITGA3基因的mRNA水平進行定量分析Figure 4 Quantitative analysis of mRNA level of MMP14,MMP1,MET,PLAU,ITGA2,KRT19,COL12A1 and ITGA3 gene in clinical samples by RT-qPCR

從DEGs構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中，按連通性高低鑒別出Top 25的關(guān)鍵基因。在這25個候選基因中只有ALB、EGF表現(xiàn)為下調(diào)，其余的基因都表現(xiàn)為上調(diào)。

利用GEPIA進行了胰腺癌患者生存分析，過濾得到了8個基因與胰腺癌的生存分析曲線相關(guān)：MMP14、MMP1、MET、PLAU、ITGA2、KRT19、COL12A1、ITGA3。

MMP14（Matrix Metallopeptidase 14）被認為是在細胞事件中受到廣泛調(diào)控并具有最高連通性的樞紐基因。MMP14過表達與鼻咽癌的臨床分期、N分期和遠處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。MMP14過表達是鼻咽癌患者潛在的不良預(yù)后因素[8]。MMP14在HeLa細胞侵襲中起重要作用，MMP14基因敲除有助于減輕宮頸癌細胞惡性表型[9]。MMP1在腫瘤組織中的過度表達已被認為與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。有研究表明，MMP1在大多數(shù)食管鱗癌組織中的表達明顯高于非腫瘤組織，并且MMP1的過表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、微血管密度和晚期TNM分期密切相關(guān)[10]。MET（MET Proto-Oncogene,Receptor Tyrosine Kinase）為編碼受體酪氨酸激酶家族蛋白的一個成員也是原癌基因的產(chǎn)物。惡性黑色素瘤具有通過細胞固有自主機制發(fā)生表型轉(zhuǎn)變的能力，這種機制與MET的過表達相關(guān)[11]。通過抑制MET而控制腫瘤生長轉(zhuǎn)移成為靶向藥物研發(fā)的方向。PLAU（Plasminogen Activator）為一種編碼纖溶酶原激活物的蛋白編碼基因。研究表明，與PLAU相關(guān)的疾病包乳腺癌[12]、胃癌[13]。ITGA2（Integrin Subunit Alpha 2）的差異表達在多種實體瘤的轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用。ITGA2高表達不僅能抑制細胞遷移，還能誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，ITGA2是胃癌潛在的治療靶點[14]。另外，還有研究表明，ITGA2在調(diào)節(jié)途徑中通過焦點黏附途徑相關(guān)蛋白如非受體酪氨酸激酶、蛋白酪氨酸激酶和AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶促進胰腺癌進展[15]。KRT19（Keratin 19）基因編碼的蛋白質(zhì)屬于角蛋白家族。KRT19的陽性表達是胰導(dǎo)管腺癌患者獨立的不良預(yù)后因素。KRT19過表達與胰導(dǎo)管腺癌的發(fā)生、發(fā)展和不良預(yù)后有關(guān)，是診斷胰腺癌的有價值的生物標志物[16]。KRT19表達的調(diào)節(jié)可能與腫瘤干細胞重編程和藥物敏感度有關(guān)，這可能對癌癥或腫瘤干細胞治療具有臨床意義[17]。COL12A1（Collagen Type XII Alpha 1 Chain）在肌上皮類型疾病發(fā)生中有統(tǒng)計學(xué)意義（PMID:27348394），而肌上皮功能的喪失是一些腫瘤進展的關(guān)鍵步驟。COL12A1在卵巢癌上調(diào)超過20倍，耐藥與細胞外基質(zhì)成分表達之間的關(guān)系密切[18]。ITGA3（Integrin Subunit Alpha 3）作為整合素蛋白的一員，在結(jié)腸癌中存在異常表達的現(xiàn)象，通過對腫瘤細胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。雖然單一的預(yù)后生物標志物已被廣泛報道，但其穩(wěn)定性仍然是一個主要問題[19]。

我們進一步驗證了8個Hub基因在胰腺癌診斷標記中的作用。綜合分析表明它們是預(yù)測胰腺癌的一個有價值和穩(wěn)健性的模型，并且可以有效預(yù)測患者的預(yù)后生存狀況。綜上所述，通過鑒定和綜合分析后獲得的Hub基因均深入?yún)⑴c了胰腺癌的發(fā)生或進展過程，提示這些Hub基因可能作為該疾病的預(yù)后生物標志物或治療靶點。揭示了一系列可能影響胰腺癌發(fā)生發(fā)展的靶點和途徑，為今后的研究提供了依據(jù)。