吳建勇，楊學(xué)云，李建軍，古努爾·吐爾遜，孟肖瀟，洪都孜·波拉提，金映紅，王登峰

（新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊 830013）

牛副結(jié)核病是由副結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium paratuberculosis，MAP）引起的以頑固性腹瀉、肉芽腫性腸道感染為特征的慢性人獸共患傳染病[1]，也是我國二類動物疫病[2]。MAP可感染人及牛、羊等多種動物，其中以奶牛最為易感，可造成奶牛產(chǎn)奶量下降5.9%，牛群死亡率增加6.0%[3,4]。MAP主要經(jīng)糞口途徑傳播，排菌病牛是主要傳染源，以6月齡以下幼畜最為易感，感染后多表現(xiàn)2～5年的隱蔽期和亞臨床期，其中10%病?？砂l(fā)展至臨床期，處于此階段的病牛排菌量是前者的100倍以上，病牛排出的MAP還可通過污染乳、肉制品而對人的健康造成潛在危害，具有較為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生風(fēng)險[5,6]。

副結(jié)核病呈現(xiàn)全球性分布，2011年研究顯示歐洲國家該病流行較為嚴(yán)重，牛群陽性率高于50%[7]；2013年美國奶牛個體陽性率為5%～10%，牛群陽性率則高達(dá)91.1%，病牛因產(chǎn)奶量降低和體重減輕而導(dǎo)致的非計劃淘汰造成了年2億～2.5億美元的經(jīng)濟(jì)損失[8,9]。我國早在20世紀(jì)50年代就報道了副結(jié)核病，至今已在牛、羊、梅花鹿、馬鹿、牦牛等動物發(fā)現(xiàn)該病的流行或散發(fā)病例[10～12]。新疆也是我國副結(jié)核病的多發(fā)地區(qū)，已發(fā)現(xiàn)奶牛、綿羊和馬鹿中存在該病的證據(jù)[13～16]。2015年，新疆18個規(guī)?；膛龅牧餍胁W(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病的抗體陽性率為9.4%[17]。因此，探索制訂副結(jié)核病流行養(yǎng)殖場的處置策略和措施，對于奶牛、肉牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和人畜的健康安全具有重要的意義。

2014年2月-2015年11月，應(yīng)新疆某副結(jié)核病嚴(yán)重流行奶牛場的委托，連續(xù)四次對該牛場開展了該病的血清學(xué)檢測。根據(jù)2014年2-3月和6月的檢測結(jié)果，該牛場淘汰了每次檢出的抗體陽性牛；間隔11個月和17個月后，2015年5月和11月再次對該牛群進(jìn)行了副結(jié)核病的復(fù)查。在此基礎(chǔ)上，對不同采樣時間MAP的感染數(shù)據(jù)以及淘汰病牛對控制牛群副結(jié)核病的效果進(jìn)行了分析，并根據(jù)處置結(jié)果探索制訂牛群副結(jié)核病流行程度的劃分標(biāo)準(zhǔn)和處置方案以供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究對象牛均為荷斯坦牛，初次采樣時該牛場存欄量為800余頭。2014年2月對該牛場進(jìn)行現(xiàn)場調(diào)查中發(fā)現(xiàn)存在疑似牛副結(jié)核病臨床病例，隨后對出現(xiàn)腹瀉、體況不佳的疑似病牛進(jìn)行了副結(jié)核病抗體檢測；確認(rèn)副結(jié)核病后，2014年3月對剩余680頭6月齡以上奶牛開展全群檢測；3個月后（2014年6月）采集了該牛場652份血液樣本進(jìn)行了再次復(fù)檢；該牛場對上述兩次抗體陽性牛均實施了淘汰處理。11個月后（2015年5月）和17個月后（2015年11月）分別采集543份、513份血液樣本開展第三次和第四次副結(jié)核的抗體檢測，分析淘汰處理對副結(jié)核病防控的效果（圖1）。

圖1 采集樣本的時間分布圖

1.2 檢測試劑盒

副結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒購自美國愛德士（IDEXX）公司，批號為4052、4166F。

1.3 樣本采集

通過尾根靜脈采集3～5mL奶牛血液樣本，在37℃培養(yǎng)箱中放置2～3h后于4℃冰箱過夜后分離血清；?？筂AP抗體檢測及結(jié)果判定方法按照試劑盒說明書方法操作。

1.4 結(jié)果統(tǒng)計與分析

本研究采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行組間差異的比較（卡方檢驗），采用PowerPoint和GraphPad prism 6軟件繪制研究結(jié)果分析圖。

2 研究結(jié)果

2.1 檢測結(jié)果

2014年2月-2015年11月，本研究從965頭奶牛血清樣本中累計檢測出297頭副結(jié)核病抗體陽性牛，累計檢出率為30.78%。其中，2014年2～3月從該牛場770頭6月齡以上奶牛中共檢出104份抗體陽性牛，檢出率為13.51%；在淘汰此次抗體陽性牛三個月后（第二次/2014.6）再次檢出19頭陽性牛，檢出率為2.91%；再次淘汰陽性牛，于11個月（第三次/2015.5）和17個月后（第四次/2015.11）分別檢測出陽性牛41頭和174頭，檢出率分別為7.55%和33.33%（表1）。

表1 牛副結(jié)核病抗體檢測結(jié)果

2.2 副結(jié)核抗體陽性牛的年齡分布特征

圖2 副結(jié)核病抗體陽性牛年齡分布圖

副結(jié)核抗體陽性牛在4～5歲的牛群中檢出率最高，第一次（2014.2-3）檢測時，在0.5～1和6～8歲年齡段中未檢出陽性牛，1～6歲年齡段中都有陽性牛檢出，1～5歲年齡段陽性檢出率隨年齡的增大而增加，5～6歲年齡段時檢出率陡然降低。將檢測結(jié)果數(shù)據(jù)合并，多次檢測樣本中陽性結(jié)果出現(xiàn)的第一次作為陽性牛的檢出年齡；連續(xù)4次抗體檢測仍為陰性的奶牛為MAP抗體陰性牛，其最后一次檢測的年齡作為實際年齡來分析該病的年齡分布（圖2合并數(shù)據(jù)）。數(shù)據(jù)合并后發(fā)現(xiàn)，0.5～1歲年齡段即出現(xiàn)抗體陽性牛，2～7歲年齡段中陽性檢出率均較高，且無太大差異。

2.3 檢測淘汰間隔時間對MAP控制的影響

如圖3所示，將4次奶牛全群檢測的檢出率進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)不同檢測淘汰間隔時間的檢出率差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），這說明淘汰抗體陽性牛的間隔時間對控制該病的流行具有一定影響。在副結(jié)核病嚴(yán)重流行的奶牛場開展該病的控制或凈化時，檢測和主動淘汰的間隔期設(shè)置為3個月時的控制效果優(yōu)于間隔11個月的，后者又優(yōu)于間隔17個月的控制效果，說明間隔時間越長對防控副結(jié)核病的擴(kuò)散流行更為不利。

圖3 淘汰副結(jié)核病牛的間隔時間對MAP檢出率的影響

3 討論

副結(jié)核病是影響奶牛養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的重要慢性傳染性疾病。該病的隱匿流行和間歇性發(fā)病，使得牛場獸醫(yī)和管理者極易忽視該病的存在。盡管有部分典型臨床特征病例的出現(xiàn)，但因缺乏有效的治愈手段，牛場獸醫(yī)只能暫時控制病牛的腹瀉癥狀，這些牛在治療后一段時間再次發(fā)病，最終死亡或者被主動淘汰。本文奶牛場的副結(jié)核病抗體陽性牛初次檢出率為13.51%，兩年累計檢出率高達(dá)30.78%，參考美國農(nóng)業(yè)部將牛群副結(jié)核病檢出率≥5%定義為“非常危險”的警示值[18]，說明該牛場的副結(jié)核病防控處于“失控”狀態(tài)。盡管該牛場對抗體陽性牛連續(xù)兩次實施了淘汰的處理措施，但可能因該牛場前期既往帶菌牛數(shù)量多，環(huán)境中MAP載量過大，此時處于0～6月齡階段的幼畜暴露于MAP的量相比以往更大，經(jīng)過近一年半的隱蔽期和/或亞臨床期后（2015年11月），處于該感染階段的奶牛逐漸轉(zhuǎn)入亞臨床期甚至臨床期，造成副結(jié)核病抗體檢出率的迅速升高，這些是造成第4次抗體檢測檢出率高的原因。

副結(jié)核病的疾病發(fā)展進(jìn)程顯示其存在典型的“冰山現(xiàn)象”，即：臨床后期（持續(xù)大量排菌、腹瀉、消瘦、抗體陽性）、臨床期（間接性排菌、抗體陽性）、亞臨床期（部分?？蓹z測到排菌和抗體）和隱蔽期（檢測不到排菌和抗體）呈現(xiàn)著1:1～2:4～8:10～14的結(jié)構(gòu)比例，發(fā)現(xiàn)1頭處于臨床后期的副結(jié)核病病牛，則表明有16～25頭帶菌感染牛[19]。同時，根據(jù)不同感染階段的結(jié)構(gòu)比例，預(yù)估牛場中帶菌病牛的數(shù)量是第一次檢出量的2～4倍。本文中的牛場，第一次檢測出104頭陽性牛，加上隨后20個月內(nèi)檢出的抗體陽性牛共計297頭，是第一次檢出量的2.86倍，這些理論和實際數(shù)據(jù)表明牛場管理人員必須重視牛場中的副結(jié)核病流行情況。

當(dāng)前，牛副結(jié)核病對養(yǎng)牛業(yè)的影響逐漸增大，也引起了相應(yīng)重視。然而，由于牛副結(jié)核病潛伏期較長、環(huán)境中存活時間較長，進(jìn)入臨床期及臨床后期病牛比例較低易被視為普通內(nèi)科病而被忽視；同時，無可用商品化疫苗，且現(xiàn)有診斷方法敏感性較差等因素，導(dǎo)致該病的防控一直是世界性的難題。國外經(jīng)驗表明[20]，如達(dá)到控制效果（陽性率＜5%）需至少采取5年的持續(xù)檢疫、淘汰、消毒等綜合處理措施。為協(xié)助規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場副結(jié)核病的防控和凈化，在本文數(shù)據(jù)和參考現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，制訂出牛群副結(jié)核病流行程度的劃分標(biāo)準(zhǔn)和處置方案（表2）。

表2 牛群副結(jié)核病流行程度劃分標(biāo)準(zhǔn)

同時，根據(jù)牛群副結(jié)核病流行情況建議按照以下檢疫方法和頻次進(jìn)行檢疫淘汰控制：①對于未控制群，采用血清學(xué)（牛乳和血清抗體檢測）和糞便病原學(xué)（熒光定量PCR檢測方法）檢測相結(jié)合的策略[1]，對1歲以上牛進(jìn)行血清抗體檢測；②對血清抗體檢測陰性牛和6月齡～1歲牛進(jìn)行病原學(xué)檢測，及時淘汰任何一種方法檢測出的陽性牛，遵循3～4次/年的檢疫淘汰頻次并實施至少一年，直至達(dá)到牛副結(jié)核病連續(xù)2次的檢出率控制在5%以內(nèi)（達(dá)到控制群標(biāo)準(zhǔn)）的要求。該階段的主要目的是減少臨床期和臨床后期病牛的數(shù)量從而降低排菌量，有效降低環(huán)境中MAP載量。

對于控制群，建議對1歲以上牛進(jìn)行血清學(xué)檢測，實行至少2次/年頻次的檢疫淘汰措施，將副結(jié)核病穩(wěn)定控制在3%以下（穩(wěn)定控制群）。如需對穩(wěn)定控制群進(jìn)行副結(jié)核病凈化，建議對1歲以上牛開展一年一次的血清學(xué)檢測，直至達(dá)到凈化群要求。對養(yǎng)殖場而言，除堅持檢疫淘汰措施外，必須輔助加強(qiáng)以下工作：①繁育過程中堅持母子及時分離，6月齡以下幼畜隔離飼養(yǎng)，對飼喂的常乳須經(jīng)巴氏殺菌處理；②加強(qiáng)日常衛(wèi)生管理，做到糞與水、飼草料分離（如提高飼草料采食的高度、安裝自動飲水器等），阻斷糞口傳播途徑。

此外，據(jù)2011-2013年的國內(nèi)外調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，牛副結(jié)核病在養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)和國家均較為嚴(yán)重[7～9]，新疆規(guī)模化奶牛場的MAP血清學(xué)陽性率也高達(dá)9.4%[17]，建議我國制訂國家或區(qū)域副結(jié)核病防控策略和規(guī)劃，加大支持早期診斷試劑盒和疫苗的研發(fā)，為牛副結(jié)核病的防控提供必要的技術(shù)支撐。

本研究的局限在于：①檢疫淘汰處理措施是牛場的自主行為，檢測和淘汰頻次難以控制；②僅采用抗體檢測手段作為檢疫淘汰牛的標(biāo)準(zhǔn)，未進(jìn)行糞便抗原檢測以排除間歇性排菌的病牛；③由于淘汰副結(jié)核病病牛的經(jīng)濟(jì)成本較高，牛場自身經(jīng)濟(jì)承受能力有限，因此僅開展了2次感染牛的淘汰處理措施，未達(dá)到預(yù)期的控制目標(biāo)。

4 結(jié)論

綜上所述，該牛場兩年時間內(nèi)副結(jié)核病累計檢出率高達(dá)30.78%，表明該牛場存在嚴(yán)重的牛副結(jié)核病流行，且發(fā)現(xiàn)4～5歲牛感染率最高；實施的不完全的控制措施顯示，較短間隔時間的檢疫淘汰措施對于控制MAP的流行擴(kuò)散可能有積極意義。在未來牛副結(jié)核病的防控實踐中，應(yīng)加強(qiáng)政府層面的防控規(guī)劃，篩選早期診斷生物標(biāo)志物以強(qiáng)化早期診斷，研發(fā)副結(jié)核病疫苗，加強(qiáng)糞便、污水和環(huán)境的消毒處理、盡早淘汰病牛并給予適當(dāng)?shù)慕?jīng)濟(jì)補(bǔ)貼，這對有效控制該病的擴(kuò)散蔓延具有重要的實踐意義。