陳興麟，李 麗，林河通

(1.自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門 361005; 2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

龍須菜(Gracilarialemaneiformis)是江蘺屬(Gracilaria)下的一個種。瓊膠是許多紅藻類植物合成的一種生物高聚物，是其細胞壁的主要成分[1]，在常溫環(huán)境下呈凝膠狀[2]。瓊膠及其他海藻細胞壁多糖具有的生理學(xué)功能與陸生植物的半纖維素類似，但具有更大的柔韌性，因此能耐受強烈的波浪和涌流[3-4]。細胞壁中的瓊膠不僅能幫助紅藻抵抗病菌侵染、干旱環(huán)境，維持細胞內(nèi)的離子平衡，還可以使紅藻能在更廣的溫度、鹽度和pH下生存[3, 5]。瓊膠寡糖的制備通常分為化學(xué)法和酶解法。化學(xué)法的降解條件不易控制、容易帶來環(huán)境污染，并且產(chǎn)物不均一。而酶解法制備瓊膠寡糖，反應(yīng)條件溫和、能耗低。因為酶催化具有專一性，能夠選擇性地切斷糖苷鍵，因此降解產(chǎn)物也較為均一[6]。瓊膠寡糖由于分子量較小，水溶性比瓊膠多糖好，更有利于人體吸收，并具有一些獨特的生理功能，例如，較強的抗氧化活性[7]、改善人體腸道菌群[8-9]等，具有很強的開發(fā)潛力。腸道菌群對人體的健康有重要的作用，雖然目前在界定有益菌和有害菌的界線上仍然存在爭議，但是乳酸菌Lactobacillus普遍認為是益生菌[10]，可以廣泛的應(yīng)用于食品工業(yè)，例如酸奶[11]、烘焙[12]和谷物制品[13]等。

微生物轉(zhuǎn)錄組是指微生物在某一時刻所轉(zhuǎn)錄出的所有RNA的總和，可以進一步揭示微生物在特定條件下基因的動態(tài)表達與調(diào)控[14]。通過比較微生物在不同環(huán)境、不同刺激物作用下轉(zhuǎn)錄組的差異，可以研究其基因表達的變化，進而研究環(huán)境及刺激物對微生物的影響及作用機理[15]。轉(zhuǎn)錄組通常以RNA-seq進行測序，即通過反轉(zhuǎn)錄酶將樣品中的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再通過構(gòu)建cDNA測序文庫進行測序，從而獲得相應(yīng)的RNA序列信息及表達量[16]。基因本體(gene ontology，GO)是一套國際標準化的基因功能描述的分類系統(tǒng)，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最成功的本體之一[17]。GO可分為三大類，即生物過程(biological process，BP)，分子功能(molecular function，MF)和細胞組分(cellular component，CC)，分別用來描述基因編碼的產(chǎn)物所參與的生物過程、所具有的分子功能及所處的細胞環(huán)境[18]。GO注釋是將一個基因和一個GO條目聯(lián)系起來，每個條目有唯一的標示符(由“GO：”加上7個數(shù)字組成)。目前，GO已經(jīng)廣泛應(yīng)用在基因集合富集分析、基因功能比較與分析、蛋白質(zhì)互作預(yù)測[19-20]和帕金森疾病的研究[21]等諸多領(lǐng)域。

福建省是中國龍須菜生產(chǎn)大省，龍須菜最主要的經(jīng)濟價值是提取瓊膠。而由瓊膠進一步降解而成的寡糖，具有更多的生理活性以及更高的價值。通過制備寡糖可以實現(xiàn)龍須菜產(chǎn)業(yè)鏈的高值化利用。本研究以深海瓊膠酶制備的海藻寡糖為試驗物，檢測其促乳酸菌Lactobacillusplantarum增長的效果，并通過對乳酸菌轉(zhuǎn)錄組的測序來研究其促生長機理，進一步拓展海藻寡糖的應(yīng)用領(lǐng)域，也為海洋生物制品在食品營養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

新瓊四糖(NA4)、新瓊六糖(NA6)由本課題組利用深海瓊膠酶，通過酶解瓊膠制備而成，純化后純度達95%以上；混合寡糖(NAOS)由本課題組以深海細菌Flammeovirgasp.OC4發(fā)酵龍須菜制得，為新瓊二糖、瓊膠三糖、新瓊四糖、瓊膠五糖、新瓊六糖的混合物；低聚果糖(FOS)購自成都艾科達化學(xué)試劑有限公司；低聚木糖(XOS)購自源葉生物科技有限公司；葡萄糖(GLC)購自Sigma公司；乳酸菌Lactobacillusplantarum由本課題組前期從酸奶中分離得到。

1.2 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基：Peptone 1%(質(zhì)量分數(shù)，下同)，Beef extract 0.8%，Yeast Extract 0.4%，葡萄糖 2%，K2HPO40.2%，檸檬酸二銨 0.2%，乙酸鈉 0.5%，MgSO40.002%，MnSO40.000 4%，Tween-80 0.01%。

2×MRS肉湯培養(yǎng)基：Peptone 2%，Beef extract 1.6%，Yeast Extract 0.8%，葡萄糖 4%，K2HPO40.4%，檸檬酸二銨 0.4%，乙酸鈉 1.0%，MgSO40.004%，MnSO40.000 8%，Tween-80 0.02%。

1.3 主要儀器及試劑盒

全自動生長曲線分析儀Bioscreen C(MBR, Oy Growth Curves Ab Ltd)；Total RNA Extractor(Trizol)試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；Epicenter Ribo-zero magnetic kit(bacteria)購自Epicenter公司；VAHTSTMmRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina?、VAHTSTMDNA Clean Beads購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 乳酸菌種子液的培養(yǎng) 將添加了1.5%瓊脂的MRS肉湯培養(yǎng)基于118 ℃滅菌15 min，然后制備MRS平板。將乳酸菌Lactobacillusplantarum在平板上劃線培養(yǎng)，取單菌落接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃搖培20 h，4 ℃保存待用。另外，取部分菌液，于100 ℃煮沸30 min，作為滅活菌體對照。

1.4.2 各種寡糖促乳酸菌增長的效果 Bioscreen C可裝載2個檢測板，每個檢測板有100個孔(10×10)，每個孔分別裝載100 μL的培養(yǎng)系統(tǒng)，包含：50 μL的滅菌2×MRS肉湯培養(yǎng)基，5 μL乳酸菌保存液(對照組為滅活液)，相應(yīng)濃度的各種寡糖和雙蒸水(double distilled water，ddw)。各寡糖液均提前經(jīng)過了0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，適量加入使體系終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L。如表1所示，101～200號在第一個檢測板上，201～224號在第二個檢測板上。根據(jù)加入寡糖種類的不同，一共可以分為7個組。第一組(101～120號)添加的寡糖為NAOS。第二組(121～140號)和第三組(141～160號)添加的寡糖分別為NA4和NA6。第四組(161～180號)、第五組(181～200號)、第六組(201～220號)添加的寡糖分別為FOS、XOS和GLC。第七組(221～224號)為對照組，不額外添加任何寡糖。兩個檢測板同時放入全自動生長曲線分析儀(Bioscreen C)中，37 ℃水平搖培48 h，每2 h采集一次OD600值數(shù)據(jù)。

表1 乳酸菌Lactobacillus plantarum生長速率實驗設(shè)計

續(xù)表1

注：“*”表示空白對照：加入滅活菌體；“**”表示陰性對照：加入適量ddw替代寡糖液。

1.4.3 乳酸菌RNA的提取 如表2所示，設(shè)置5個處理組，每組2個重復(fù)，分別為：4H組，添加NA4至終濃度為0.6 g/L；6H組，添加NA6至終濃度為0.6 g/L；4L組，添加NA4至終濃度為0.2 g/L；6L組，添加NA6至終濃度為0.2 g/L；C組，不添加寡糖。分別取500 μL乳酸菌種子液，12 100 r/min離心去除上清，然后用100 μL ddw重懸菌體后，吸取100 μL菌液加入裝有5 mL培養(yǎng)基的試管中，37 ℃搖培12 h。空白組添加等量的100 μL ddw。待搖培結(jié)束后，馬上收集菌體，用Total RNA Extractor(Trizol)試劑盒提取RNA。

表2 Lactobacillus plantarum的培養(yǎng)條件及分組情況

1.4.4 乳酸菌轉(zhuǎn)錄組的測序與分析 依次用Epicenter Ribo-zero magnetic kit(bacteria)試劑盒純化RNA，用VAHTSTMmRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina?試劑盒構(gòu)建測序文庫，將構(gòu)建好的文庫在Illumina HiSeq X-ten測序平臺完成測序，測序模式為2×150 bp雙端測序。將測序儀得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，通過CASAVA堿基識別(base calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列(sequenced reads)，即為Raw Data，以 FASTQ文件格式存儲。對測序數(shù)據(jù)質(zhì)量進行可視化評估，并使用Trimmomatic進行數(shù)據(jù)處理，依次去除帶N堿基的序列、reads中的接頭序列、Q值<20的低質(zhì)堿基。為避免測序產(chǎn)物為污染，隨機從Clean數(shù)據(jù)中抽取不低于9 800條序列與NCBI的NT數(shù)據(jù)庫進行blastn比對，計算其物種分布。若與原始樣品一致，則進行基因結(jié)構(gòu)、表達水平、表達差異等分析，并進一步將差異表達基因進行GO功能分類。

2 結(jié)果與討論

2.1 各種寡糖促乳酸菌增長的效果

如圖1a所示，OD600值隨著NA4、FOS、NA6、NAOS、XOS和GLC濃度的升高而升高，達到最高值后，再提高濃度會導(dǎo)致OD600值的降低，此結(jié)果與Lu等(2015)的研究結(jié)果相似[22]。這可能是由于過高的寡糖濃度會產(chǎn)生較高的滲透壓，從而導(dǎo)致脫水作用而抑制菌株生長。不同寡糖的最適作用濃度并不一致，因此本研究均選取促乳酸菌增長效果最為顯著的濃度進行進一步分析，即0.4 g/L的GLC，0.8 g/L的NAOS，以及0.6 g/L的NA4、NA6、FOS、XOS。在各自的最適濃度下進行比較，促乳酸菌增長效果最好的依次是NA4、FOS、NA6、NAOS、XOS、GLC，它們效果都好于對照組(圖1b)。由于MRS肉湯培養(yǎng)基中已經(jīng)含有GLC，額外的添加量產(chǎn)生的促生長效果有限。而其余各種寡糖顯示了更好的促乳酸菌增長效果，說明不同的寡糖之間存在著協(xié)同增效作用。FOS被認為是一種重要的益生元，但在相同濃度下，NA4有著更好的促增長效果，說明NA4有進一步作為健康食品的應(yīng)用潛力。

為了比較不同種類寡糖的促增長作用，通常需要先確定各自寡糖的最適作用濃度。根據(jù)傳統(tǒng)方法，通常是比較一段時間內(nèi)的OD600值的高低，選取數(shù)值高的濃度為合適的作用濃度[22]。但這不夠嚴謹。如圖1b所示，盡管在48 h時XOS和GLC組的OD600值一致，但從整體生長曲線上看XOS卻是更好的生長促進劑。值得注意的還有，在不同實驗組中達到OD600值最高點的時間并不一致，如FOS組用了26 h，而NA4組只需要20 h。因此，最優(yōu)選濃度應(yīng)該是通過測定不同組別生長曲線的最高點來確定。本實驗中，通過Bioscreen C每2 h測定一次OD600值，同時篩選124組不同條件下乳酸菌的生長曲線，從而盡可能的消減誤差值。相比于傳統(tǒng)的搖瓶或試管培養(yǎng)，此方法所需的寡糖用量很小，可以在不進行大規(guī)模純化的情況下研究寡糖促乳酸菌的增長效果。

圖1 寡糖促乳酸菌Lactobacillus plantarum的增長效果

2.2 乳酸菌RNA的提取

由于相比于NAOS，NA4和NA6成分單一、促乳酸菌增長的效果較好。而相比于FOS及XOS，其相關(guān)研究較少。故選取NA4和NA6做進一步研究。設(shè)置了4H組，它的NA4濃度為促乳酸菌生長效果最好的0.6 g/L。設(shè)置了6H組，它的NA6濃度也為促乳酸菌生長效果最好的0.6 g/L，以及4L組和6L組，處于三分之一的最適濃度下。在試管中培養(yǎng)12 h后，提取各自乳酸菌RNA。如圖2所示，提取的Total RNA條帶清晰，且大部分集中在1 000 bp以下的區(qū)域，符合后續(xù)實驗的要求。

圖2 乳酸菌Lactobacillus plantarum的RNA提取

2.3 RNA-seq測序數(shù)據(jù)分析

本次實驗中，每一組高通量測序獲得的原始測序總數(shù)據(jù)量都在4.55 Gb以上，其中堿基質(zhì)量值在Q10(識別正確率為90%)的比例均在99.93%以上，質(zhì)量值在Q30(識別正確率為99.9%)的比例也都高于94.39%。經(jīng)過一系列嚴格的校正和過濾后，各組得到的高質(zhì)量reads數(shù)在3 098萬條與3 949萬條之間，平均讀長在145 bp以上。經(jīng)校正后的各組數(shù)據(jù)堿基質(zhì)量值在Q10的比例均達到99.99%以上，Q30的比例也都在97.23%以上。各組的GC含量相對一致，都在45.07%與45.66%之間，符合物種內(nèi)GC含量相對一致的規(guī)律。綜上所述，本次高通量測序的數(shù)據(jù)在測序深度和準確度上符合做進一步分析的要求。

為進一步確認樣品無污染，隨機從高質(zhì)量數(shù)據(jù)中抽取不低于9 800條序列進行比對分析，比對結(jié)果如表3所示。從表中可以看出，各組之間的序列的比對結(jié)果較為一致，序列比對上的前7個物種分別是Lactobacillusplantarum，Lactobacilluspentosus，Lactobacillusparacasei，Lactobacillusbuchneri，Lactobacillusphage，Lactobacillushelveticus，Lactobacillusparaplantarum，都是乳桿菌屬。其中，97%以上的序列比對結(jié)果為Lactobacillusplantarum，與實驗室前期菌株鑒定結(jié)果一致，說明檢測結(jié)果符合預(yù)期。

2.4 主成分分析

主成分分析(principal component analysis, PCA)被廣泛用于處理多維度的基因表達數(shù)據(jù)[23]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，海量的組學(xué)數(shù)據(jù)越來越多的出現(xiàn)，需要使用PCA對數(shù)據(jù)進行降維處理，使結(jié)果可視化，更好的闡明其生物學(xué)機理[24]。為對各組樣品的表達情況做一整體分析，采用PCA方法對其進行可視化處理(圖3)。如圖所示，除了4L1和4L2組內(nèi)差異較大，其他的各組都按照其生物學(xué)重復(fù)聚集至相對較近的位置，說明試驗重復(fù)性較好。各組之間分散至立方體的不同位置，說明寡糖的添加確實對其生理代謝產(chǎn)生了一定的影響。

表3 不同實驗組序列的blastn比對結(jié)果

圖3 各樣本主成分分析

2.5 組間差異表達基因分析

基因表達水平的直接體現(xiàn)就是其轉(zhuǎn)錄的豐度情況，轉(zhuǎn)錄的豐度越高，則基因表達水平越高[25]。在RNA-seq分析中，我們可以通過定位到基因組區(qū)域或基因外顯子區(qū)的測序序列(reads)的計數(shù)來估計基因的表達水平。Reads計數(shù)除了與基因的真實表達水平成正比外，還與基因的長度和測序深度成正相關(guān)。為了使不同實驗組、不同基因之間的基因表達水平具有可比性，需要對各基因的表達情況進行標準化[26-27]。有研究表明，一些數(shù)據(jù)標準化方法，如RPKM等，反而使誤差加大，從而對診斷的結(jié)果產(chǎn)生不利影響[28]。目前，許多研究采用TPM(transcripts per million)來計量在RNA池中某個基因轉(zhuǎn)錄的比例[29]。TPM同時考慮了測序深度和基因長度以及不同樣本對reads計數(shù)的影響，是常用的基因表達水平估算方法。TPM計算公式[30]如下：

(1)

(2)

式(1、2)中：gl為基因外顯子長度(gene length)，readl為引入的均一化長度值(默認為1 000)，nr為比對到該基因上的序列數(shù)(number of reads)，G為求和符號的上界，即所有基因，T為求和值。

為了揭示不同處理對乳酸菌的基因表達的影響，利用DEGseq軟件分析不同處理組(TPM-E)和對照組(TPM-C)樣本間的差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)。篩選的差異表達基因必須達到以下2個要求：(i)log2(TPM-E/TPM-C)>1，即差異表達倍數(shù)至少為2倍；(ii)pValue<0.05。在本研究中，我們把在各處理組上調(diào)表達的基因定義為“上調(diào)基因”，相反地，在各處理組下調(diào)表達的基因即為“下調(diào)基因”。

如圖4所示，4L組對比C組，有13個基因表達上調(diào)，22個基因表達下調(diào)。而隨著NA4濃度的增高，4H組比C組，表達上調(diào)的基因增加至27個，表達下調(diào)的基因增加至28個。這說明隨著NA4濃度增加至最適促生長濃度，其對乳酸菌Lactobacillusplantarum的生理代謝產(chǎn)生的影響逐步加大。而6L組和6H組也呈現(xiàn)出類似的趨勢。6L組對比C組，有2個基因表達上調(diào)，12個基因表達下調(diào)。當NA6的濃度增加到0.6 g/L，表達上調(diào)的基因增加至18個，表達下調(diào)的基因仍為12個。如果NA4和NA6對比，NA4帶給乳酸菌生理的影響更大，當我們比較相同濃度下乳酸菌的代謝情況時發(fā)現(xiàn)，濃度為0.2 g/L時，4L組比6L組，上調(diào)基因有9個，下調(diào)基因有1個。這可能是因為NA4分子量小，更容易被乳酸菌吸收。因此，這和前述實驗檢測的乳酸菌生長曲線，NA4有較好的促生長能力規(guī)律一致。

圖4 不同組之間差異表達基因統(tǒng)計

2.6 差異表達基因的功能注釋

2.6.1 4H組差異表達基因的注釋 在對篩選出的DEGs相應(yīng)蛋白進行GO功能注釋分析中，利用topGO完成GO富集分析并繪制顯著性GO有向無環(huán)圖。GO分析結(jié)果顯示，在55個DEGs中，有31個基因至少能關(guān)聯(lián)到MF的一個GO功能條目，有24個基因至少能關(guān)聯(lián)到CC的一個GO功能條目，以及27個基因至少能關(guān)聯(lián)到BP的一個GO功能條目?；贕O二級分類的功能分類，已注釋的差異表達基因可以劃分為19個二級小類(圖5)，它們隸屬于BP、MF及CC這三個分支。在MF中，基因數(shù)目最多的類別是“催化活性”(catalytic activity)，該分類包括了22個差異表達基因，其次是“結(jié)合作用”(binding)，其包含了17個差異表達基因，排在第三位的是“轉(zhuǎn)運活性”(transporter activity)，共有9個DEGs；在CC分支中，細胞相關(guān)組分(cell，cell part)和細胞膜組分(membrane)是DEGs對應(yīng)的蛋白活動的兩大主要場所；在BP分支中，“細胞內(nèi)過程”(cellular process)、“代謝過程”(metabolic process)和“單組織過程”(single-organism process)這三個類別所占比例最多。

圖5 4H組和C組轉(zhuǎn)錄組間差異表達基因的GO二級分類統(tǒng)計

2.6.2 6H組差異表達基因的注釋 GO分析結(jié)果顯示，在30個差異表達基因中，有16個基因至少能關(guān)聯(lián)到MF的一個GO功能條目，有17個基因至少能關(guān)聯(lián)到CC的一個GO功能條目，以及15個基因至少能關(guān)聯(lián)到BP的一個GO功能條目。基于GO二級分類的功能分類，已注釋的DEGs可以劃分為17個二級小類(圖6)，它們隸屬于BP、MF及CC這3個分支。在MF分支中，基因數(shù)目最多的類別是“催化活性”(catalytic activity)，該分類包括了13個DEGs，其次是“結(jié)合作用”(binding)，其包含了10個DEGs，排在第三位的是“轉(zhuǎn)運活性”(transporter activity)，共有6個DEGs；在CC分支中，細胞相關(guān)組分(cell，cell part)和細胞膜組分(membrane)是DEGs對應(yīng)的蛋白活動的兩大主要場所；在BP分支中，“細胞內(nèi)過程”(cellular process)、“代謝過程”(metabolic process)和“單組織過程”(single-organism process)這3個類別所占比例最多。

2.6.3 4L組差異表達基因的注釋 GO分析結(jié)果顯示，在35個DEGs中，有25個基因至少能關(guān)聯(lián)到MF的一個GO功能條目，有21個基因至少能關(guān)聯(lián)到CC的一個GO功能條目，以及21個基因至少能關(guān)聯(lián)到BP的一個GO功能條目。基于GO二級分類的功能分類，已注釋的DEGs可以劃分為21個二級小類(圖7)，它們隸屬于BP、MF及CC這3個分支。在MF分支中，基因數(shù)目最多的類別是“結(jié)合作用”(binding)，其包含了18個DEGs，其次是“催化活性”(catalytic activity)，該分類包括了14個DEGs，排在第三位的是“結(jié)構(gòu)分子活性”(structural molecule activity)，共有6個DEGs；在CC分支中，細胞相關(guān)組分(cell，cell part)和細胞膜組分(membrane)是DEGs對應(yīng)的蛋白活動的兩大主要場所；在BP分支中，“細胞內(nèi)過程”(cellular process)、“代謝過程”(metabolic process)和“單組織過程”(single-organism process)這3個類別所占比例最多。

圖6 6H組和C組轉(zhuǎn)錄組間差異表達基因的GO二級分類統(tǒng)計

圖7 4L組和C組轉(zhuǎn)錄組間差異表達基因的GO二級分類統(tǒng)計

2.6.4 6L組差異表達基因的注釋 GO分析結(jié)果顯示，在14個DEGs中，有8個基因至少能關(guān)聯(lián)到MF的一個GO功能條目，有6個基因至少能關(guān)聯(lián)到CC的一個GO功能條目，以及5個基因至少能關(guān)聯(lián)到BP的一個GO功能條目?；贕O二級分類的功能分類，已注釋的DEGs可以劃分為17個二級小類(圖8)，它們隸屬于BP、MF及CC這三個分支。在MF分支中，基因數(shù)目最多的類別是“結(jié)合作用”(binding)，其包含了6個DEGs，其次是“催化活性”(catalytic activity)，該分類包括了4個DEGs，排在第三位的是“結(jié)構(gòu)分子活性”(structural molecule activity)，共有3個DEGs；在CC分支中，細胞相關(guān)組分(cell，cell part)和細胞膜組分(membrane)等是DEGs對應(yīng)的蛋白活動的兩大主要場所；在BP中，“細胞內(nèi)過程”(cellular process)、“代謝過程”(metabolic process)和“單組織過程”(single-organism process)這三個類別所占比例最多。

圖8 6L組和C組轉(zhuǎn)錄組間差異表達基因的GO二級分類統(tǒng)計

2.6.5 討論 從各組DEGs的GO注釋結(jié)果來看，有著極大的相似性。在CC分支中，各組注釋到的最相關(guān)條目均為“細胞相關(guān)組分”和“細胞膜組分”；在BP分支中，各組注釋到的最相關(guān)條目均為“細胞內(nèi)過程”、“代謝過程”、“單組織過程”。而在MF分支中，發(fā)現(xiàn)當處于最佳促生長的寡糖濃度時(即4H組和6H組)，DEGs數(shù)目最多的類別依次為“催化活性”、“結(jié)合作用”、“轉(zhuǎn)運活性”；而當寡糖濃度較低時(即4L組和6L組)，DEGs數(shù)目最多的類別則變?yōu)椤敖Y(jié)合作用”、“催化活性”、“結(jié)構(gòu)分子活性”。說明NA4和NA6在促乳酸菌生長的作用機理上有很大的相似性，對其影響最大的是“結(jié)合作用”以及“催化活性”。Lactobacillusplantarum在利用各類碳源時，乳酸菌中一些分解代謝物的蛋白與基因模塊的結(jié)合起著重要的作用，例如，在FOS的利用中，LacI-GalR蛋白家族的Ccp A與基因位點cre的結(jié)合起了重要的調(diào)節(jié)作用[31]。而在利用多種碳源時，添加的寡糖會誘導(dǎo)乳酸菌先合成相關(guān)的催化酶[32]，因此與“催化活性”相關(guān)的基因呈現(xiàn)上調(diào)表達。同時，當NA4和NA6濃度升高時，對細胞內(nèi)的“轉(zhuǎn)運活性”有更高的影響，將進一步通過基因敲除手段驗證其作用機理。

3 結(jié)論

(1)通過全自動生長曲線分析儀篩選出乳酸菌Lactobacillusplantarum對各種寡糖的最適應(yīng)用濃度，其中，GLC的最適應(yīng)用濃度為0.4 g/L，NAOS為0.8 g/L，NA4、NA6、FOS、XOS均為0.6 g/L。

(2)在各個寡糖的最適濃度下，促乳酸菌增長的效果最好的依次是NA4、FOS、NA6、NAOS、XOS、GLC。

(3)完成了10組乳酸菌轉(zhuǎn)錄組測序，通過對差異表達基因的比較分析及GO注釋，發(fā)現(xiàn)NA4和NA6在促乳酸菌生長的作用機理上有很大的相似性，對其影響最大的是“結(jié)合作用”以及“催化活性”。當寡糖濃度升高時對細胞內(nèi)的“轉(zhuǎn)運活性”有更高的影響。