曾 臻，倪健斌，譚強(qiáng)來(lái)，史 博，余美舜，李偉杰，蔡 廣

(1.廈門醫(yī)學(xué)院海洋生物醫(yī)藥資源福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361023；2.廈門醫(yī)學(xué)院天然化妝品福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361023；3.廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361102；4.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361023)

福建牡蠣(Crassostreaangulata)是福建沿海最重要的養(yǎng)殖貝類，其養(yǎng)殖產(chǎn)量居于貝類養(yǎng)殖中的第一位，對(duì)生殖調(diào)控的研究在福建牡蠣養(yǎng)殖中具有重要的意義[1]?，F(xiàn)代內(nèi)分泌學(xué)認(rèn)為激素是細(xì)胞與細(xì)胞之間傳遞信息的化學(xué)信號(hào)物質(zhì)，其中性腺激素是參與貝類生殖活動(dòng)的重要激素。然而目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)貝類生殖內(nèi)分泌的研究卻十分有限。

類固醇激素是最主要的一類性腺激素，包括雄激素、雌激素和孕酮等。目前有關(guān)貝類中類固醇激素合成和代謝機(jī)制的研究較少，而且比較零散。研究發(fā)現(xiàn)，貝類中類固醇激素合成的底物與脊椎動(dòng)物同樣是膽固醇和孕烯醇酮[2-3]。這些性類固醇激素參與了貝類的生殖調(diào)控，在貝類的性腺發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。然而，關(guān)于類固醇激素在貝類中是如何發(fā)揮作用的還不甚清楚。

17β-羥基類固醇脫氫酶(17β-Hydroxysteroid dehydrogenase，17β-HSD)作用在類固醇激素合成的最后一步及之后代謝過(guò)程的起始階段，它能夠還原17-酮類固醇或者氧化17β-羥基類固醇，可以催化雄烯二醇和睪酮、雌酮和雌二醇、雄烯二酮和二氫睪酮之間的相互轉(zhuǎn)化。對(duì)于脊椎動(dòng)物來(lái)說(shuō)，只有17β-羥基化的雄激素和雌激素才具有生物活性，而17β-酮基化的則沒(méi)有[4]。之前的研究結(jié)果表明，在貽貝、牡蠣、蛤等貝類性腺和消化腺組織中能夠檢測(cè)到17β-HSD的活性，它具有跟脊椎動(dòng)物17β-HSD類似的生物學(xué)功能[5]；Matsumoto等(1997)還發(fā)現(xiàn)扇貝(Placopectenmagellanicus)體內(nèi)17β-HSD的活性在生殖周期的不同時(shí)段呈現(xiàn)規(guī)律性變化，即隨著性腺的發(fā)育逐漸升高，而在排卵后又明顯降低，這說(shuō)明其可能參與了扇貝性腺發(fā)育的調(diào)控過(guò)程[5]。

本研究擬通過(guò)對(duì)福建牡蠣類固醇激素合成相關(guān)酶的基因17β-HSD進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能探究，結(jié)合其時(shí)空表達(dá)特征及在性腺細(xì)胞中的定位，為闡明牡蠣類固醇激素的合成機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究牡蠣生殖內(nèi)分泌機(jī)理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用福建牡蠣購(gòu)自福建省漳州市斗美村漁排，總重為3.8～14.0 g。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察[6]，將所采樣品分為增殖期、生長(zhǎng)期、繁殖期和排放期4個(gè)階段，選取每個(gè)時(shí)期15只雄性和15只雌性作為本研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。取每個(gè)時(shí)期牡蠣不同組織(性腺、閉殼肌、外套膜、鰓、內(nèi)臟團(tuán))放入液氮中速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用，同時(shí)取一小塊成熟期性腺組織固定于4%多聚甲醛溶液中。

1.2 RNA提取

按照試劑使用說(shuō)明書(shū)，將樣品置于Trizol?Reagent(Invitrogen, USA)分別勻漿，分別提取不同組織總RNA，通過(guò)Nanodrop ND-2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，結(jié)合1%的變性瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)其完整性。

1.3 17β-HSD 基因cDNA全長(zhǎng)序列的克隆

將所得的RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TIANGEN，China)步驟分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。按照Full-RACE Core Set Ver.2.0 試劑盒(TAKARA, China)要求，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的福建牡蠣轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中篩選獲得的17β-HSD基因的序列片段，分別設(shè)計(jì)并合成5′和3′ RACE特異性引物(表1)，對(duì)17β-HSD基因進(jìn)行5′和3′ RACE擴(kuò)增，并送廣州英韋創(chuàng)津(Invitrogen)生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序分析。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

根據(jù)QuantacDNA 第一鏈合成試劑盒(TIANGEN, China)的說(shuō)明書(shū)合成cDNA 第一條鏈。以cDNA第一條鏈為模板，以牡蠣Elongationfactor1α基因(EF1α, GenBank accession no.BQ426516)作為內(nèi)參基因[6]，運(yùn)用SYBR GreenⅠ染料法在ABI 7500 fast system real-time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, USA)上定量分析不同時(shí)期牡蠣17β-HSD基因的mRNA表達(dá)變化。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置5個(gè)平行樣，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。每輪反應(yīng)均設(shè)有cDNA實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)所使用的試劑盒為SYBR Green qPCR Kit(Thermo,USA)，反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95 ℃ 10 min; 95 ℃ 20 s, 52 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)每個(gè)基因的熔解曲線進(jìn)行分析。

所得數(shù)據(jù)用ABI 7500 system SDS 軟件(version 1.4, Applied Biosystems)進(jìn)行分析，用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量[7-8]。

1.5 原位雜交

基于所獲的17β-HSD基因序列，設(shè)計(jì)雜交探針的引物(表1)，參考Ni等(2013)的方法對(duì)固定于4%多聚甲醛溶液中(4 ℃固定過(guò)夜)的性腺組織進(jìn)行原位雜交[9]。

1.6 目的基因的生物信息學(xué)分析

用BLAST軟件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列同源性比對(duì)；用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)拼接，得到基因的全長(zhǎng)序列；用Compute pI/Mw tool(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)等電點(diǎn)和分子量；用SignalP 3.0 軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)尋找信號(hào)肽；用TMHMM軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；用Predict Protein 軟件(http://www.predictprotein.org/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域；用CLUSTALX軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)；用MEGA 4.0軟件中的鄰接法(1 000 bootstrap replicates)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 福建牡蠣17β-HSD基因的序列全長(zhǎng)及特征

如圖1，福建牡蠣17β-HSD基因(ca17β-HSD)cDNA全長(zhǎng)1 149 bp，包括45 bp的5′-UTR(5′-Untranslated Region)，183 bp的3′-UTR和921 bp的ORF(Open Reading Frame)。序列3′-UTR中存在典型的poly A加尾信號(hào)AATAAA。ca17β-HSD基因可編碼307個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為34.084 kDa，等電點(diǎn)為8.58。SignalP和TMHMM軟件預(yù)測(cè)ca17β-HSD氨基酸序列具有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)和1個(gè)信號(hào)肽，分別位于AA10—AA32和AA1—AA20。第AA44—AA283為ca17β-HSD氨基酸序列保守的氧化還原酶功能結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包括1個(gè)酶活性中心YSSSK(AA191—AA195)、1個(gè)輔酶結(jié)合位點(diǎn)TG***G*G(AA48—AA55)和1個(gè)結(jié)構(gòu)性保守序列NNAG(AA125—AA128)。

圖1 福建牡蠣17β-HSD基因的核酸序列和氨基酸序列

2.2 福建牡蠣17β-HSD基因的同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)過(guò)序列多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ca17β-HSD氨基酸序列屬于17β-HSD11亞型，它與太平洋牡蠣(Crassostreagigas)和雜色鮑(Haliotisdiversicolor)17β-HSD11亞型的氨基酸序列相似性分別為99%和57%，與脊索動(dòng)物17β-HSD11亞型的氨基酸序列相似性為45%，與其他脊椎動(dòng)物17β-HSD11亞型的氨基酸序列相似性為40%～44%(圖2)。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，我們發(fā)現(xiàn)所選取的不同物種的17β-HSD氨基酸序列可以分為三個(gè)亞型，分別是17β-HSD11亞型、17β-HSD12亞型和17β-HSD4亞型，其中17β-HSD11亞型和17β-HSD12亞型親緣性更高。在17β-HSD11亞型中，ca17β-HSD11先與太平洋牡蠣17β-HSD11聚為一枝，再與同為貝類的雜色鮑17β-HSD11聚類，接著再依次與脊索動(dòng)物和其他脊椎動(dòng)物聚類(圖3)。

圖2 福建牡蠣及其他物種17β-HSD氨基酸序列的多重比對(duì)

圖2、3中各物種17β-HSD氨基酸序列在NCBI上的登錄號(hào)如下：太平洋牡蠣(Crassostreagigas)11, EKC30097.1; 雜色鮑(Haliotisdiversicolor)11, ADV02385.1; 柱頭蟲(chóng)(Saccoglossuskowalevskii)11, XP_002732320.1;非洲爪蟾(Xenopustropicalis)11, NP_001011240.1; 原鴿(Columbalivia)11, EMC85029; 家鼠(Musmusculus)11, NM_053262.3; 牦牛(Bosgrunniensmutus)12, ELR49992; 鴨嘴獸(Ornithorhynchusanatinus)12, XP_001509870; 紅原雞(Gallusgallus)12, XP_426310.2; 斑馬魚(yú)(Daniorerio)12, NM_200881; 雜色鮑(Haliotisdiversicolor)12, ADF80270.1; 狗巖螺(Nucellalapillus)12, JX625140.1; 馬(Equuscaballus)12, XP_001488432; 綿羊(Ovisaries)12, XP_004016470; 柱頭蟲(chóng)(Saccoglossuskowalevskii)12, XP_002733503; 智人(Homosapiens)12, NP_057226.1; 野豬(Susscrofa)12, BAI47714; 紫海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)12, XP_798337; 斑馬魚(yú)(Daniorerio)4, AAK27967; 河鱒(Salmotruttafario)4, ACN66287; 櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)4, AGC26171; 底鳉(Fundulusheteroclitus)4, BAF74749; 家鼠(Musmusculus)4,CAA62015。

2.3 福建牡蠣17β-HSD基因在不同組織中的表達(dá)

如圖4所示，在福建牡蠣性腺、外套膜、鰓、閉殼肌和內(nèi)臟團(tuán)等組織中均能檢測(cè)到17β-HSD基因的表達(dá)，其中性腺的表達(dá)量最高(p<0.05)，其次為內(nèi)臟團(tuán)，而17β-HSD基因在鰓、外套膜、閉殼肌中的表達(dá)量差異不顯著(p>0.05)。

2.4 福建牡蠣17β-HSD基因在生殖周期中的表達(dá)模式

圖5反映了當(dāng)性腺開(kāi)始發(fā)育后，福建牡蠣性腺中17β-HSD基因的表達(dá)量開(kāi)始下降(p<0.05)，在性腺發(fā)育的生長(zhǎng)期和成熟期，其表達(dá)量均維持在一個(gè)較低的水平。而在配子排放后，性腺中17β-HSD基因的表達(dá)量反而急劇升高，達(dá)到成熟期表達(dá)量的3倍之多(p<0.05)。

圖3 17β-HSD在福建牡蠣和其他物種間的進(jìn)化分析

圖4 17β-HSD基因在福建牡蠣各組織中的表達(dá)

圖5 17β-HSD基因在福建牡蠣性腺不同發(fā)育階段的表達(dá)

圖6 福建牡蠣17β-HSD基因在成熟卵巢中的分布

2.5 福建牡蠣17β-HSD基因在卵巢中的細(xì)胞定位

結(jié)果顯示17β-HSD基因在福建牡蠣卵巢中呈現(xiàn)出細(xì)胞定位。能與DIG標(biāo)記的17β-HSD基因的反義RNA探針雜交，顯色后呈藍(lán)黑顏色的陽(yáng)性信號(hào)主要分布在卵細(xì)胞周邊的個(gè)體小的濾泡細(xì)胞上，而在成熟卵細(xì)胞上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有陽(yáng)性信號(hào)(圖6)，這說(shuō)明17β-HSD基因均主要表達(dá)在福建牡蠣卵巢組織的濾泡細(xì)胞中。

2.6 討論

17β-HSD是性類固醇激素合成過(guò)程最后步驟中的催化酶，它以NADH/NADPH為輔基，通過(guò)催化性類固醇激素C17位上的醇基和酮基之間的氧化還原反應(yīng)，使低生物活性的雌酮、雄烯二酮與高生物活性的雌二醇、睪酮之間進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化[4]。脊椎動(dòng)物17β-HSDs大都數(shù)均屬于短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)超家族，其中2、4、6、8、9、10、11、14亞型為氧化酶，1、3、5、7、12亞型是還原酶。已有的研究表明，貽貝、牡蠣、蛤等貝類性腺和消化腺中均存在17β-HSD的活性，它們具有跟脊椎動(dòng)物中17β-HSD類似的生物學(xué)功能[5,10-12]。Matsumoto等(1997)還發(fā)現(xiàn)扇貝體內(nèi)17β-HSD的活性變化與生殖過(guò)程顯著相關(guān)，生長(zhǎng)期性腺中17β-HSD的活性約是排卵后的2倍[5]。此外，目前已有研究者成功獲得了狗巖螺(Nucellalapillus)[13]、雜色鮑[14-15]和櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[16]的17β-HSD基因序列全長(zhǎng)，并研究了其在不同性別及性腺發(fā)育不同階段的表達(dá)模式，結(jié)果表明17β-HSD在貝類的性腺發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。其中有研究者通過(guò)基因克隆和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法在雜色鮑中鑒定到兩種有活性的17β-HSD亞型，其中一種是17β-HSD12，它是一種還原酶，能將雌酮轉(zhuǎn)化為雌二醇，增加雌激素的活性，雜色鮑生殖周期中，17β-HSD12的表達(dá)量隨著性腺的發(fā)育逐步升高，催化了雌酮向雌二醇的轉(zhuǎn)化，從而提高了雌二醇的水平，有助于性腺的發(fā)育[14]；另一種亞型是17β-HSD11，它是一種氧化酶，能將睪酮氧化為雄烯二酮，可以降低雄激素的活性[15]。本實(shí)驗(yàn)用RACE的方法首次獲得了福建牡蠣17β-HSD基因的cDNA全長(zhǎng)序列，它們具有17β-HSDs家族基因保守的結(jié)構(gòu)特征，如Rossman折疊結(jié)構(gòu)、輔酶結(jié)合位點(diǎn)和催化活性位點(diǎn)等[17]。氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果顯示，福建牡蠣17β-HSD屬于11亞型，與其他物種的氨基酸序列具有較高的同源性。QRT-PCR的結(jié)果表明，福建牡蠣性腺中17β-HSD基因的表達(dá)量高于其他組織，原位雜交的結(jié)果進(jìn)一步顯示17β-HSD基因主要表達(dá)在卵巢的濾泡細(xì)胞上。本研究還發(fā)現(xiàn)，福建牡蠣性腺中17β-HSD的表達(dá)量高低與性腺發(fā)育階段密切相關(guān)，但其變化趨勢(shì)卻與性類固醇激素含量相反。我們推測(cè)這可能是由于其屬于11亞型，主要起氧化酶的作用。在福建牡蠣性腺成熟前，該基因的表達(dá)量較低，氧化作用弱，雌激素和雄激素更多地以有活性的雌二醇和睪酮的形式存在，以便促進(jìn)性腺的進(jìn)一步發(fā)育，而當(dāng)配子排放后性腺發(fā)育暫停，17β-HSD11基因的表達(dá)量顯著提高，使得雌二醇和睪酮被轉(zhuǎn)化為雌酮和雄烯二酮，導(dǎo)致雌二醇和睪酮的含量顯著下降。Matsumoto等用放射性同位素標(biāo)記的方法發(fā)現(xiàn)太平洋牡蠣中17β-HSD將雌二醇轉(zhuǎn)化為雌酮的活性顯著高于將雌酮轉(zhuǎn)化為雌二醇的活性[5]，這也佐證了我們之前的假設(shè)。此外，本次研究還發(fā)現(xiàn)，除性腺外，17β-HSD基因在福建牡蠣其他組織中(包括外套膜、鰓、閉殼肌和內(nèi)臟團(tuán))也均有表達(dá)，這說(shuō)明該種酶在牡蠣中可能與在其他脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中一樣，具有多重生物學(xué)功能[18]。已有研究證實(shí)脊椎動(dòng)物肝臟和腎臟中的17β-HSD可以催化長(zhǎng)鏈脂肪酸的β-氧化[19]，而本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)福建牡蠣17β-HSD基因在內(nèi)臟團(tuán)中表達(dá)量較高，這說(shuō)明其可能參與了牡蠣的脂肪代謝過(guò)程。類似的結(jié)果在櫛孔扇貝[16,20]和狗巖螺[13]中也有報(bào)道。

3 結(jié)論

綜上，本研究通過(guò)分子生物學(xué)的方法克隆獲得了福建牡蠣性類固醇激素合成酶重要基因17β-HSD的全長(zhǎng)，并研究了其序列結(jié)構(gòu)特征和時(shí)空表達(dá)模式，推測(cè)17β-HSD可能參與了牡蠣性類固醇激素合成過(guò)程中的不同生化反應(yīng)，是牡蠣性類固醇激素合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，對(duì)調(diào)節(jié)牡蠣性類固醇激素的合成起著重要的作用。