李雪雪,阮靈偉

(1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波315000；2.自然資源部第三海洋研究所、自然資源部海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門 361005)

1922年，英國細菌學(xué)家Fleming從人的唾液和眼淚中觀察到一種能比較明顯溶解細菌細胞壁的成分，因為具有溶菌作用所以將其命名為溶菌酶[1]。1937年，Abraham和Robinson又實現(xiàn)了將溶菌酶晶體從卵蛋白中分離出來，從此開啟了對溶菌酶的研究，并不斷獲得新的發(fā)現(xiàn)[2]。

溶菌酶是一種堿性酶，能夠水解粘多糖，主要作用機理是通過催化水解細胞壁中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間形成的β-1,4糖苷鍵，糖苷鍵水解后致使細菌細胞壁破裂，破裂的細胞壁會使得內(nèi)容物逸出從而導(dǎo)致細菌死亡[3]。研究表明溶菌酶發(fā)揮作用時有較強的底物特異性，當溶菌酶來源不同時，作用的底物也會不同[4]，已知的溶菌酶按來源不同可分為六大類：①鵝型溶菌酶，又稱g型溶菌酶(g-type)；②雞型溶菌酶，又稱c型溶菌酶(c-type)；③T4噬菌體溶菌酶；④無脊椎動物溶菌酶，又稱i型溶菌酶(i-type)；⑤植物溶菌酶；⑥細菌溶菌酶[5-10]。近年來i型溶菌酶被廣泛研究，它作為溶菌酶家族的新成員，在環(huán)節(jié)動物門、軟體動物門、棘皮動物門和節(jié)肢動物門中分布比較廣泛[11]。有些溶菌酶含有失穩(wěn)酶結(jié)構(gòu)域。失穩(wěn)酶是在歐洲醫(yī)蛭(Haemopissanguisuga)中發(fā)現(xiàn)的，最初發(fā)現(xiàn)其有異肽酶活性，能特異性水解纖維蛋白ε-(γ-Glu)-Lys 的交聯(lián)鍵，進而使纖維蛋白發(fā)生水解[12]。后來，人們又在失穩(wěn)酶中也發(fā)現(xiàn)了糖苷酶活力，于是失穩(wěn)酶被認為是一種新的溶菌酶，并且進一步被認定為 i 型溶菌酶。由于失穩(wěn)酶既具有異肽酶活性，又具有糖苷酶活性，因此稱作DL(Destabilase-lysozyme)[13-14]。溶菌酶在植物、動物和微生物中被普遍的發(fā)現(xiàn)，同時它也是一種對機體無毒害、安全性能很高的堿性小分子蛋白，可以選擇性地分解植物及微生物細胞壁，并且對沒有細胞壁的人體不會產(chǎn)生降解，目前被普遍應(yīng)用于食品、飼料和醫(yī)藥行業(yè)。

超深淵是指在6 000 m以下的深淵帶中凹陷深度最大的地帶，主要是一系列復(fù)雜的海溝組成，目前世界上被發(fā)現(xiàn)的獨立的超深淵棲息地有46個。超深淵底部的水溫在1～4 ℃；底部靜水壓力在600～1 100 Pa之間；物種的數(shù)量和多樣性非常低，其中最常見的是端足類、海參類多毛類、腹足類和雙殼類。超深淵海溝這種高壓、低溫、黑暗及寡營養(yǎng)的環(huán)境條件使得深海形成了特有的生命現(xiàn)象，由于這種特有環(huán)境條件使其成為一個擁有巨大潛力的生物資源寶庫[15]。鉤蝦Eurythenesgryllus又是超深淵最具有代表性物種之一，目前對它的研究還比較少，尤其在分子生物學(xué)方面[16]。本研究從E.gryllus克隆表達一個含有失穩(wěn)酶結(jié)構(gòu)域的i型溶菌酶，成功表達和純化出較高濃度的表達產(chǎn)物，以期為該蛋白后續(xù)生物活性及功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

鉤蝦E.gryllus采集于雅浦海溝(11°20.0′N, 142°11.5′E, 5 970 m)。采集后的樣品放置在RNAlater保護液中，并于-80 ℃保存。

pET-His vector、EscherichiacoliTOP10菌株和E.coliBL21菌株為本實驗室保存；DNAase I、RNAase inhibitor、BamH I、EcoR I、PrimerSTAR、Reverse Transcriptase M-MLV、T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、His標簽蛋白純化試劑盒購買自GE公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1E.gryllus總RNA提取和cDNA合成 按照TRIzol Reagent說明書操作步驟提取組織中的總RNA，經(jīng)電泳檢測無降解后，取RNA 2 μg，加入Oligo(dT)18引物1 mm3，加入DEPC-H20配制到13.5 mm3。70 ℃保溫10 min后，迅速在冰上放置2 min。短暫離心數(shù)秒后，加入5×M-MLV buffer 4 mm3，10 mmol/dm3dNTP mixture 1 mm3，Reverse Transcriptase M-MLV 1 mm3，RNAase inhibitor 0.5 mm3。混勻后42 ℃保溫1 h。70 ℃保溫15 min后，冰上冷卻，得到cDNA，可用于PCR擴增。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 根據(jù)實驗室前期測定的E.gryllus轉(zhuǎn)錄組，我們獲得了其溶菌酶的全長序列，命名為基因EgLyz。將獲得的基因EgLyz用DNAMAN確定正確的開放閱讀框，并翻譯成氨基酸序列。利用NCBI(美國國家生物技術(shù)信息中心)服務(wù)器，BLAST比對分析基因EgLyz核酸序列和氨基酸序列；利用SignalP 4.1分析信號肽及切割位點；利用ProtParam預(yù)測序列分子式、分子量和等電點；通過Pfam數(shù)據(jù)庫的搜索及SMART軟件在線分析蛋白結(jié)構(gòu)域組成；用Predict Protein(https://www.predictprotein.org/)進行空間結(jié)構(gòu)中二硫鍵及其位置的預(yù)測；將獲得的E.gryllus溶菌酶氨基酸序列和其他動物不同類型溶菌酶序列進行比較，然后用MEGA程序中鄰接法作出溶菌酶的分子系統(tǒng)進化樹，節(jié)點上的數(shù)字表示1 000次復(fù)制的自展值，用于檢驗所計算的進化樹分支可信度。

1.2.3EgLyz基因克隆 根據(jù)基因EgLyz的開放閱讀框除去信號肽序列后設(shè)計特異性PCR擴增正反引物，正向引物：5′-CGGGATCCCAAGACTCCACCTGTCTAGGGTG-3′(下劃線表示BamH I酶切位點)；反身引物：5′-CGGAATTCTCACCCTGTAGCAGCTGTCAACACG-3′(下劃線為EcoRI酶切位點)。在50 mm3反應(yīng)體系中加入cDNA模板量為100 ng, 10 mm35×Primerstar Buffer(含Mg2+)，4 mm3dNTP(2.5 mmol/dm3)，0.5 mm3正向引物F(20 μmol/dm3)，0.5 mm3反向引物R(20 μmol/dm3), 0.5 mm3Primerstar HS DNA Polymerase(2.5 U/dm3)，剩余用H2O補齊至總體積50 mm3。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃先預(yù)變性1 min；98 ℃再變性10 s；之后58 ℃退火30s；72 ℃延伸1 min，總共30個循環(huán)；最后再72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.4 重組質(zhì)粒pET-His-EgLyz構(gòu)建及鑒定 上述PCR產(chǎn)物回收后利用BamH I和EcoR I對產(chǎn)物及pET-His進行雙酶切。用瓊脂糖凝膠電泳進行酶切產(chǎn)物分離，之后利用DNA膠回收試劑盒分別對EgLyz基因片段和pET-His載體進行回收。將兩者16 ℃連接過夜(12～16 h)。構(gòu)建好的重組表達質(zhì)粒命名為pET-His-EgLyz。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliTOP10中，在超凈工作臺中涂布到具有氨芐抗性的固體培養(yǎng)皿上，挑取陽性單菌落進行測序，對測序結(jié)果進行分析。

1.2.5 重組質(zhì)粒pET-His-EgLyz表達 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET-His-EgLyz轉(zhuǎn)化至E.coliBL21 中，挑取單菌落接種到5 cm3含有氨芐抗性(1∶1 000)的LB液體培養(yǎng)基中(10 g/dm3胰蛋白胨，10 g/dm3NaCl，5 g/dm3酵母提取液)，在37 ℃搖床中培養(yǎng)過夜12 h左右，次日取0.5 cm3液體培養(yǎng)基接種到含有氨芐抗性的250 cm3的LB培養(yǎng)基中(1∶1 000)，37 ℃震蕩培養(yǎng)2 h后(吸光度為0.6～0.8)，取出1 cm3作為誘導(dǎo)前對照，然后加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/dm3，在搖床中誘導(dǎo)表達5 h。用質(zhì)量分數(shù)為12%的SDS-PAGE電泳鑒定誘導(dǎo)前后樣品。

1.2.6 重組質(zhì)粒pET-His-EgLyz表達純化 收集上述誘導(dǎo)表達后的菌體使用磷酸鹽緩沖液(PBS，0.1 mol/dm3NaH2PO4，0.1 mol/dm3Na2HPO4，pH 7.4)重懸，在冰浴條件下對收集的菌體懸浮液進行超聲破碎(超聲破碎參數(shù)：工作5 s，間隙20 s，全程時間30 min，功率200 W左右)。13 000 r/min離心10 min，將所得上清和包涵體沉淀收集起來，用裂解液(0.5 mol/dm3NaCl，0.02 mol/dm3咪唑，0.02 mol/dm3Na3PO4，8 mol/dm3尿素，pH7.4)重懸包涵體，懸浮液置于室溫下孵育過夜。次日于13 000 r/min離心10 min，并收集上清溶液，再與His標簽蛋白純化介質(zhì)在4 ℃條件下孵育結(jié)合3h。去除上清液后，再用含有0.02 mol/dm3咪唑的洗脫液(0.5 mol/dm3NaCl，0.02 mol/dm3咪唑，0.02 mol/dm3Na3PO4，8 mol/dm3尿素，pH 7.4)進行漂洗，最后用含有不同咪唑濃度的洗脫液把目的蛋白從介質(zhì)上洗脫下來并收集。

將純化好并且條帶單一的目的蛋白轉(zhuǎn)移到透析袋中，在4 ℃條件下依次用含有6.00、4.00、3.00、2.00、1.00、0.50、0.25、0.00 mol/dm3尿素磷酸緩沖液(0.5 mol/dm3NaCl，0.02 mol/dm3咪唑，0.02 mol/dm3Na3PO4，pH 7.4)進行透析復(fù)性。復(fù)性成功后，將目的蛋白留樣進行SDS-PAGE電泳鑒定，剩余保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測重組蛋白 純化或復(fù)性樣品電泳結(jié)束后，取出凝膠放置于濾紙上，PVDF膜置于凝膠上層，之后放置于預(yù)冷電轉(zhuǎn)緩沖液中，于4 ℃冰箱中300 mA下電轉(zhuǎn)1 h；取出PVDF膜，置于含5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1 h;加入封閉液稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜；PVDF膜用TBST緩沖液漂洗3次，再用封閉液稀釋的二抗室溫孵育1 h，再漂洗3次，之后與化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)5 min，暗室曝光顯影至出現(xiàn)顏色深度適宜的條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 EgLyz cDNA全長序列的特征分析

EgLyz該基因全長987 bp，5′非編碼區(qū)為234 bp，3′非編碼區(qū)為246 bp，其完整的閱讀框架為507 bp，編碼168個氨基酸。經(jīng)SignalP 4.1分析，前34個氨基酸為信號肽，從而可以判斷其可分泌到胞外。去除信號肽后，成熟肽是由134個氨基酸組成(圖1)。ProtParam分析結(jié)果表明EgLyz基因成熟肽的相對分子質(zhì)量為14.5 kDa，理論等電點為5.58。經(jīng)SMART分析，該基因具有一個失穩(wěn)酶結(jié)構(gòu)域(36～159 aa)。Predict Proten軟件分析表明EgLyz基因含有13個半胱氨酸殘基，已檢測到1對(Cys56 和 Cys159)二硫鍵，而二硫鍵在維持蛋白構(gòu)象及活性方面起到重要作用[17]。

圖1 E.gryllus溶菌酶基因 EgLyz核苷酸序列及其氨基酸序列

通過NCBI對基因EgLyz序列同源性進行比對分析，結(jié)果表明基因EgLyz與數(shù)據(jù)庫中已知同源序列相似性都比較低，與果蠅(Drosophilagrimshawi)溶菌酶同源相似性序列最高達到62%，與凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)溶菌酶一致性達到56%，與克氏原鰲蝦(Procambarusclarkii)一致性為50%。進一步，根據(jù)基因庫中已經(jīng)報道的凡納濱對蝦、克氏原鰲蝦(Procambarusclarkia)、青蟹(Scyllaparamamosain)及其他生物包含的溶菌酶序列，利用MEGA軟件建立溶菌酶的進化樹。從構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹結(jié)果可以看出，溶菌酶在不同動物體內(nèi)可以分為3大組，第一組屬于節(jié)肢動物體內(nèi)的溶菌酶；第二組為貽貝、鮑魚等軟體動物的溶菌酶；第三組為老鼠、牛等脊椎動物的溶菌酶?；駿gLyz與斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)等節(jié)肢動物的溶菌酶聚為一支(圖2)。

圖2 不同生物體內(nèi)溶菌酶的系統(tǒng)進化樹

2.2 pET-His-EgLyz重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)基因序列設(shè)計引物，對EgLyz基因進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物后，能在500 bp左右看到一條非常單一、特異性很高的條帶，與實際目的片段大小相符(圖3)。

圖3 E.gryllus 中溶菌酶基因克隆

將擴增后得到的EgLyz基因與pET-His 連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-His-EgLyz。轉(zhuǎn)化TOP10，挑取單菌落做菌落PCR，挑取目的大小正確的陽性克隆子送測序分析。測序結(jié)果表明，我們成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET-His-EgLyz。

2.3 EgLyz的重組表達與純化

將重組表達質(zhì)粒pET-His-EgLyz轉(zhuǎn)化E.coliBL21中，當OD600在0.6～0.8后，加入IPTG誘導(dǎo)5h，結(jié)果顯示能夠較明顯地表達目的蛋白，進一步破碎后分析表明，大量表達的重組蛋白主要以包涵體形式存在(圖4)。

在此基礎(chǔ)上，利用融合的His 標簽對目的蛋白進行純化，可以看到用分別含有0.2 mol/dm3和0.3 mol/dm3咪唑的兩種洗脫液能洗脫出濃度比較高的目的蛋白(圖5a)。但是在35 kDa左右的位置也有一條比較弱的單一條帶，經(jīng)Western blot 分析為二聚體條帶(圖5b)。

圖4 pET-His-EgLyz誘導(dǎo)后重組表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析結(jié)果

圖5 SDS-PAGE電泳分析EgLyz的純化結(jié)果

隨后在尿素變性的條件下，通過逐漸降低緩沖液中尿素濃度的方法，對純化的蛋白進行透析，使尿素濃度逐漸減少到0。蛋白在透析袋復(fù)性成功后，SDS-PAGE電泳分析檢測結(jié)果顯示目的蛋白能夠較好地溶解在緩沖液中，并且在15 kDa左右能夠看到一條單一的條帶，條帶大小與預(yù)測EgLyz基因大小相符(圖6)。

圖6 Western blot 分析EgLyz復(fù)性產(chǎn)物

2.4 討論

溶菌酶是一種天然的蛋白質(zhì)，作為營養(yǎng)物質(zhì)可以被人體胃腸消化和吸收，并且不會殘留和產(chǎn)生毒害作用，因此被廣泛的應(yīng)用在食品和醫(yī)學(xué)上。在食品方面主要是作用于各種食品如水產(chǎn)品類熟制品、肉類制品的防腐和保鮮；在醫(yī)學(xué)上，溶菌酶作為酶類抗菌藥，能參與粘多糖代謝。已有報道，在診斷白血病方面，只要檢查病患者的尿或者血清中溶菌酶活性，就可以確診[18]。在構(gòu)成機體非特異性免疫功能方面，溶菌酶也是重要的因素之一，因此溶菌酶在體育方面發(fā)揮著重要作用，根據(jù)俄羅斯巴.戈托夫米夫的報道，他認為運動員在良好狀態(tài)時，其唾液溶菌酶的滴度值下降，因此溶菌酶可以用來對運動員身體進行評定[19]。而在科研上，溶菌酶作為工具酶在基因工程及細胞工程方面也發(fā)揮著重要作用，可以用來生產(chǎn)和提取菌體的活性物質(zhì)如酶、核酸和活性多肽等[20]。因此，各方面來說溶菌酶都具有廣闊的應(yīng)用前景。由于溶菌酶作用特異性比較強，并且每個類型的溶菌酶最適的反應(yīng)條件都不同，所以開發(fā)新型溶菌酶就顯得至關(guān)重要。

雅浦海溝存在于地球上的典型的極端環(huán)境，其獨特的環(huán)境條件會使得在這里生存的生物都具有一些特殊的生物活性分子，因此該極端環(huán)境中可能蘊含龐大的基因資源庫，具有巨大的潛在應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

本研究以深海鉤蝦E.gryllus為材料，首次從E.gryllus中克隆獲得i型溶菌酶基因EgLyz。近年由于對超深淵生物研究比較少，深海生物的基因資源庫還存在嚴重缺失，因此基因EgLyz序列分析與已知序列相似性較低，最大相似度與果蠅(Drosophilagrimshawi)也只有62%，因此EgLyz可能是一個新穎的溶菌酶蛋白。EgLyz含有一個失穩(wěn)酶結(jié)構(gòu)域，13個半胱氨酸殘基，已檢測到1對二硫鍵，因此蛋白構(gòu)象非常穩(wěn)定。

通過克隆，EgLyz基因成功進行了原核重組表達，并且在復(fù)性時對復(fù)性條件不斷進行優(yōu)化，最終獲取了無其他雜蛋白較高純度的可溶性表達產(chǎn)物，本研究實驗結(jié)果為下一步EgLyz基因生物活性及功能分析奠定了堅實的基礎(chǔ)，也豐富了i 型溶菌酶基因資源，這將為E.gryllus在深海這種極端環(huán)境中的適應(yīng)機制的研究提供幫助。