徐蘇晴 常明 盧紅艷

中性粒細胞在機體對抗病原的先天免疫中起著關(guān)鍵作用。在感染早期，中性粒細胞在蛋白水解酶、抗菌蛋白和活性氧(Reactive oxygen specie, ROS)幫助下遷移到感染部位，吞噬并殺死細菌。Brinkmann[1]于2004年發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞在細胞外產(chǎn)生一種由組蛋白、DNA和蛋白酶(Elastinase, NE)組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(Neutrophil extracellular traps, NETs)。中性粒細胞形成NETs的過程被稱為NETosis，這是一種有別于細胞壞死和凋亡的特殊細胞死亡程序。在NETosis過程中，核膜、細胞核和顆粒膜裂解并融合，細胞膜保持完整。盡管NETs在病原體防御中起重要作用，但其產(chǎn)生過量或降解不足也會導致宿主損傷。NETs在免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)等疾病中已有較多研究。本文將綜述中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)在細菌或病毒感染因素、自身免疫因素、全身性疾病及肺部腫瘤導致肺疾病中的作用。

NETs的概述

一、NETs的結(jié)構(gòu)特征

NETs是以DNA為骨架，其間鑲嵌多種蛋白成分的DNA-蛋白質(zhì)復合物，蛋白成分主要是組蛋白，其次是粒狀酶和多肽，包括中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)、髓過氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)、瓜氨酸組蛋白3(Citrulline histone, Cith3)、組織蛋白酶G、白細胞蛋白酶3、乳鐵蛋白、明膠酶、溶菌酶C、鈣保護素、中性粒細胞防御素和組織殺菌素。在電鏡下，NETs的基本骨架是直徑約17 nm的染色質(zhì)，周圍包繞直徑約50 nm的顆粒蛋白等顆粒狀物質(zhì)，NETs可為破碎或棉樣結(jié)構(gòu)，也可為線狀、網(wǎng)狀、膜狀或點狀結(jié)構(gòu)。NETs中DNA網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和附著蛋白的完整性為其捕獲病原體功能提供保障[2]。

二、NETs的生成

生物體或病原體產(chǎn)生的各種生物分子均可誘導中性粒細胞活化，中性粒細胞活化產(chǎn)生的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(Nox 2)，釋放大量ROS，通過與Toll樣受體4 (Toll-like receptors 4, TLR4)結(jié)合，導致中性粒細胞核膜分裂[3]。此外，細胞內(nèi)NE和MPO通過中性粒細胞核膜分裂向細胞核遷移，部分降解特定的組蛋白，促進染色質(zhì)解凝。肽賴氨酸脫氨酶4(Peptidylarginine deiminase 4, PAD4)誘導的組蛋白瓜氨酸化將進一步促進染色質(zhì)解凝。染色質(zhì)解凝后，疏松的染色質(zhì)與顆粒狀的細胞質(zhì)和各種蛋白質(zhì)混合，然后全部進入細胞外空間，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[4]。

三、NETs的免疫逃逸

免疫逃逸是病原體通過其結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)物質(zhì)，拮抗、阻斷和抑制機體免疫應(yīng)答從而加重病原體對人體危害的方式。NETs對多種病原體均有不同程度的抗感染作用，而這些病原體也通過不同方式逃避NETs捕獲。病原體可釋放IL-10抑制劑阻斷TLR誘導的ROS生成或利用核酸酶來攻擊NETs的DNA骨架，從而阻斷NETs的生成，進行免疫逃避[5]。病原體還可通過表面蛋白分子，負性調(diào)節(jié)中性粒細胞活性，從而抑制NETs的生成[6]。

NETs與肺疾病

多種因素均可導致肺部疾病，例如細菌或病毒感染因素、自身免疫因素、全身性疾病及肺部腫瘤等。這些因素導致的肺疾病與NETs有著密切關(guān)系。

一、NETs與肺炎鏈球菌感染

肺炎鏈球菌是導致社區(qū)獲得性肺炎最常見的病原體。肺炎鏈球菌為革蘭陽性細菌，其主要致病成分為莢膜、脂磷壁酸和鏈球菌溶素。中性粒細胞在接觸肺炎球菌時可釋放NETs，損傷肺組織[7]，Nel[8]等研究表明，肺炎鏈球菌介導的NETs形成依賴于鏈球菌溶素，該機制獨立于Toll樣受體4 (TLR4)或ROS。而相反的結(jié)論表明，肺炎鏈球菌刺激后NETs的釋放與鏈球菌溶素無關(guān)，而與自噬有關(guān)[9]。因此，肺炎鏈球菌誘導NETs的直接機制尚不清楚。NETs可使肺炎鏈球菌固定，并限制其在宿主中傳播。肺炎鏈球菌可利用脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease, DNase)降解NETs，從而進行免疫逃逸。研究者利用質(zhì)譜分析證實TatD是一種潛在的細胞外DNA酶，可降解NETs的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。TatD的DNase活性有助于肺炎鏈球菌從NETs的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中逃逸。在膿毒癥小鼠模型中，與野生型肺炎鏈球菌感染相比，敲除TatD的鏈球菌感染后，小鼠表現(xiàn)為鏈球菌感染減少，肺組織損害減輕，存活率提高。TatD抑制劑或可避免肺炎鏈球菌發(fā)生NETs相關(guān)的病原逃逸，從而成為治療肺炎球菌肺炎的潛在靶點[10]。在臨床病例研究中，有研究者發(fā)現(xiàn)社區(qū)獲得性肺炎可導致NETs水平升高，且血清中NETs升高的患者臨床不穩(wěn)定性增加、住院時間延長。由此預測NETs是一種新的預后指標，也是社區(qū)獲得性肺炎輔助治療的可能靶點[11]。

二、NETs 與呼吸道合胞病毒感染

呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰幼兒常見呼吸道感染病毒。中性粒細胞及其產(chǎn)物存在于RSV感染患兒的呼吸道，將增加其癥狀嚴重程度[12]。RSV是一種單鏈RNA病毒，其基因組可編碼多達11種蛋白質(zhì)。其中融合蛋白(F)存在于病毒粒子表面，在病毒進入時介導病毒包膜與靶細胞膜融合[13]。有證據(jù)表明，NETs能夠捕獲RSV，從而阻止病毒顆粒與靶細胞結(jié)合，防止感染。NETs的形成可能是限制RSV病毒擴散的重要機制[14]。但與此同時，F(xiàn)蛋白以ERK和P38mapk磷酸化依賴的方式誘導NETs生成，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被中性粒細胞彈性酶和髓過氧化物酶修飾，這些顆粒蛋白可以損傷組織，加重癥狀，損害肺功能[15]。以上結(jié)果表明，RSV 中F蛋白誘導NETs形成在RSV感染中起“雙刃劍”作用。由黏液、中性粒細胞的細胞碎片和脫落的支氣管上皮細胞組成的致密栓子造成小氣道阻塞是RSV下呼吸道疾病(RSV lower respiratory tract disease, RSV-LRTD)患者的主要病理特征[15]。在患有嚴重RSV-LRTD嬰幼兒的支氣管肺泡灌洗液(BALF)中，研究者發(fā)現(xiàn)了NETs的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[16]。Cortjens[17]等則進一步證實，在嚴重RSV-LRTD患者中，NETs的形成促進中性粒細胞耗竭，導致氣道中粘蛋白含量增高，氣道阻塞癥狀加重。對于嚴重RSV-LRTD氣道阻塞患者，針對NETs的靶向藥物是一種新的治療措施。

三、NETs與哮喘

支氣管哮喘(哮喘)(bronchial asthma)為呼吸系統(tǒng)中常見疾病，嗜酸性粒細胞、T細胞、肥大細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞及多種細胞組分均參與哮喘病程。重癥哮喘可誘導肺損傷發(fā)生。在哮喘過程中，中性粒細胞為調(diào)節(jié)細胞，可以在氣道中浸潤，釋放細胞因子和炎癥介質(zhì)，調(diào)節(jié)其他細胞的功能，從而在哮喘中發(fā)揮重要作用[18]。在仙臺病毒(SEV)誘導C57BL/6J小鼠哮喘模型中，研究者證實哮喘患者氣道中性粒細胞可形成NETs[19]。在嗜中性哮喘患者(痰中中性粒細胞比例超過嗜酸性粒細胞比例)血漿中，IL-8、中性粒細胞計數(shù)和NETs均升高[20]。經(jīng)鼻病毒(RV)感染后，過敏小鼠氣道內(nèi)大量中性粒細胞募集和過量NETs沉積與大量雙鏈DNA(dsDNA)釋放相關(guān)，可促進2型免疫反應(yīng)，進而加重哮喘癥狀。經(jīng)dsDNA處理的過敏小鼠BALF中細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞的數(shù)量和百分比均高于對照組，而小鼠在使用DNase處理后，血清IgE濃度、BALF中黏蛋白5AC(MUC5AC)和氣道炎癥細胞浸潤的濃度均降低，且呼吸道粘液產(chǎn)生減少，氣道高反應(yīng)得到緩解[21]，提示dsDNA作為NETs的組成成分在哮喘過程中發(fā)揮重要作用，有研究者認為，NETs可介導炎癥小體激活與單核細胞中IL-1分泌,引起氣道上皮細胞損傷，加哮喘癥狀[22]。Pham[23]等則通過臨床試驗證實，NETs會造成氣道上皮損害從而加重哮喘癥狀。以上研究說明，NETs在哮喘發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。在哮喘治療過程中，糖皮質(zhì)激素發(fā)揮重要作用。有研究者認為，糖皮質(zhì)激素在體外和體內(nèi)都能降低哮喘肺組織中NETs形成，并提出利用重組人DNA酶來消除NETs或?qū)⒊蔀橄囊粋€新的潛在治療靶點[24]。

四、NETs與膿毒癥性肺損傷

膿毒癥可造成多種器官損傷，如急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)，損傷嚴重的急性肺損傷(ALI)可進展為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，其臨床特征為肺血管通透性增高，肺間質(zhì)及肺泡水腫，從而導致頑固性低氧血癥。研究表明，NETs的產(chǎn)生對于ALI的進展起重要作用。在疾病初期，NETs的形成可捕獲病原體，但隨著NETs的過度形成可造成肺組織損傷，加重疾病癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠膿毒癥性肺損傷模型中，氣管內(nèi)接種聚肌胞苷酸(poly I:C)小鼠的BALF中，中性粒細胞浸潤明顯增加，同時炎性細胞因子IL-1β、IL- 6和TNF-α在肺部也顯著升高，在其肺組織中MPO和Cith3表達明顯升高，表明NETs形成增多。poly I:C誘導NETs和ALI的形成，與p38 MAPK的激活和claudin-5的表達降低有關(guān)[25]。研究者在脂多糖(LPS)致死性膿毒癥小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，LPS誘導的PAD的激活以及隨后Cith 3介導NETs的形成增加了內(nèi)皮細胞的通透性和肺功能障礙,而通過減少PAD的激活，可阻斷LPS誘導的肺血管滲漏，減輕急性肺損傷，提高存活率[26]。通過經(jīng)盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)誘導膿毒癥，發(fā)現(xiàn)細胞外冷誘導RNA結(jié)合蛋白(CIRP)通過上調(diào)PAD4的表達誘導肺部NETs形成，從而加重膿毒癥性肺損傷[27]。這些研究提示NETs在膿毒癥性肺損傷中發(fā)揮重要作用。在膿毒性肺損傷小鼠模型中，肝素可與 NETs中帶正電荷的組蛋白相結(jié)合，降低NETs的活性，減弱NETs介導的促凝效應(yīng)，降低NETs對肺組織的損傷，這一觀點或可為膿毒癥性肺損傷提供治療新思路[28]。

五、NETs與肺癌

肺癌(Lung cancer)是起源于支氣管上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病率居惡性腫瘤之首，肺癌的早期診斷率低，預后差，因此肺癌的早期診斷對改善肺癌的預后具有重要作用。研究證實，肺癌細胞培養(yǎng)上清液中的細胞外RNA(exRNAs)可間接誘導網(wǎng)，并參與肺癌的發(fā)生[29]。Albrengues[30]等人在肺癌休眠期小鼠模型中，利用煙草煙霧或經(jīng)鼻腔注入脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)引起的持續(xù)性肺炎癥的同時，體內(nèi)大量生成NETs。中性粒細胞彈性蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶9是NETs相關(guān)的蛋白酶，它們都是序列裂解的層粘連蛋白。蛋白水解重組層粘連蛋白通過激活整合素a3b1信號通路誘導休眠癌細胞增殖。開發(fā)針對NETs重構(gòu)層粘連蛋白的抗體可阻止休眠細胞覺醒，這種防止休眠細胞覺醒的療法或可延長癌癥患者的生存時間。在非炎性條件的肺癌模型中，研究者發(fā)現(xiàn)游離巰基是血漿維持氧化還原平衡的關(guān)鍵物質(zhì)，而白蛋白是其主要儲存庫，游離巰基可用來清除循環(huán)中性粒細胞中的活性氧(ROS)，當這種白蛋白巰基庫在癌癥狀態(tài)下耗盡時，白蛋白氧化導致游離巰基丟失，從而血漿氧化還原失衡，這一過程可使中性粒細胞內(nèi)活性氧(ROS)的積累誘導NETs產(chǎn)生，由此形成的NETs主要存在于肺內(nèi)，它們有助于循環(huán)腫瘤細胞的定植，從而導致肺轉(zhuǎn)移[31]?？筃ETs療法和將NETs作為潛在的預測標志物或可提供一種有效的臨床策略來對抗肺癌轉(zhuǎn)移。

展望

自NETs發(fā)現(xiàn)以來，研究者在各類疾病中發(fā)現(xiàn)并研究NETs產(chǎn)生機制?，F(xiàn)已證實，產(chǎn)生過多或降解不足的NETs會對機體產(chǎn)生損傷，進而加重疾病癥狀。NETs抑制劑則成為治療疾病新的靶點，在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中，重組DNase已成功應(yīng)用于疾病痰液的液化，此外蛋白酶抑制劑也被應(yīng)用于該疾病[32]。但NETs在各種肺疾病中產(chǎn)生的具體機制尚不明確，這也為今后的研究提供新的方向。