周桂娟 周 君,2,3 肖子建 孫光華 伍 琦 曾亞華 劉 靜 鐘培瑞 成 果 王甜甜 鄧程遠 廖 瑛△

（1南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，衡陽421001；2四川大學(xué)華西醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)中心，成都610041；3康復(fù)醫(yī)學(xué)四川省重點實驗室，成都610041）

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis， OA) 是一種多因素導(dǎo)致的衰老相關(guān)性、慢性退行性關(guān)節(jié)病變，其特征是軟骨細胞外基質(zhì)的降解和軟骨細胞的減少[1]。OA病人早期可反復(fù)出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及活動障礙等，晚期嚴重者可出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形，直接影響病人的生活質(zhì)量。隨著全球人口老齡化加重，OA發(fā)病率呈上升趨勢，但目前尚未發(fā)現(xiàn)有效治愈關(guān)節(jié)炎的靶向藥物。Radin[2]等提出OA發(fā)病中軟骨下骨的改變先于關(guān)節(jié)軟骨退變，異常誘因或應(yīng)力引起的骨轉(zhuǎn)換和骨吸收異常可造成軟骨下骨密度改變，繼發(fā)性地引起軟骨結(jié)構(gòu)完整性的改變。因此，抑制軟骨下骨的骨吸收可能成為拮抗OA發(fā)生發(fā)展的新的治療思路。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，一些骨吸收抑制劑對OA有一定的治療作用，伊班膦酸鈉就是其中之一，但其作用機制仍不明確，能否有效抑制OA進展尚存爭議[3，4]。已有研究發(fā)現(xiàn)OA 的發(fā)生與軟骨細胞自噬水平下降相關(guān)，在骨生長和骨重建中，自噬溶酶體對骨質(zhì)的更新起著重要作用[5，6]。雙磷酸鹽類骨吸收抑制劑對OA軟骨下骨的骨重建是否與自噬相關(guān)尚無報道。本實驗結(jié)合OA的發(fā)病機制通過前交叉韌帶切斷術(shù) (anterior cruciate ligament transaction， ACLT) 復(fù)制SD大鼠膝關(guān)節(jié)OA，觀察關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨組織結(jié)構(gòu)的改變，初探伊班膦酸鈉對OA 的治療效果及機制，并從自噬的角度，為臨床運用伊班膦酸鈉治療OA提供可靠的理論依據(jù)。

方 法

1.實驗動物

健康3月齡SD雌性大鼠30只（南華大學(xué)實驗動物中心提供），體重200～250 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后大鼠初始平均體重為244.1±15.1 g，所有受試大鼠均置于室溫20℃～24℃左右，自然光照的動物房中分籠飼養(yǎng)，飼料購自南華大學(xué)實驗動物中心，實驗期間不額外給予與實驗無關(guān)的其他藥物和食物。

2.主要試劑及儀器

主要試劑：伊班膦酸鈉注射液（艾本）（規(guī)格1 mg：1 ml，中國河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心）；CTX-I、CTX-II ELISA試劑盒（中國廣州皓躍生物科技有限公司）；IL-1、IL-6 ELISA試劑盒（中國北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；兔抗大鼠β-actin單克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（美國Cell Signaling Technology）；兔抗大鼠LC3 II多克隆抗體、兔抗大鼠MMP-13單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。

主要儀器：Micro-CT（ZKKS-CT型，中國廣州中科愷盛醫(yī)療科技有限公司）；奧林巴斯光學(xué)顯微鏡（BX53型，日本Olympus公司）；酶標儀（Ascent型，美國Thermo Fisher Scientific）。其他均為實驗室常備儀器。

3.實驗分組、造模及干預(yù)

經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后的30只SD雌性大鼠采用隨機生成數(shù)字表分成3組：假手術(shù)組(Sham)、生理鹽水治療組(ACLT + NS)和伊班膦酸鈉治療組(ACLT + IB)，每組10只，ACLT + NS組和 ACLT +IB組參照文獻[7]采用切斷大鼠的右側(cè)前交叉韌帶方法（ACLT術(shù)）建立膝關(guān)節(jié)炎大鼠模型。Sham組只切開右膝關(guān)節(jié)腔，不切斷前交叉韌帶，直接縫合膝關(guān)節(jié)，左側(cè)膝關(guān)節(jié)未做手術(shù)。術(shù)后每只大鼠肌肉注射青霉素（40萬單位），每日1次，連續(xù)3天預(yù)防感染。造模術(shù)后繼續(xù)喂養(yǎng)1周后進行干預(yù)，ACLT +IB組大鼠腹腔注射伊班膦酸鈉10 μg/kg，每周1次，連續(xù)12周；ACLT + NS組大鼠則給予等劑量生理鹽水腹腔注射，每周1次，連續(xù)12周；Sham組不予以特殊處理。實驗程序經(jīng)南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會審核批準符合《動物保護法》中華人民共和國(2001)。

4.標本的采集和處理

各組大鼠在干預(yù)12周時取材，處死前予10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉，麻醉成功后使用有齒鑷摘除大鼠眼球，留取內(nèi)眥靜脈血，血樣離心后取上層血清于EP 管中，-80 ℃ 條件保存以待ELISA檢測。隨后予以頸椎脫臼法處死各組大鼠，馬上在無菌條件下解剖暴露雙后肢膝關(guān)節(jié)，分離脛腓骨，刮取右側(cè)脛骨平臺軟骨及近端骨組織放入EP管（裝有2.5 ml EDTA），-80 ℃ 條件保存以待Western blotting檢測。取左側(cè)脛骨近端骨組織約1 cm，盡可能清除關(guān)節(jié)表面其他組織，沖洗干凈后常規(guī)脫鈣、石蠟包埋切片，行番紅染色進行關(guān)節(jié)軟骨病理評估。繼續(xù)取右側(cè)脛骨近端骨組織約2 cm，置于4%多聚甲醛中固定，然后使用Micro-CT觀察軟骨下骨微結(jié)構(gòu)，并對其進行定量分析。

5.觀察指標及方法

（1）番紅染色觀察關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)：常規(guī)石蠟切片脫蠟水化后用1%番紅浸染2 min，鏡下體積分數(shù)95%乙醇分化數(shù)秒，風(fēng)干，二甲苯透明，中性樹膠封片顯微鏡下觀察。

（2）Mankin's評分系統(tǒng)評價關(guān)節(jié)軟骨退變程度：Mankin's評分是目前學(xué)界公認的對OA軟骨退變程度進行評價的通用標準。依據(jù)盲法原則，由高年資病理科醫(yī)師2名采用修改后的Mankin's評分[8]對各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織的番紅染色進行評價，分值從0～14分，主要從4個方面評分：軟骨結(jié)構(gòu)（0分：正常；1分：表面不規(guī)則；2分：血管翳形成和表面不規(guī)則；3分：裂隙進入過渡層；4分：裂隙進入輻射層；5分：裂隙進入鈣化層；6分：結(jié)構(gòu)完全破壞）；軟骨細胞（0分：正常；1分：彌漫性細胞增加；2分：局部細胞增加；3分：細胞數(shù)目明顯減少）；軟骨基質(zhì)染色（0分：正常；1分：輕度減少；2分：中度減少；3分：重度減少；4分：無著色）；潮線完整性（0分：完整；1分：缺失）。得分越高者病變程度越重。若兩者評分不一致，則共同討論并達成共識。

（3）Micro-CT掃描觀察關(guān)節(jié)軟骨下骨形態(tài)學(xué)：取右側(cè)脛骨近端骨組織置于4%多聚甲醛中固定后用Micro-CT進行掃描，參數(shù)設(shè)定：旋轉(zhuǎn)角度220°，增量0.6°，分辨率45 μm，曝光時間3 000 ms，每層的間距為16 μm。掃描完成后分析所測標本的骨組織形態(tài)學(xué)參數(shù)，選擇以下指標：相對骨體積 (bone volume fraction， BV/TV)，即骨體積除以總體積；骨小梁數(shù)量(trabecular number， Tb.N)，指感興趣區(qū)域內(nèi)骨組織與非骨組織的交點數(shù)量；骨小梁分離度(trabecular separation， Tb.Sp)，指骨小梁間的平均寬度；骨小梁厚度 (trabecular thickness， Tb.Th)，指骨小梁的平均厚度。最后，應(yīng)用骨形態(tài)分析軟件 Advanced Bone Analysis對定義框內(nèi)的骨質(zhì)行骨小梁相對骨體積、骨小梁數(shù)量、骨小梁分離度及骨小梁厚度檢測，重復(fù)3次。

（4）ELSIA檢測血清中CTX-I、CTX-II、IL-1及IL-6含量：從-80 ℃冰柜中取出處理好的各組大鼠血清，嚴格按各試劑盒說明書采用 ELISA 法測試血清中CTX-I、CTX-II、IL-1及IL-6含量：包被、封閉、洗滌、孵育，在反應(yīng)終止后用酶標儀在450nm波長測量各孔的吸光度。

（5）Western blotting檢測軟骨及軟骨下骨MMP-13及LC3 II蛋白表達：將收集的軟骨及軟骨下骨標本提取細胞總蛋白。各組取總蛋白進行電泳后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST室溫下封閉1 h，之后分別加入兔抗大鼠MMP-13單克隆抗體、兔抗大鼠LC3 II多克隆抗體、兔抗大鼠β-actin單克隆抗體（工作濃度分別為1:1 000、1:500、1:5 000），室溫搖床搖1 h后4 ℃孵育過夜。次日再次常溫搖1 h后洗膜，再加入HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（工作濃度1:5 000），室溫孵育1 h后用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，于暗室內(nèi)壓片，顯影定影。所得條帶運用Image J圖像分析軟件分析。

6.統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有試驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)均為定量資料，以均數(shù)±標準差()表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA) ，組間兩兩均數(shù)比較采用LSD-t檢驗，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.伊班膦酸鈉對關(guān)節(jié)軟骨組織的形態(tài)學(xué)及Mankin's評分的影響

Sham組軟骨表面光滑，細胞分布均勻，無裂隙，染色正常；ACLT + NS組軟骨變薄，表面粗糙，有裂隙形成，細胞密度不均，數(shù)目減少，潮線模糊；ACLT + IB組軟骨組織分層無明顯破壞，表面略不平整，細胞稍增多，潮線基本完整（見圖1）。Mankin評分（各組n= 10）：ACLT + NS組評分結(jié)果(8.1±1.7)明顯高于Sham組(0.6±0.7)，差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P< 0.001)，表明本實驗OA動物模型建立成功。ACLT + IB組評分結(jié)果(3.1±1.2)明顯低于ACLT + NS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，提示伊班膦酸鈉治療有效。

2.伊班膦酸鈉對軟骨下骨組織形態(tài)學(xué)的影響

Micro-CT掃描大鼠右側(cè)脛骨后可見ACLT + NS組軟骨下骨骨小梁排列紊亂，出現(xiàn)硬化表現(xiàn)，局部呈現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，邊緣處可見骨贅形成。ACLT + IB組軟骨下骨小梁排列較ACLT + NS組整齊，斷裂現(xiàn)象較少見 （見圖2）。分析各組脛骨平臺骨組織形態(tài)學(xué)參數(shù)見表1，三組相對骨體積(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)比較，組間差異均有顯著性意義(P< 0.001)；ACLT + NS組的BV/TV、Tb.N、Tb.Th顯著低于Sham組(P< 0.001)，而Tb.Sp則明顯高于Sham組(P< 0.001)；ACLT + IB組BV/TV、Tb.N、Tb.Th等均明顯高于ACLT + NS組(P< 0.001)，Tb.Sp則顯著低于ACLT + NS (P< 0.001)；ACLT + IB組與Sham組比較，各參數(shù)差異均無顯著性差異。

3.伊班膦酸鈉對大鼠血清CTX-I、CTX-II、IL-1及IL-6含量的影響

ELISA檢測結(jié)果顯示，ACLT + NS組血清CTX-I、CTX-II、IL-1、IL-6濃 度 高 于 Sham 組(P< 0.05)，與ACLT + NS組相比，ACLT + IB組血清CTX-I、CTX-II、IL-1、IL-6水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P< 0.05)，ACLT + IB組與Sham組比較，血清CTX-I、CTX-II、IL-1、IL-6水平無統(tǒng)計學(xué)差異（見圖3）。

4.伊班膦酸鈉對大鼠軟骨及軟骨下骨MMP-13和LC3 II蛋白表達水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，與Sham組相比，ACLT + NS組MMP-13蛋白表達增高，LC3 II蛋白表達下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01)，ACLT + IB組MMP-13蛋白表達低于ACLT + NS組，而LC3 II蛋白表達則高于ACLT + NS組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01，見圖4）。

討 論

Loeser[9]研究認為OA是膝關(guān)節(jié)整個器官的疾病，而非單純的軟骨退行性疾病，疾病過程中關(guān)節(jié)軟骨下骨、半月板、滑膜和韌帶等其他相關(guān)組織也會發(fā)生改變[10，11]。生物學(xué)和機械力學(xué)因素共同作用于關(guān)節(jié)內(nèi)的關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨等各組分，使其遭受不同程度損害并釋放各種細胞因子、炎性介質(zhì)[12]和細胞活素類物質(zhì)等[13]，如白介素、腫瘤壞死因子及基質(zhì)金屬蛋白酶等，這些物質(zhì)相互作用并最終引起關(guān)節(jié)軟骨破壞和軟骨下骨結(jié)構(gòu)異常[6]。本實驗中采用ACLT導(dǎo)致關(guān)節(jié)受力發(fā)生變化，造成關(guān)節(jié)的退行性改變，從而導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[7]。

圖1 不同組大鼠軟骨組織番紅染色：(A) Sham組；(B) ACLT + NS組；(C) ACLT + IB組 標尺= 500 μmFig.1 Safranin staining of articular cartilage in rats (A) Sham group; (B) ACLT + NS group; (C) ACLT + IB group Scale bar = 500 μm

圖2 不同組大鼠脛骨近端Micro-CT掃描圖像Fig.2 Micro-CT scan of proximal tibia in rats

表1 不同組大鼠脛骨平臺軟骨下骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù) (n = 10，)Table 1 The index of bone histomorphometry in Subchondral bone of tibial plateau of rats in different groups (n = 10，)

表1 不同組大鼠脛骨平臺軟骨下骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù) (n = 10，)Table 1 The index of bone histomorphometry in Subchondral bone of tibial plateau of rats in different groups (n = 10，)

***P < 0.001，與Sham組相比；###P < 0.001，與ACLT + NS組相比；***P < 0.001， compared with group sham; ###P < 0.001， compared with group ACLT + NS.

組別Group Sham ACLT + NS ACLT + IB BV/TV (%) 42.48±4.04 30.22±3.05*** 41.37±2.43###Tb.N (L/mm) 5.22±0.33 3.18±0.36*** 5.34±0.34###Tb.Sp (μm) 105.56±11.33 259.79±18.79*** 107.53±8.23###Tb.Th (μm) 90.14±1.45 73.64±2.09*** 90.34±1.61###

圖3 各組大鼠血清CTX-I (A)、CTX-II (B)、IL-1(C)及IL-6 (D)濃度 (n = 10，)Fig.3 Concentration of serum CTX-I (A)， CTX-II (B)， IL-1 (C)， and IL-6 (D) in different groups (n = 10，)

圖4 各組大鼠軟骨及軟骨下骨MMP-13和LC3 II蛋白表達水平 (n = 10，)Fig.4 The expression of MMP-13 and LC3 II in cartilage and subchondral bone of rats (n = 10，)

常用的OA判定方法有病理學(xué)診斷、影像學(xué)檢查及生物標志物檢測等。本研究采用番紅染色觀察軟骨組織，發(fā)現(xiàn)ACLT + NS組（模型組）軟骨組織呈OA病理改變，如表面粗糙，有裂隙形成，細胞減少，潮線不完整等，Mankin's評分明顯高于Sham組（假手術(shù)組）。采用Micro-CT掃描觀察軟骨下骨組織形態(tài)學(xué)，可觀察到模型組軟骨下骨骨質(zhì)疏松。生物標志物的方法常用于OA實驗研究，如檢測大鼠血清中炎性因子、CTX-II、CTX-I等[14，15]，其中血清及尿液中CTX-II含量與軟骨退化程度成正相關(guān)[16]。相比于影像學(xué)檢查和病理學(xué)診斷，檢測血液或尿液中CTX-II含量可能是更方便的檢測OA或動態(tài)監(jiān)測OA變化的方法。本研究檢測了大鼠血清中CTX-I、CTX-II的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ACLT + NS組血清CTX-II、CTX-I濃度顯著高于Sham組。因此，結(jié)合病理學(xué)、影像學(xué)及血清學(xué)結(jié)果，本研究顯示通過ACLT手術(shù)的大鼠可以發(fā)生OA，提示造模成功。

在OA的動物模型研究中發(fā)現(xiàn)，軟骨下骨骨重建失常是骨關(guān)節(jié)炎的重要病理變化[17]，軟骨下骨的改變先于關(guān)節(jié)軟骨退變[2]。在OA發(fā)病早期，軟骨下骨骨重建以骨吸收為主[17]，局部骨質(zhì)疏松形成，病程后期軟骨下骨骨重建以骨形成為主，最終出現(xiàn)軟骨下骨硬化、骨贅形成[18]，最終繼發(fā)性地引起關(guān)節(jié)軟骨進行性變性和消失、滑膜慢性炎癥及反應(yīng)性增生等[19]。雙膦酸鹽類藥物具有抑制骨吸收的作用，目前臨床上主要用于治療骨質(zhì)疏松，可直接抑制破骨細胞的作用，并使成骨細胞釋放抑制破骨細胞活化和形成的因子，從而阻斷破骨細胞的骨吸收作用。本實驗中采用骨吸收抑制劑伊班膦酸鈉干預(yù)OA大鼠，采用病理學(xué)評分、顯微CT評價及生物標志物等方法觀察其是否可治療或改善OA。伊班膦酸鈉干預(yù)后番紅染色可觀察到軟骨組織形態(tài)改善，Mankin's評分降低；Micro-CT掃描觀察軟骨下骨，BV/TV、Tb.N、Tb.Th顯著增高，Tb.Sp顯著降低，骨小梁微觀結(jié)構(gòu)改善；血清學(xué)檢查CTX-II、CTX-I濃度顯著降低，提示伊班膦酸鈉改善了OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變及軟骨下骨結(jié)構(gòu)。

骨的代謝速度和一些細胞因子的含量高低有一定關(guān)聯(lián)性，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-13 能不可逆地降解 II型膠原，促使軟骨細胞外基質(zhì)降解，從而造成關(guān)節(jié)軟骨的破壞[20]。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)包括伊班膦酸鈉在內(nèi)的多種雙磷酸鹽類藥物都能抑制MMPs的作用[21]。MMP-13與其他細胞因子如IL-1、IL-6等相互作用，最終引起軟骨下骨結(jié)構(gòu)異常和關(guān)節(jié)軟骨破壞。評估軟骨的退行性病變的程度，可以通過分析這類細胞活素類物質(zhì)和細胞因子的表達來進行，同時這些物質(zhì)還可以為OA疾病的預(yù)后提供依據(jù)。本實驗中OA組（ACLT + NS組）的IL-1和IL-6濃度均明顯高于假手術(shù)組，軟骨組織MMP-13蛋白的表達也明顯增高。伊班膦酸鈉干預(yù)大鼠的IL-1和IL-6濃度低于OA組，MMP-13蛋白表達較OA組明顯下調(diào)，提示伊班膦酸鈉可能通過抑制OA大鼠細胞炎性因子分泌及MMP-13蛋白表達。

關(guān)節(jié)軟骨退變是OA發(fā)病機制的中心環(huán)節(jié)，繼發(fā)于軟骨下骨的骨重建[22]，隨后細胞外基質(zhì)的降解和增生不良引起軟骨退化[23]。已有研究發(fā)現(xiàn)OA 的發(fā)生與軟骨細胞自噬水平下降相關(guān)，在骨生長和骨重建中，自噬溶酶體對骨質(zhì)的更新起著重要作用[5，6]。破骨細胞的溶酶體酶能釋放到細胞外，分解和消除陳舊的骨基質(zhì)，這是骨質(zhì)更新的一個重要步驟。自噬形成時，自噬體膜上LC3 I轉(zhuǎn)化為活化形式LC3 II，成為密閉自噬體。因此，LC3 II/LC3 I比值增高可作為自噬體形成的標志，自噬相關(guān)蛋白LC3 II的表達水平與自噬體的形成密切相關(guān)。本實驗中OA大鼠自噬相關(guān)蛋白LC3 II表達下降，而伊班膦酸鈉干預(yù)后，大鼠LC3 II表達增高，提示伊班膦酸鈉改善OA大鼠軟骨及軟骨下骨可能與增強自噬相關(guān)蛋白LC3 II有關(guān)。但本實驗僅為觀察性研究，未涉及到自噬體、自噬溶酶體等直觀顯示細胞自噬的檢測及研究，對自噬與軟骨相關(guān)性的研究尚處于初級階段，對伊班膦酸鈉與自噬途徑在軟骨中作用機制、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的認識還不夠全面，有待進一步研究。

綜上所述，ACLT大鼠膝關(guān)節(jié)發(fā)生典型OA致軟骨退變的同時，也伴有軟骨下骨骨量的減少和微觀結(jié)構(gòu)的改變。伊班膦酸鈉不僅可以抑制關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解、減少炎癥反應(yīng)、減緩關(guān)節(jié)軟骨退變，還可以減輕軟骨下骨骨質(zhì)疏松、改善軟骨下骨小梁微觀結(jié)構(gòu)，自噬相關(guān)蛋白LC3 II的表達增高。伊班膦酸鈉對軟骨及軟骨下骨的保護作用可能與其增強自噬相關(guān)蛋白LC3 II有關(guān)，可有效抑制OA的進展，是否通過增強軟骨細胞自噬發(fā)揮保護作用尚需進一步實驗驗證。