朱蘊(yùn)蘭，陳宏偉，陳安徽，邵穎，李文，秦杰

（徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇省食品生物加工工程技術(shù)研究中心，江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221111）

金針菇（Flammulina velutipes（Fr.）Sing）是人們熟知的一種食用菌，富含糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷酸、維生素和硒鋅鐵等微量元素，具有增強(qiáng)記憶力、促進(jìn)發(fā)育、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗過敏等多種功能[1-9]。隨著人們對金針菇的需求，其產(chǎn)量逐年遞增，2016 年國內(nèi)產(chǎn)量達(dá)到266.93 萬噸，預(yù)計到2020 年將達(dá)到400萬噸左右[10]。但金針菇在商品化出售之前，要做切根處理，產(chǎn)生的廢菇柄每年可達(dá)30 萬噸～35 萬噸。這些廢棄菇柄一般直接扔掉或被用作飼料，不但產(chǎn)生了環(huán)境污染問題同時還造成了資源浪費(fèi)。已有研究表明金針菇菌腳蛋白質(zhì)含量為17.02 g/100 g DW，氨基酸種類齊全，含有人體必需的18 種氨基酸，其氨基酸含量為59.81%，必需氨基酸含量占總氨基酸含量的40.27%[11]，金針菇廢菇柄多糖提取率可達(dá)11.09%[12]，核苷酸提取率可達(dá)1.47%[13]。但目前對其深加工和商品化處理方面還未得到充分重視，目前對金針菇廢菇柄的研究主要集中在活性物質(zhì)蛋白質(zhì)、膳食纖維、多糖、氨基酸和核苷酸等的提取方面[11，13-17]，而利用廢菇柄進(jìn)行深加工的研究尚少[18]，如何充分利用金針菇廢菇柄資源和提高其科技含量增加其附加值，開發(fā)金針菇廢菇柄產(chǎn)品具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。

蛹擬青霉 （Paecilomyces militaris） 是蛹蟲 草[Cordyceps militarise（L.）Link]的無性型，其菌絲體和發(fā)酵產(chǎn)物含有與蛹蟲草相似的蟲草多糖、蟲草素、蟲草酸等成分，具有增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抗疲勞、降血脂、防止血栓形成，抗病毒、抗菌、護(hù)肝等作用[19-20]。蛹擬青霉具有較強(qiáng)的生物轉(zhuǎn)化能力，利用其生理活動將發(fā)酵基質(zhì)中的有效成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生新的成分，從而產(chǎn)生新的性質(zhì)和功能，即雙向固體發(fā)酵[21-22]。閆梅霞等[23]研究了蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵人參產(chǎn)物的有效成分含量，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵人參須的多糖、蛋白質(zhì)、總皂苷含量均高于發(fā)酵前。賀曉玉[24]研究了蛹蟲草菌固體發(fā)酵五味子藥渣工藝的優(yōu)化及其產(chǎn)物對斷奶仔豬，試驗(yàn)表明，發(fā)酵條件優(yōu)化后的發(fā)酵產(chǎn)物中蟲草素含量高達(dá)5.12 mg/g；多糖含量為2.87%，相比發(fā)酵前五味子藥渣中多糖含量提高24.96%。彭志妮等[25]利用蛹蟲草對大豆進(jìn)行了固體發(fā)酵，研究了發(fā)酵菌質(zhì)的抗氧化性變化，結(jié)果表明，發(fā)酵菌質(zhì)在22 d 抗氧化性能達(dá)到最大，ABTS+自由基清除率比發(fā)酵初期提高近3 倍，亞鐵還原能力（Ferric Reducing Ability of Plasma，F(xiàn)RAP）值提高近 2 倍。本研究以金針菇廢菇柄為發(fā)酵基質(zhì)，利用蛹擬青霉為發(fā)酵菌種，對金針菇菇柄進(jìn)行轉(zhuǎn)化，研究發(fā)酵菌質(zhì)多糖、蟲草素、蟲草酸、蛋白質(zhì)、氨基酸等活性物質(zhì)及總還原力和發(fā)酵菌質(zhì)對自由基的清除能力隨發(fā)酵時間的變化情況，為進(jìn)一步高值化綜合利用蛹蟲草和金針菇廢菇柄，研發(fā)相關(guān)高附加值產(chǎn)品，減少環(huán)境污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

蛹擬青霉菌種：江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室保藏；金針菇廢菇柄：徐州康盛食用菌有限公司提供。

1.1.2 試劑

DL-丙氨酸、L-鼠李糖、醋酸銨、苯酚、蛋白胨、甘露醇、高碘酸鈉、甲基紅、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、硫酸銅、濃硫酸、硼酸、葡萄糖、氫氧化鈉、無水乙醇、鹽酸、乙醇（95%）、茚三酮、氯仿、正丁醇、蟲草素、蟲草酸、乙酸、三氯乙酸（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；維生素B1、乙酰丙酮、蛋白胨、酵母浸出汁、瓊脂粉（均為生物試劑）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

NaIO4溶液：0.32 g NaIO4溶于 0.12 mol/L 的 HCl溶液中，定容至100 mL。

Nash 試劑：75 g 醋酸銨蒸餾水溶解，加1 mL 冰乙酸，1 mL 乙酰丙酮，定容至500 mL。

75 μmol/L 的 DPPH 溶液：稱取 3 mg DPPH 用100 mL 乙醇溶解即可。

1.2 儀器與設(shè)備

CW-2000 型超聲波微波協(xié)同萃取儀：新拓微波溶洋測試技術(shù)有限公司；TU-1810 型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；HYGⅡ型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊自動化有限公司；HH.BII.600型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；101-0E 型電熱恒溫干燥箱：北京市永光明醫(yī)療儀器；HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋、80-2 型臺式電動離心機(jī)：常州國華電器有限公司；SW-CJ-2FD 型雙人單面垂直凈化工作臺：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FW80型高速萬能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；FA2104N 型電子分析天平：上海精密儀器有限公司；SH220 石墨消解儀：海能儀器；LJG-18A 型冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵：上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司；Heating Bath：SENCO Technology Co.，Ltd。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基

1）斜面培養(yǎng)基——薩氏培養(yǎng)基（Sabouraud dextrose agar with yeast extract，SDAY）：4%葡萄糖，1 %蛋白胨，1%酵母浸膏，2%瓊脂。

2）液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5 %，KH2PO40.2 %，硫酸鎂0.1 %，維生素B110 mg/L，蒸餾水 1 000 mL，pH6.8。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基：金針菇廢菇柄段95 g，蛋白胨0.5 g，水 5%，pH 6.8；

1.3.2 菌種活化與種子液制備

將蛹擬青霉菌種接種到SDAY 斜面培養(yǎng)基上，置于22 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d～5 d，待菌絲長滿試管即可。

種子液制備：在500 mL 三角瓶中裝200 mL 液體種子培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌后接入經(jīng)活化后的蛹擬青霉斜面菌塊 3 塊～5 塊，每塊大小為 3 mm2～5 mm2，22 ℃，120 r/min 恒溫?fù)u瓶培養(yǎng) 3 d～6 d 即可。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵

料液比 1 ∶1.5（g/mL）；料層厚度 2 cm；接種量15 %；發(fā)酵溫度22 ℃；新鮮金針菇廢菇柄切成0.5 cm段，并按試驗(yàn)設(shè)計添加其它成分，滅菌后接入發(fā)酵菌種，置于恒溫箱中培養(yǎng)，定時取樣，冷凍干燥后粉碎，過40 目篩子后備用。

空白對照處理：取切成0.5 cm 段的新鮮金針菇廢菇柄，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的蛋白胨，料液比1∶1.5（g/mL），料層厚度2 cm，pH 6.8，滅菌后不接種，置于22 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按樣品處理方法進(jìn)行處理并測定。

1.3.4 多糖的測定

1.3.4.1 多糖的提取

采用超聲－微波協(xié)同輔助提取方法，按文獻(xiàn)[26]進(jìn)行。精密稱取0.5 g 樣品粉末，加50 mL 水，混勻，用超聲波微波協(xié)同萃取儀提取20 min，然后4 000 r/min 離心10 min，取上清液，沉淀加水按上述方法重復(fù)提取3 次，合并上清液，將上清液濃縮至1/3。向濃縮過的上清液中加入等體積的氯仿-正丁醇4 ∶1（體積比）混合液，震動搖晃20 min～30 min，靜置后去掉沉淀，重復(fù)3次，留取上層水相。向留取水相中加入3 倍95%乙醇，放入 4 ℃冰箱靜置 12 h，4 000 r/min 離心 10 min，得到沉淀，然后再將沉淀加入100 mL 的蒸餾水復(fù)溶，取1 mL 復(fù)溶的多糖溶液于50 mL 容量瓶中定容，備用。

1.3.4.2 多糖的測定

采用苯酚-硫酸法測定。

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

取不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液各2 mL，分別加入6 %的苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入5.0 mL 濃硫酸，搖勻，靜置5 min。置沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫，用紫外可見分光光度計在490 nm 下測定其吸光度。

用葡萄糖濃度作為橫坐標(biāo)，A490nm作為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立回歸方程。

2）樣品多糖含量的測定

精密吸取樣品處理液1 mL，置于試管中，加蒸餾水至2 mL。按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟進(jìn)行處理，用紫外可見分光光度計在490 nm 下測定其吸光度，以空白校正零點(diǎn)。

1.3.4.3 多糖含量計算

1.3.5 蟲草素含量測定

采用高壓液相色譜法，按文獻(xiàn)[27]方法測定。色譜柱：Waters C18（4.6 mm× 150 mm，5 μm）；流動相：15%甲醇+水；流速 1 mL/min；柱溫：20 ℃；紫外檢測波長260 nm，10 μL 進(jìn)樣。

標(biāo)曲制作：精密稱取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，用純水定容于5 mL 容量瓶中，配制成0.2 mg/mL 的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為母液進(jìn)行所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)品配置。釆用逐級稀釋法，依次吸取一定量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液按要求稀釋到EP 管中，使蟲草素濃度分別為150、100、50、25、0 μg/mL。分別吸取上述溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測定，記錄12.439 min 時色譜波峰呈現(xiàn)的峰面積。并求蟲草素濃度和峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。

樣品測定：精確稱取1 g 凍干發(fā)酵菌質(zhì)粉溶于100 mL 50%的乙醇，選用微波-超聲波協(xié)同萃取儀提取蟲草素。微波時間為60 s，功率為200 W，提取后離心，用 0.2 μm 水相微孔濾膜壓濾，取過濾液 10 μL 進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間定性、外標(biāo)法定樣，根據(jù)回歸方程計算提取液的蟲草素含量（μg/mL），并按公式計算得出樣品中的蟲草素含量。

1.3.6 蟲草酸含量測定

采用比色法測定。按文獻(xiàn)[28]進(jìn)行。

樣品蟲草酸提取：精密稱取0.5 g 樣品粉末，加50 mL 70%乙醇，混勻，用微波-超聲波協(xié)同萃取儀常溫下微波萃取80 s，然后離心取上清液，重復(fù)提取2 次，合并提取液，混勻，提取液用蒸餾水定溶至100 mL，待測。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取濃度為0.05 mg/mL 的甘露醇標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別用蒸餾水補(bǔ)充至1 mL，然后分別加入1 mL NaIO4溶液，混勻后，靜止10 min，再加入2 mL 1.0 g/L L-鼠李糖溶液，充分混勻后加入Nash 試劑4 mL，50 ℃水浴保溫15 min，取出后快速冷卻至室溫，用10 mm 光程的比色皿，在412 nm波長下測量吸光度，以蟲草酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程。

樣品測定：精密量取待測樣品溶液0.03 mL，加入10 mL 刻度試管中，補(bǔ)水至1 mL，空白對照管加蒸餾水1 mL，然后按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法進(jìn)行，測定其吸光度。蟲草酸含量按公式計算。

1.3.7 蛋白質(zhì)含量測定

采用凱氏定氮法測定，按文獻(xiàn)[27]方法進(jìn)行。

蛋白質(zhì)含量（g）=[總氮含量（g）-非蛋白氮含量（g）]×6.25

總氮含量計算：

式中：x 為樣品中氮含量，g/100 g；V1為樣品滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V2為空白滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V3為測定樣品時消化液的體積，mL；c 為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L；14.008 為每摩爾氮原子質(zhì)量，g/mol；m 為樣品的質(zhì)量，g。

非蛋白氮含量測定：采用三氯乙酸法測定非蛋白氮。按文獻(xiàn)[27]方法進(jìn)行。

1.3.8 氨基酸含量測定

采用茚三酮比色法，按文獻(xiàn)[27]方法進(jìn)行測定。

氨基酸含量的計算：

1.3.9 總還原力測定

按文獻(xiàn)[29]方法進(jìn)行。

發(fā)酵菌質(zhì)預(yù)處理：取發(fā)酵菌質(zhì)粉末5 g 加入三角瓶中，加水50 mL，超聲波提取30 min，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，定容至50 mL，備用。

還原力測定方法：采用鐵氰化鉀法測總還原力。向試管中依次加入2.5 mL pH 6.6 的磷酸鹽緩沖液，待測樣品0.5 mL，1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合后50 ℃水浴30 min，迅速冷卻后加入10%三氯乙酸2.5 mL，混勻后3 000 r/min 離心10 min，取上清液2.5 mL 加入蒸餾水2.5 mL 和FeCl30.1%溶液0.5 mL，靜止10 min，在波長為700 nm 下測定溶液吸光值，用吸光值表示還原力，吸光值越大還原力越強(qiáng)。

式中：A樣品是樣品反應(yīng)液的吸光值；A空白是以去離子水代替樣品的溶液的吸光值。

1.3.10 DPPH 自由基清除能力測定

DPPH 自由基清除能力測定按文獻(xiàn)[30]方法進(jìn)行。精確稱取1 g 凍干菌質(zhì)粉溶于100 mL 50 %的乙醇，用微波-超聲波協(xié)同萃取儀微波提取60 s，功率為200 W，4 000 r/min 離心5 min 后取上清液，定容至100 mL，然后取1 mL 定容到10 mL 容量瓶中，待測。

取待測樣品0.3 mL 于10 mL 試管中，加入0.2 mL的乙醇溶液，2.5 mL 的DPPH 溶液混合，置于暗處30 min，在517 nm 波長下測定吸光度，根據(jù)下列公式計算各樣品溶液對DPPH 自由基的清除率：

式中：A 為加樣品溶液與DPPH 溶液的吸光度；A0為不加樣品溶液的DPPH 溶液的吸光度；B 為不加DPPH 溶液的樣品溶液。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)試驗(yàn)所得的平均值，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。用Design-Expert 8.0.6.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌質(zhì)多糖含量的動態(tài)變化

根據(jù)測定葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y =0.067x-0.043，R2=0.992，y 為 490 nm 下吸光度值，x 為葡萄糖濃度（mg/mL）。

經(jīng)測定和計算得發(fā)酵菌質(zhì)中多糖含量隨發(fā)酵時間的變化情況如圖1 所示。

圖1 不同時間發(fā)酵菌質(zhì)中多糖含量Fig.1 The contents of polysaccharide in fermentation mycoplasm at different times

從圖1 可以看出，蛹擬青霉與金針菇廢菇柄進(jìn)行固體發(fā)酵過程中，發(fā)酵菌質(zhì)多糖含量出現(xiàn)先降低然后升高最后平穩(wěn)降低的趨勢，這與其發(fā)酵過程中多糖的先期被降解利用有關(guān)，在發(fā)酵初期多糖被分解成小分子物質(zhì)，以便合成蛹擬青霉菌體生長所需的物質(zhì)，中期由于蛹擬青霉自身的合成作用使多糖含量增加，后期由于菌體生長緩慢或到達(dá)衰亡期，使多糖不能繼續(xù)合成，而使多糖含量有所減少。當(dāng)發(fā)酵28 d 時，發(fā)酵菌質(zhì)中多糖含量達(dá)到最高為717.68 mg/g，此時發(fā)酵菌質(zhì)多糖含量是對照組多糖含量的1.92 倍。試驗(yàn)組與對照組比較可知，對照組多糖基本沒有發(fā)生變化，且含量較低，經(jīng)方差分析，試驗(yàn)組和對照組多糖的含量變化具有顯著差異（p＜0.01）。

2.2 發(fā)酵菌質(zhì)蟲草素含量的動態(tài)變化

根據(jù)測定蟲草素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y =41.42x+92.33，R2=0.997，y 為 260 nm 下 12.439 min 峰面積，x 為蟲草素濃度（μg/mL）。

經(jīng)測定和計算得發(fā)酵菌質(zhì)中蟲草素含量隨發(fā)酵時間的變化情況如圖2 所示。

圖2 不同時間發(fā)酵菌質(zhì)中蟲草素含量Fig.2 The contents of cordycepin in fermentation mycoplasm at different times

從圖2 可以看出發(fā)酵菌質(zhì)中試驗(yàn)組的蟲草素含量隨發(fā)酵時間增加不斷增加，當(dāng)發(fā)酵時間為28 d 時，蟲草素含量達(dá)到最大為90.9 μg/g，之后開始下降，而對照組無蟲草素產(chǎn)生。方差分析表明試與對照組存在顯著差異（p＜0.01）。試驗(yàn)表明蟲草素含量的變化與發(fā)酵菌質(zhì)中蛹擬青霉菌體的生長量相關(guān)，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌體數(shù)量不斷增加，當(dāng)?shù)竭_(dá)最大生長點(diǎn)后，開始下降，符合蛹擬青霉菌體的生長規(guī)律，其產(chǎn)生的蟲草素也是與蛹擬青霉菌體量分不開的，蟲草素的產(chǎn)生必定伴隨著蛹蟲草菌體代謝量的增多，后期含量減少可能是由于蟲草素不穩(wěn)定，產(chǎn)生分解所致。

2.3 發(fā)酵菌質(zhì)蟲草酸含量的動態(tài)變化

經(jīng)測定蟲草酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=0.009 8x+0.015 3，R2=0.995 3，y 為 412 nm 下吸光度值，x 為蟲草酸濃度（μg/mL）。

經(jīng)測定和計算得發(fā)酵菌質(zhì)中蟲草酸含量如圖3 所示。

圖3 不同時間發(fā)酵菌質(zhì)中蟲草酸含量Fig.3 The contents of cordycepic acid in fermentation mycoplasm at different times

從圖3 可知，試驗(yàn)組發(fā)酵菌質(zhì)中蟲草酸含量隨發(fā)酵時間增加而增加，然后開始下降，當(dāng)發(fā)酵28 d 時，蟲草酸含量達(dá)到最大為25.6 mg/g，是對照組蟲草酸含量的2.34 倍，對照組蟲草酸含量基本保持不變，經(jīng)方差分析兩者具有顯著差異（p＜0.01）。蟲草酸含量隨發(fā)酵時間的變化情況與蛹擬青霉菌體生長規(guī)律相似，表明了蟲草酸的產(chǎn)生與蛹擬青霉菌體的代謝有關(guān)，后期含量減少可能是由于菌體代謝物質(zhì)不足，而將其分解作為代謝物質(zhì)進(jìn)行利用所致。

2.4 發(fā)酵菌質(zhì)蛋白質(zhì)含量的動態(tài)變化

經(jīng)測定和計算得發(fā)酵菌質(zhì)中蛋白質(zhì)含量隨時間變化情況如圖4。

圖4 不同時間發(fā)酵菌質(zhì)中蛋白質(zhì)含量Fig.4 The contents of protein in fermentation mycoplasm at different times

從圖4 可知，試驗(yàn)組發(fā)酵菌質(zhì)的蛋白質(zhì)含量變化較大，蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)先降低再升高，然后下降，最后平穩(wěn)的走勢，組間具有顯著差異（p＜0.01），而對照組蛋白質(zhì)含量變化不明顯（p＞0.01）。試驗(yàn)組與對照組間具有明顯著差異（p＜0.01）。當(dāng)發(fā)酵21 d 時試驗(yàn)組蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高396.6 mg/g，是對照組的2.39 倍。試驗(yàn)組出現(xiàn)蛋白質(zhì)含量的先期下降，然后升高，接著出現(xiàn)下降至平穩(wěn)的趨勢，表明培養(yǎng)初期蛋白質(zhì)被分解，以便蛹擬青霉菌體的生長，出現(xiàn)蛋白質(zhì)含量下降的走勢，但隨著時間的增加，蛹擬青霉菌體開始生長，蛋白合成能力增加，使發(fā)酵菌質(zhì)蛋白含量增加，當(dāng)達(dá)到菌體穩(wěn)定期時，蛋白達(dá)到最高，然后菌體進(jìn)入衰亡期，使自身蛋白分解，表現(xiàn)出蛋白含量逐漸降低的趨勢。

2.5 發(fā)酵菌質(zhì)氨基酸含量的動態(tài)變化

經(jīng)試驗(yàn)測得氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5，其回歸方程為：y=0.060 4x+0.060 5，R2=0.991 3。y 為吸光度值，x為氨基酸濃度（μg/mL）。

發(fā)酵菌質(zhì)中氨基酸含量如圖5 所示。

從圖5 可知，試驗(yàn)組氨基酸含量在發(fā)酵24 d 時達(dá)到最高為230.88 mg/g，是對照組的4.52 倍。試驗(yàn)組氨基酸含量出現(xiàn)隨發(fā)酵時間增加而增加，然后達(dá)到最高點(diǎn)后開始降低，而對照組的氨基酸含量基本保持不變。試驗(yàn)組氨基酸含量從培養(yǎng)初期就逐漸開始增加，表明蛹擬青霉菌體代謝分解了金針菇菇柄的組成蛋白質(zhì)產(chǎn)生了氨基酸用于自身的合成代謝，當(dāng)金針菇菇柄成分被分解完后達(dá)到平衡，后期由于蛹擬青霉的合成代謝活動使氨基酸含量不斷減少。

圖5 不同時間發(fā)酵菌質(zhì)中氨基酸含量Fig.5 The contents of amino acid in fermentation mycoplasm at different times

2.6 發(fā)酵菌質(zhì)總還原力的動態(tài)變化

在不同發(fā)酵時間發(fā)酵菌質(zhì)還原力變化情況如圖6。

圖6 不同時間發(fā)酵菌質(zhì)還原力Fig.6 The reducing ability of fermentation mycoplasm in different time

從圖6 分析可知，不同時間的發(fā)酵菌質(zhì)還原力有顯著變化（p＜0.01），在開始階段比較低，然后逐漸升高，在21 d 到28 d 期間達(dá)到最高，然后隨著發(fā)酵時間的延長還原力出現(xiàn)了緩慢降低。而對照組的還原力沒有發(fā)生顯著變化（p＞0.05）。試驗(yàn)組還原力大小出現(xiàn)的變化情況，與多糖和蟲草素含量的變化情況基本一致，可以認(rèn)定還原力主要是由多糖和蟲草素產(chǎn)生的。

2.7 發(fā)酵菌質(zhì)對DPPH自由基清除能力的變化

發(fā)酵菌質(zhì)在不同發(fā)酵時間對DPPH 自由基清除能力的變化情況如圖7。

圖7 發(fā)酵菌質(zhì)對DPPH 自由基的清除能力Fig.7 The capacity to scavenging DPPH free radical

從圖7 可以看出，金針菇菇柄發(fā)酵菌質(zhì)對DPPH自由基的清除能力表現(xiàn)為發(fā)酵初期有所降低，中期逐步增強(qiáng)，后期略有降低的趨勢（p＜0.01），而對照組基本保持平穩(wěn)（p＞0.05）。對DPPH 自由基的清除能力在發(fā)酵28 d 最高達(dá)到72.37%，比未發(fā)酵菌質(zhì)清除DPPH自由基的能力提高了59.5%，方差分析表明兩者有極顯著差異（p＜0.01）。對DPPH 自由基有清除能力的物質(zhì)主要是多糖和蟲草素，從發(fā)酵菌質(zhì)多糖和蟲草素的含量來看，在28 d 也是達(dá)到了最高，清除自由基能力與蟲草素和多糖含量有關(guān)。

3 結(jié)論

通過對蛹擬青霉對金針菇廢菇柄進(jìn)行固體發(fā)酵過程中發(fā)酵菌質(zhì)的活性物質(zhì)在不同培養(yǎng)時間的動態(tài)變化研究表明，發(fā)酵菌質(zhì)中活性物質(zhì)出現(xiàn)了峰谷變化，在發(fā)酵中期隨著時間的增加物質(zhì)含量逐漸增加，與未發(fā)酵的金針菇菌質(zhì)相比，主要成分和抗氧化能力均有大幅度增加，兩者具有顯著差異。各種活性物質(zhì)達(dá)到最大的發(fā)酵時間略有不同，多糖、蟲草素、蟲草酸的含量均在28 d 達(dá)到最高，蛋白質(zhì)和氨基酸含量最高的發(fā)酵時間分別是21 d 和24 d。發(fā)酵菌質(zhì)的抗氧化能力在21 d～28 d 之間達(dá)到最高，對DPPH 的清除能力在28 d 達(dá)到最高，發(fā)酵菌質(zhì)的活性物質(zhì)變化與蛹擬青霉的菌體生長量有相關(guān)性。發(fā)酵菌質(zhì)的抗氧化能力變化與活性物質(zhì)含量變化有關(guān)。本研究為進(jìn)一步探討蛹擬青霉對金針菇廢菇柄的發(fā)酵規(guī)律和進(jìn)一步研究開發(fā)高值化蛹擬青霉及金針菇菇柄產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。