李夢(mèng)穎，楊曄，2，董媛媛，閆榮榮，尹登科，2，3，*

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽合肥230038；3.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230012）

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，多寄生在馬尾松或赤松的根部。茯苓是常用的藥食兩用植物，其食用價(jià)值和藥用價(jià)值廣泛，茯苓的多重功能也為發(fā)酵酒提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。茯苓中要含有多糖、三萜類化合物、甾醇類化合物、蛋白質(zhì)[2-6]等，黃聰亮等[7]研究發(fā)現(xiàn)茯苓多糖能夠有效的降低血糖，且能改善Ⅱ型糖尿病小鼠的糖耐量的異常，同時(shí)現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，茯苓多糖具有抗腫瘤作用[8]、抗氧化作用[9]、防結(jié)石作用與其利尿作用[10]、免疫作用[11]、養(yǎng)心安神、健胃消食、降脂減肥、美容等藥用價(jià)值及營(yíng)養(yǎng)保健作用[12]等。

丹參為唇形科鼠尾草植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge 的干燥根及根莖[13]，它是唇形科的最大屬之一[14-15]。丹參發(fā)酵后制作飲片做丹參茶飲用，酸棗仁丹參茶飲可有效改善失眠患者的睡眠質(zhì)量[16-17]，同時(shí)中藥保健品中加入丹參可以增強(qiáng)免疫力[18]。黨竟兢等[19]研究發(fā)現(xiàn)由丹參組成的中藥方劑對(duì)糖尿病小鼠有明顯的治療效果。

雙向發(fā)酵又稱共發(fā)酵，雙向發(fā)酵是指采用具有一定生物活性的中藥材，再將經(jīng)過(guò)活化的菌種加入其中進(jìn)行發(fā)酵[20]。其雙向性體現(xiàn)在藥性基質(zhì)不僅滿足了真菌的要求，又可被真菌的生長(zhǎng)代謝所改變，從而改變自身的成分、產(chǎn)生新的性味功能等[21]。同時(shí)雙向發(fā)酵能夠增強(qiáng)藥物的性質(zhì)，提高吸收能力[22-24]。虞泓等[25]研究了茯苓與蛹蟲(chóng)草固體共發(fā)酵，共發(fā)酵后體系中蟲(chóng)草素、多糖、總多糖含量均明顯升高。茯苓多糖和丹參均對(duì)糖尿病有一定的治療作用，作者查閱文獻(xiàn)，甚少有茯苓-丹參共發(fā)酵的報(bào)導(dǎo)，故進(jìn)行此試驗(yàn)來(lái)研究茯苓-丹參共發(fā)酵對(duì)多糖和總黃酮含量的影響及共發(fā)酵體系對(duì)糖尿病小鼠降糖作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

YM100 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；HERAcell240 恒溫培養(yǎng)箱：美國(guó) Thermo 公司；THZ-82A 氣浴恒溫震蕩器：常州中誠(chéng)儀器制造有限公司；SCW-CJ-2FD 型潔凈工作臺(tái)：蘇州宏瑞凈化科技有限公司；SCIENTZ-ⅡD 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：河北潤(rùn)聯(lián)科技開(kāi)發(fā)有限公司；UV-1000 紫外分光光度計(jì)：翱藝儀器（上海）有限公司；安穩(wěn)型血糖儀：三諾傳感股份有限公司。

茯苓菌：金寨縣金山寨食（藥）用菌種植專業(yè)合作社；丹參：購(gòu)于安徽省亳州市亳州藥市并經(jīng)中藥學(xué)教授鑒定合格；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）：美國(guó) Sigma 公司；葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、酵母膏、蛋白胨等（均為國(guó)產(chǎn)分析純）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性 ICR 小鼠，SPF 級(jí)，體重 18 g～22 g，安徽醫(yī)科大學(xué)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基[26]：葡萄糖30 g、酵母膏3.9 g、蛋白胨5.1 g、磷酸氫二鉀1 g、七水硫酸鎂0.5 g，加水至1L，初始 pH 6.7，121.3 ℃滅菌 30 min，冷卻備用。

藥性培養(yǎng)基：丹參粉末+基礎(chǔ)培養(yǎng)基，初始pH 6.7，121.3 ℃滅菌 30 min，冷卻備用。

1.2.2 茯苓生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

在超凈臺(tái)上接種茯苓菌塊于裝有240 mL 液體培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶中，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min，在28 ℃條件下震蕩培養(yǎng)，間隔 12 h 取樣 4 mL 測(cè)定OD600。

1.2.3 各成分含量測(cè)定方法

采用硫酸-苯酚法測(cè)定總糖含量[27]；采用3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS 法）測(cè)定單糖糖含量[27]；采用總糖-單糖=胞外多糖來(lái)計(jì)算胞外多糖含量；采用硝酸鋁比色法測(cè)定總黃酮含量[28]。

1.2.4 發(fā)酵時(shí)間和丹參添加量對(duì)生物量和胞外多糖含量的影響試驗(yàn)

取500 mL 干凈錐形瓶，分別加入120 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入不同質(zhì)量的丹參粉末形成藥性培養(yǎng)基，接種體積分?jǐn)?shù)為6%茯苓菌種子液，接種完畢后于搖床中震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度26 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min。培養(yǎng)結(jié)束后真空抽濾分離得濾液和濾渣。將收集的各組濾渣60 ℃恒溫干燥24 h 后稱定質(zhì)量M，減去原先加入的丹參量M0即得生物量（M-M0）。取濾液，加入3 倍量的體積分?jǐn)?shù)為95 %乙醇，4 ℃放置12 h 后于6 000 r/min、4 ℃的條件下離心15 min，得沉淀和上清液，離心后的上清液測(cè)定總糖和單糖用來(lái)計(jì)算胞外多糖含量。同上操作，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入丹參粉末形成質(zhì)量濃度為1.0 g/mL 的藥性培養(yǎng)基，分別于培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d 后計(jì)算生物量和胞外多糖含量。

1.2.5 茯苓-丹參共發(fā)酵對(duì)體系中胞內(nèi)多糖和胞外多糖及總黃酮含量的影響試驗(yàn)

試驗(yàn)分為茯苓對(duì)照組、丹參對(duì)照組、茯苓-丹參共發(fā)酵組。接種體積分?jǐn)?shù)為6%茯苓菌種子液，培養(yǎng)基中丹參質(zhì)量濃度為1.0 g/mL。培養(yǎng)5 d 后，真空抽濾，分離得濾液和濾渣。取濾渣加水混勻超聲破碎細(xì)胞后測(cè)胞內(nèi)多糖含量；取濾液加入3 倍量的體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇，4 ℃放置 12 h 后于 6 000 r/min、4 ℃的條件下離心15 min，離心后的上清液測(cè)定總糖和單糖用來(lái)計(jì)算胞外多糖含量，沉淀加水混勻測(cè)定總黃酮含量。

1.2.6 糖尿病小鼠降血糖和糖耐量試驗(yàn)方法

1.2.6.1 糖尿病動(dòng)物模型的建立

采用高糖高脂飼料+小劑量鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）方式誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型。高糖高脂飼料（蔗糖∶豬油∶奶粉∶雞蛋∶普通飼料質(zhì)量比=30 ∶20 ∶4 ∶2 ∶63）飼喂小鼠 1 周。在第 1 周末，小鼠禁食 12 h，按照100 mg/kg 劑量一次性腹腔注射6 mg/mL STZ（pH 4.2，0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液冰浴中新鮮配置），之后繼續(xù)飼喂高糖高脂飼料喂養(yǎng)，小鼠禁食12 h 測(cè)空腹血糖，以血糖值大于11.1 mmol/L 為糖尿病模型建模成功。

1.2.6.2 發(fā)酵液的濃縮

各組發(fā)酵液真空抽濾，分離濾液，各組濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45 ℃、40 r/min 條件下濃縮，濃縮前后的體積比為10 ∶1，用于降血糖和糖耐量試驗(yàn)小鼠灌胃。

1.2.6.3 動(dòng)物分組與給藥

建模成功后，選建模成功糖尿病小鼠，將其隨機(jī)分成4 組，每組8 只，分別是：糖尿病模型對(duì)照組；陽(yáng)性藥灌胃組（二甲雙胍，0.19 g/kg）；茯苓對(duì)照組（0.1 mL/20 g）；丹參對(duì)照組（0.1 mL/20 g）；茯苓-丹參共發(fā)酵組（0.1 mL/20 g）；另外，隨機(jī)取8 只正常小鼠為正常對(duì)照組（等量生理鹽水）。各組連續(xù)給藥10 d。

1.2.6.4 血糖測(cè)定

小鼠在灌胃第5 天和第10 天后，分別在禁食12 h后，斷尾取血，用血糖儀測(cè)定血糖值。小鼠在灌胃10 d后，分別在禁食12 h 后，各組小鼠口服葡萄糖，劑量為2.5 g/kg，斷尾取血，用血糖儀分別測(cè)定 0、30、60、90、120 min 的血糖值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過(guò)SPSS 23.0 軟件進(jìn)行處理，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯苓生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

通過(guò)比濁法來(lái)測(cè)定OD600并繪制茯苓生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 茯苓的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Poria cocos

由圖1 可知，茯苓發(fā)酵1 d 后OD600值迅速上升，直到第4 天的OD600達(dá)到2.347，表明該菌在此時(shí)間段處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)活力最強(qiáng)。4 d 后曲線趨于一條直線，表明該菌一直處于一種平衡的狀態(tài)，進(jìn)入穩(wěn)定期。因此，種子液應(yīng)選擇茯苓發(fā)酵1 d～2 d 內(nèi)的發(fā)酵液，此時(shí)菌體生長(zhǎng)迅速且活性強(qiáng)，適合接種，確定種子液的最佳培養(yǎng)時(shí)間為茯苓-丹參的雙向發(fā)酵提供依據(jù)。

2.2 丹參添加量對(duì)共發(fā)酵體系胞外多糖含量和茯苓菌生物量的影響

丹參的添加量的變化對(duì)共發(fā)酵體系中的胞外多糖含量和茯苓菌生物量具有顯著的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 丹參添加量對(duì)胞外多糖和生物量的影響（n=3）Fig.2 Effect of the amount of Salvia miltiorrhiza on extracellular polysaccharides and biomass（n=3）

如圖2 所示，隨著培養(yǎng)基中丹參添加量的增加，胞外多糖的含量則表現(xiàn)為下降-上升-基本平衡的變化趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)基中丹參的質(zhì)量濃度為1.0 g/L 或1.5 g/L時(shí)胞外多糖含量最大。但茯苓菌的生物量隨著丹參質(zhì)量濃度的增加而逐漸減小，說(shuō)明丹參的加入會(huì)抑制茯苓菌絲體的生長(zhǎng)。因此，為了保證茯苓的生長(zhǎng)以及發(fā)酵體系具有較多的胞外多糖，選擇培養(yǎng)基中丹參質(zhì)量濃度為1.0 g/L 來(lái)進(jìn)行后期試驗(yàn)。

丹參的添加量對(duì)共發(fā)酵體系中固體產(chǎn)物形態(tài)具有一定的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 丹參添加量對(duì)共發(fā)酵體系固體產(chǎn)物的影響Fig.3 Effect of the amount of Salvia miltiorrhiza on Cofermentation system solid product

由圖3 可知，丹參的添加量對(duì)共發(fā)酵體系中固體產(chǎn)物形態(tài)具有一定的影響，未添加丹參組的菌絲顏色呈現(xiàn)乳白色，而隨著丹參添加量的增加發(fā)酵體系固體產(chǎn)物中白色茯苓菌絲逐漸減少，與上述生物量試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)共發(fā)酵體系中胞外多糖含量和生物量的影響

為了更好地確定最佳共發(fā)酵周期，在以丹參質(zhì)量濃度1.0 g/mL 培養(yǎng)基中對(duì)茯苓-丹參共發(fā)酵的時(shí)間進(jìn)行確定，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)胞外多糖和生物量的影響（n=3）Fig.4 Effect of fermentation time on extracellular polysaccharides and biomass（n=3）

由圖4 所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，生物量在不斷增加，而在第7 天左右生物量的增加變慢并保持一定的水平，說(shuō)明共發(fā)酵體系的菌絲生長(zhǎng)進(jìn)入了穩(wěn)定期。與生物量的變化不同的是胞外多糖含量先增加再降低，在第5 天時(shí)胞外多糖含量達(dá)到最大，隨后兩天保持平穩(wěn)，但隨著發(fā)酵時(shí)間的繼續(xù)增加，胞外多糖含量下降。為了保證發(fā)酵體系具有較多的胞外多糖，選取最佳共發(fā)酵時(shí)間為5 d。

2.4 茯苓-丹參共發(fā)酵對(duì)體系中胞內(nèi)多糖和胞外多糖及總黃酮含量的影響

茯苓-丹參共發(fā)酵體系與單一體系中胞外多糖、胞內(nèi)多糖和總黃酮的含量變化見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵液中胞外多糖、胞內(nèi)多糖、總黃酮的含量（，n=3）Table 1 Content of extracellular polysaccharide，intracellular polysaccharide and total flavonoids in fermentation broth（，n=3）

表1 發(fā)酵液中胞外多糖、胞內(nèi)多糖、總黃酮的含量（，n=3）Table 1 Content of extracellular polysaccharide，intracellular polysaccharide and total flavonoids in fermentation broth（，n=3）

注：與茯苓組相比，*表示P＜0.05 差異顯著；與丹參組相比，#表示P＜0.05 差異顯著。

總黃酮/（mg/mL）茯苓 4.01±0.36 4.16±0.38 0.21±0.06茯苓-丹參 15.74±0.04*# 1.26±0.06* 1.04±0.27#丹參 7.16±0.18 2.31±0.02 3.72±0.11分組 胞外多糖/（mg/mL）胞內(nèi)多糖/（mg/mL）

崔培梧等[29]將茯苓菌與多種中藥共發(fā)酵，結(jié)果表明茶葉、三七、葛根等表現(xiàn)出極強(qiáng)的胞外多糖合成促進(jìn)能力；鹿銜草抑制茯苓胞外多糖的合成或分泌。如表1 所示，茯苓-丹參共發(fā)酵體系中胞外多糖含量與單一茯苓組、丹參組相比均顯著升高（P＜0.05），茯苓-丹參共發(fā)酵體系中胞內(nèi)多糖含量與單一茯苓組相比顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明丹參的加入促進(jìn)茯苓在生長(zhǎng)代謝中向培養(yǎng)基/外界環(huán)境中分泌胞外多糖，可能與丹參中含有促進(jìn)胞外多糖分泌的化學(xué)物質(zhì)有關(guān)，但其機(jī)制并不明確，有待于進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。楊立啟等[30]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌Lp15 發(fā)酵柑橘全果汁過(guò)程中總黃酮含量的變化基本是先發(fā)生下降而后呈現(xiàn)一定程度上的增加。茯苓-丹參共發(fā)酵體系中總黃酮含量與單一丹參組相比顯著降低（P＜0.05）；與單一茯苓組相比顯著升高（P＜0.05），這可能是茯苓-丹參共發(fā)酵體系中茯苓菌的生長(zhǎng)抑制了丹參總黃酮的溶出，也有可能是胞外多糖的增加影響了總黃酮的含量，具體原因還需要進(jìn)一步探討。將丹參加入到共發(fā)酵體系中提高了胞外多糖的含量，并且由于丹參的加入將共發(fā)酵體系中引入了總黃酮。

2.5 不同發(fā)酵體系對(duì)小鼠血糖和糖耐量的影響

不同發(fā)酵體系對(duì)小鼠血糖和糖耐量的影響不同，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 各發(fā)酵體系對(duì)小鼠血糖值的影響Fig.5 Effect of various fermentation systems on blood glucose levels in mice

由圖5 可以看出，灌胃5、10 d 后，茯苓-丹參組與正常組、模型組、茯苓組、丹參組的血糖值相比均有顯著性差異（P＜0.05），茯苓-丹參組與模型組、茯苓組、丹參組相比顯著降低了小鼠血糖值（P＜0.05），茯苓-丹參組與陽(yáng)性藥相比血糖值無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。這表明共發(fā)酵體系能有效降低糖尿病小鼠的血糖，并且其效果接近達(dá)到陽(yáng)性藥二甲雙胍的降血糖效果。

糖耐量試驗(yàn)（glucose tolerance test，OGTT）是檢查機(jī)體血糖調(diào)節(jié)機(jī)能的一種方法，口服糖耐量試驗(yàn)在連續(xù)灌胃小鼠10 d 后進(jìn)行，共發(fā)酵體系與單一體系對(duì)小鼠糖耐量的影響見(jiàn)表2。

如表2 所示，模型組小鼠血糖水平在給予葡萄糖后30 min 達(dá)到最大值，盡管30 min 后血糖開(kāi)始持續(xù)下降，但120 min 后仍處于一個(gè)較高的水平；與模型組比較，茯苓-丹參組小鼠在90 min 和120 min 的血糖水平明顯降低（P＜0.05）；與茯苓組和丹參組相比，茯苓-丹參組小鼠分別在 90、120 min 和 30、60、90、120 min 的血糖水平明顯降低（P＜0.05）。這表明共發(fā)酵體系的發(fā)酵液能提高糖尿病小鼠的葡萄糖耐受力，改善葡萄糖耐量的異常。共發(fā)酵體系濃縮發(fā)酵液中的主要成分為胞外多糖、胞內(nèi)多糖、總黃酮、培養(yǎng)基。共發(fā)酵體系的濃縮發(fā)酵液能降低糖尿病小鼠的血糖、改善葡萄糖耐量的異常，這可能是由于共發(fā)酵體系中胞外多糖的含量較多，茯苓多糖能夠有效的降低血糖，且能改善Ⅱ型糖尿病小鼠的糖耐量的異常[7]。丹參加入后，共發(fā)酵體系與單一茯苓發(fā)酵體系相比大大增加了胞外多糖的含量，因此，共發(fā)酵體系中的降血糖活性成分可能是茯苓胞外多糖?？煽紤]將茯苓-丹參共發(fā)酵制得的發(fā)酵液進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成保健品，投入于市場(chǎng)。

表2 各發(fā)酵體系對(duì)小鼠糖耐量的影響（，n=6）Table 2 Effect of various fermentation systems on glucose tolerance in mice（，n=6） mmol/L

表2 各發(fā)酵體系對(duì)小鼠糖耐量的影響（，n=6）Table 2 Effect of various fermentation systems on glucose tolerance in mice（，n=6） mmol/L

注：與正常組相比，*表示P＜0.05 差異顯著；與模型組相比，#表示P＜0.05 差異顯著；與茯苓組相比，a 表示P＜0.05 差異顯著；與丹參組相比，b表示P＜0.05 差異顯著。

分組 0 min 30 min 60 min 90 min 120 min正常 6.85±0.75ab 10.51±0.83ab 10.34±0.12ab 8.55±0.75ab 7.32±0.20ab陽(yáng)性藥 9.12±2.30#b 19.95±6.55*b 13.94±7.71*ab 10.79±5.74*#ab 8.85±3.85#ab模型 18.34±0.96*ab 28.2±0.50*a 23.12±0.55* 20.75±0.05* 20.75±0.45*a茯苓 14.56±1.25*# 23.12±5.74* 21.35±2.45* 19.25±6.45* 16.93±6.12*#茯苓-丹參 9.15±2.35#ab 20.80±0.22*b 19.15±1.45*b 15.30±0.80*#ab 9.45±0.35#ab丹參 22.5±2.10*# 27.40±1.31* 26.15±1.35* 22.35±2.47* 20.05±0.45*

3 結(jié)論

本研究采用茯苓真菌作為發(fā)酵菌株，丹參作為藥性基質(zhì)，在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行雙向發(fā)酵試驗(yàn)。結(jié)果表明種子液的最佳培養(yǎng)時(shí)間為1 d～2 d，培養(yǎng)基中丹參最佳質(zhì)量濃度為1 g/mL，最佳雙向發(fā)酵時(shí)間為5 d。茯苓-丹參共發(fā)酵體系與單一茯苓體系相比發(fā)酵液中具有更多的胞外多糖、胞內(nèi)多糖，并引入了總黃酮，共發(fā)酵的發(fā)酵液能有效降低糖尿病小鼠的血糖，提高糖尿病小鼠的葡萄糖耐受力。本試驗(yàn)制得的茯苓-丹參共發(fā)酵液具有潛在降血糖作用，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的價(jià)值，可對(duì)茯苓-丹參共發(fā)酵的條件進(jìn)一步優(yōu)化并考慮投入市場(chǎng)服務(wù)于養(yǎng)生保健事業(yè)。