周露露 蔡明軍 王慧利 王宏達(dá)

摘?要?搭建了一種聯(lián)用超分辨熒光和三維形貌顯微成像系統(tǒng)（Correlative super-resolution fluorescence and three-dimensional topography imaging microscopy），以聚合纖維狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）為例，評(píng)價(jià)了此聯(lián)用系統(tǒng)的性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此聯(lián)用儀器具有納米級(jí)分辨率的三維形貌及具體成分的定位分布成像功能，可實(shí)現(xiàn)在形貌圖中定位具體成分的功能，表明此聯(lián)用儀器可應(yīng)用于研究分析細(xì)胞骨架及細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)（如細(xì)胞膜蛋白質(zhì)聚集體的組成和分布特性等）方面， 此聯(lián)用系統(tǒng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞?超分辨熒光顯微鏡;原子力顯微鏡;聯(lián)用

1?引 言

原子力顯微鏡（Atomic force microscopy， AFM）通過檢測(cè)針尖和樣品間微弱的相互作用力獲取樣品表面的各類信息[1]，是研究生物樣品的有力工具，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如高分辨率（X、Y軸側(cè)向分辨率為納米級(jí)，Z軸垂直分辨率高達(dá)0.1 nm），無需對(duì)樣品進(jìn)行固定染色處理，可以在溶液或近似生理環(huán)境中對(duì)生物樣品成像。然而，AFM因缺乏特異性標(biāo)記，難以提供分子種類的信息。超分辨熒光顯微鏡（Super-resolution fluorescence microscopy， SRM）[2，3]是一類光學(xué)成像技術(shù)的總稱，根據(jù)成像原理可分為兩類：一類是基于特殊強(qiáng)度分布照明光場(chǎng)的超分辨顯微成像，如受激發(fā)射損耗顯微鏡（Stimulated-emission depletion， STED）[4]和結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（Structure illumination microscopy， SIM）[5]; 另一類是基于單分子定位技術(shù)成像的超分辨率熒光顯微成像，如光激活定位顯微鏡（Photoactivated localization microscopy， PALM）[6]和直接隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡（Stochastic optical reconstruction microscopy， dSTORM）[7]。SRM突破了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的光學(xué)衍射極限，其成像分辨率低至10 nm，為生物樣品的研究提供了有利力的分析手段。此外，超分辨成像技術(shù)可通過結(jié)合多色標(biāo)記方法實(shí)現(xiàn)對(duì)多種成分的同時(shí)定位，可用于研究分析不同成分間的相互作用[8]。然而，SRM在三維形貌成像和Z軸垂直分辨率方面仍有明顯不足。

雖然AFM和SRM均是先進(jìn)的單分子成像技術(shù)，為單分子水平研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐，但這兩種成像技術(shù)均存在自身的局限性，無法用于更復(fù)雜的生物學(xué)體系，如直接觀察研究細(xì)胞膜上的蛋白聚集體的組成成分及這些成分間的相互作用關(guān)系等。近年來，為了克服單個(gè)儀器的技術(shù)限制，獲取有關(guān)樣品的更綜合全面信息，研究者致力于兩種及兩種以上儀器間聯(lián)用系統(tǒng)的研發(fā)[9，10]。由于AFM和SRM成像技術(shù)均能夠在單分子水平及生理?xiàng)l件下實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品的成像，而且SRM可彌補(bǔ)AFM缺乏特異性標(biāo)記的固有缺點(diǎn)，聯(lián)用AFM-SRM的顯微鏡成為儀器研發(fā)的熱點(diǎn)領(lǐng)域。Diaspro研究組搭建了AFM-STED及AFM-STORM聯(lián)用顯微鏡，并對(duì)細(xì)胞上的微管進(jìn)行了聯(lián)用成像[11，12]; Fang研究組將AFM和STED聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞絲狀偽足同步采集AFM和STED圖像[13]; Odermatt等搭建了AFM-PALM聯(lián)用系統(tǒng)并用于活細(xì)胞成像[14]。這些研究結(jié)果表明，AFM和SRM的聯(lián)用有助于獲取更綜合和互補(bǔ)的信息，從而能夠更加深入地獲取樣品信息。近年來，本研究組分別利用AFM和dSTORM成像技術(shù)對(duì)細(xì)胞膜的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究[15～18]，但由于AFM和SRM各自的局限性，一些復(fù)雜的細(xì)胞膜相關(guān)問題（如膜蛋白聚集體的組成成分及聚集體中成分間的相互作用關(guān)系等）無法通過單獨(dú)的AFM或SRM成像技術(shù)解決。

為實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞膜形貌圖中對(duì)多種蛋白分子的精確定位，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)膜蛋白聚集體的具體組成成分和成分間相互作用關(guān)系的研究，選擇分辨率最高的超分辨熒光顯微鏡dSTORM和AFM搭建聯(lián)用顯微鏡。本研究構(gòu)建了三維超分辨熒光和形貌顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)兩種成像技術(shù)對(duì)同一樣品的聯(lián)用成像，并優(yōu)化了儀器結(jié)構(gòu)，通過對(duì)體外聚合纖維狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）的聯(lián)用成像，考察了此聯(lián)用儀器的性能。本研究為后續(xù)利用AFM-dSTORM聯(lián)用顯微鏡在單分子水平及近似生理環(huán)境的條件下同時(shí)將多種蛋白分子的精確定位與整體的細(xì)胞膜形貌關(guān)聯(lián)，進(jìn)而定量研究細(xì)胞膜上的蛋白聚集體提供了技術(shù)支撐。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

自行搭建的三維超分辨熒光和形貌顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng); 5500掃描探針顯微鏡（美國(guó)Agilent公司）; Ti-E倒置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）; DNP-S型AFM探針（美國(guó)Bruker公司）; CFI Apo TIRF 100×物鏡（日本Nikon公司）; iXon Ultra 888型EMCCD相機(jī)（英國(guó)Andor公司）; MDL-Ⅲ-405 nm-100 mW半導(dǎo)體激光器、MRL-FN-639 nm-500 mW固態(tài)激光器、MGL-FN-532 nm-500 mW固態(tài)激光器（長(zhǎng)春新產(chǎn)業(yè)光電技術(shù)有限公司）; AOTFnC-400.650聲光調(diào)諧濾波器（法國(guó)AA Opto Electronic公司）; ZT405/488/532/640rpc-XT二向色鏡、ZET532/640m發(fā)射濾光片、ET700/75m帶通濾光片（美國(guó)Chroma公司）; FF01-559/34帶通濾光片（美國(guó)Semrock公司）。

HCl（36%～38%）、MgCl2（北京化工廠）; 3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-Aminopropyltriethoxysilane， APTES）、N，N-二異丙基乙胺（N，N-diisopropylethylamine）、戊二醛（25%）、NaBH4、EGTA、咪唑、葡萄糖、葡萄糖氧化酶（190 units/mg）、過氧化氫酶（12000 units/mg）、 β-巰基乙醇（美國(guó)Sigma Aldrich公司）; 牛血清白蛋白（BSA）、Tris堿（美國(guó)Genview公司）; Alexa647標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（美國(guó)Invitrogen公司）; 肌動(dòng)蛋白聚合試劑盒（BK003，美國(guó)Cytoskeleton公司）; 除特定標(biāo)注的試劑外，其余試劑純度均大于98%。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?肌動(dòng)蛋白（Actin）的聚合?根據(jù)試劑盒中的說明書，將游離球狀肌動(dòng)蛋白（G-actin）在體外聚合， 形成纖維狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）。首先將1 mg Actin凍干粉溶解于100 μL無菌水中，并等分為20份， 20℃保存?zhèn)溆?。取一支Actin等分試樣，加入45 μL常規(guī)肌動(dòng)蛋白緩沖液稀釋至1 mg/mL，最后加入5 μL 10×肌動(dòng)蛋白聚合緩沖液，在室溫下反應(yīng)2 h，獲得F-actin儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液可在4℃下穩(wěn)定保存1個(gè)月。

2.2.2?聚合纖維狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）的聯(lián)用成像?用緩沖液A（2 mmol/L MgCl2， 1 mmol/L EGTA， 20 mmol/L 咪唑-HCl， pH 7.6）將F-actin稀釋至10 μg/mL。取200 μL稀釋液，在APTES修飾的蓋玻片上沉積5 min，并用緩沖液A清洗; 用2%（w/V）戊二醛固定15 min; 用新制備的0.1%（w/V）NaBH4處理樣品7 min，減少由戊二醛固定產(chǎn)生的背景熒光。將蓋玻片安裝在聯(lián)用儀器的樣品池中，加入緩沖液A，進(jìn)行AFM成像。成像后，取下樣品池，先用4%（w/V）BSA封閉樣品15 min，再用Alexa647標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽在室溫下避光特異性標(biāo)記F-actin 1 h，接著用緩沖液A清洗，最后， 在樣品池中加入dSTORM成像緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、 10 mmol/L NaCl，10%（w/V）葡萄糖、0.5 mg/mL葡萄糖氧化酶、40 μg/mL過氧化氫酶和1%（V/V）β-巰基乙醇），并對(duì)相同區(qū)域進(jìn)行dSTORM成像。

2.2.3?AFM和dSTORM圖像間的匹配?參考文獻(xiàn)[14]的方法，通過對(duì)dSTORM的原始坐標(biāo)點(diǎn)進(jìn)行仿射變換（平移、縮放、旋轉(zhuǎn)和剪切）， 實(shí)現(xiàn)AFM和dSTORM圖像之間的配準(zhǔn)，采用自行編輯的MATLAB程序優(yōu)化仿射變換參數(shù)及圖像配準(zhǔn)。

3?結(jié)果與討論

3.1?聯(lián)用儀器裝置

三維超分辨熒光和形貌顯微鏡是由一臺(tái)原子力顯微鏡AFM 5500和一臺(tái)倒置光學(xué)顯微鏡Ti-E組合搭建而成，如圖1所示。對(duì)于AFM成像模塊，利用Si3N4探針DNP-S中的D針（彈性常數(shù)為0.06 N/m）在AAC（Acoustic AC）模式下對(duì)生物樣品在溶液中成像，以實(shí)現(xiàn)在近似生理?xiàng)l件下對(duì)生物樣品的無損高分辨成像。dSTORM成像模塊主要由1臺(tái)倒置光學(xué)顯微鏡Ti-E配有100倍TIRF物鏡（數(shù)值孔徑為1.49）、3臺(tái)激光器（639、 532、 405 nm）、1個(gè)聲光調(diào)諧濾波器（用于調(diào)節(jié)激光的開關(guān)與強(qiáng)度）、1個(gè)EMCCD相機(jī)及相應(yīng)的二向色鏡、濾光片、透鏡構(gòu)成。為進(jìn)行dSTORM成像，首先需更換相應(yīng)濾光片：二向色鏡ZT405/488/532/640rpc-XT、發(fā)射濾光片ZET532/640m、帶通濾光片ET700/75m（針對(duì)639 nm激發(fā)通道）和FF01-559/34（針對(duì)532 nm激發(fā)通道）以及設(shè)置采集參數(shù)（曝光時(shí)間20 ms，EM增益300，圖片采集幀數(shù)10000），之后用639 nm或532 nm激光（～2 kW/cm2）激發(fā)樣品， 并同時(shí)用405 nm激光（0～1 W/cm2）激活熒光基團(tuán)。此外，為實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的相同區(qū)域進(jìn)行AFM和dSTORM成像，需調(diào)節(jié)dSTORM光路，使其與AFM探針的針尖相匹配。

AFM成像時(shí)，用PicoView 1.12軟件（美國(guó)Agilent公司）采集512 × 512像素的原始數(shù)據(jù)，并用Gwyddion軟件[19]處理分析，以獲取矩陣數(shù)據(jù)。dSTORM成像時(shí)，用Micromanager軟件采集原始圖片序列，并對(duì)其用ThunderSTORM軟件[20]處理，以獲取所有合格定位點(diǎn)的信息（如坐標(biāo)、不確定度）。將原始AFM矩陣數(shù)據(jù)和dSTORM定位點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入MATLAB配準(zhǔn)程序中，實(shí)現(xiàn)AFM和dSTORM圖像間的精細(xì)匹配。

3.2?聚合纖維狀肌動(dòng)蛋白的聯(lián)用成像

為了考察三維超分辨熒光和形貌顯微鏡聯(lián)用儀器的性能，采用G-actin在體外聚合形成的F-actin為測(cè)試樣品，進(jìn)行聯(lián)用成像。如圖2A所示，左側(cè)圖像為AFM形貌圖，顯示了一些纖維狀凸起物及一些球形顆粒。根據(jù)文獻(xiàn)[21]中報(bào)道的肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)，推測(cè)這些纖維狀凸起物和球形顆粒分別為聚合F-actin和游離G-actin。此外，從AFM圖像（如圖2A左圖）中觀察到具有不同高度及寬度的纖維狀凸起物，推測(cè)這是由于F-actin的聚合程度不同引起的。為測(cè)定AFM-dSTORM聯(lián)用系統(tǒng)中的AFM成像模式能否提供高分辨圖像，本研究選擇寬度細(xì)小的低聚F-actin（如圖2A左圖中的白色箭頭）及粒徑小的游離G-actin（如圖2A左圖中的藍(lán)色箭頭）進(jìn)行高度及半峰全寬的測(cè)定，并與文獻(xiàn)[21]中報(bào)道的肌動(dòng)蛋白尺寸進(jìn)行比較， 以確定AFM成像的分辨率。通過對(duì)箭頭處低聚F-actin和游離G-actin進(jìn)行高度分布分析及高斯分布擬合，獲得的低聚F-actin的高度及半峰全寬為10和30 nm（圖2B上圖），游離G-actin的高度及半峰全寬為7 和16 nm（圖2B下圖）。對(duì)比文獻(xiàn)[21]中報(bào)道的單個(gè)G-actin直徑（5.5 nm）及單聚F-actin直徑（8 nm），發(fā)現(xiàn)箭頭處的G-actin和F-actin的半峰全寬雖然由于AFM探針針尖的加寬效應(yīng)而大于文獻(xiàn)中報(bào)道的肌動(dòng)蛋白尺寸，但測(cè)定的高度與文獻(xiàn)[12]中肌動(dòng)蛋白尺寸相符，因此，本聯(lián)用系統(tǒng)中的AFM成像可實(shí)現(xiàn)對(duì)肌動(dòng)蛋白的高分辨成像。圖2C左側(cè)圖像為dSTORM圖像，顯示了特異性標(biāo)記蛋白F-actin的分布，右側(cè)圖像為放大圖，更清晰地揭示了F-actin的分布及聚合程度。為測(cè)定聯(lián)用系統(tǒng)中的dSTORM成像分辨率，選擇寬度細(xì)小的低聚F-actin區(qū)域（如圖2C右圖中的白色線條），并對(duì)其熒光強(qiáng)度分布進(jìn)行高斯擬合，以測(cè)定F-actin的半峰全寬。如圖2D所示，dSTORM圖中所測(cè)得的低聚F-actin的半峰全寬為20～30 nm，比單聚F-actin的直徑（8 nm）大，表明聯(lián)用系統(tǒng)中的dSTORM成像可達(dá)到約20 nm的分辨率，與文獻(xiàn)[14， 22]中報(bào)道的dSTORM分辨率（20 nm）相當(dāng)。上述結(jié)果表明，搭建的聯(lián)用儀器可實(shí)現(xiàn)dSTORM的超分辨熒光成像。

為了將具體蛋白F-actin的分布精確定位到對(duì)應(yīng)的三維形貌圖中，需將形貌圖中肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)與基底區(qū)分。如圖2A所示，通過設(shè)置閾值（基底的高度），可區(qū)分基底和肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)。為方便后續(xù)圖像匹配優(yōu)化，將小于等于閾值的高度值定義為0，即h=0代表基底; 將大于閾值的高度值減去閾值，即h值代表肌動(dòng)蛋白的高度，且h>0代表肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)。將提取的肌動(dòng)蛋白三維結(jié)構(gòu)與具體蛋白F-actin的分布導(dǎo)入MATLAB配準(zhǔn)程序中，并根據(jù)AFM和dSTORM圖中F-actin的結(jié)構(gòu)，優(yōu)化仿射變換參數(shù)以實(shí)現(xiàn)精確定位。如圖3A所示，左側(cè)圖像為AFM形貌圖，通過閾值扣除法將F-actin結(jié)構(gòu)（紅色區(qū)域）與基底（黑色區(qū)域）分割出來; 中間圖像為經(jīng)仿射變換后的dSTORM圖像，展示了特異性標(biāo)記蛋白F-actin的空間分布; 右側(cè)圖像為AFM形貌圖和經(jīng)仿射變換后的dSTORM圖像間的疊加圖，顯示出具體蛋白F-actin在形貌圖中的定位分布情況， 表明利用dSTORM成像得到的特異性標(biāo)記蛋白F-actin的分布與AFM形貌圖中的纖維狀結(jié)構(gòu)重疊，證明AFM-dSTORM聯(lián)用顯微鏡能夠?qū)⑻囟ǖ鞍追肿泳_定位到AFM形貌圖中。為進(jìn)一步定量分析AFM和dSTORM圖間的匹配效果， 通過比較dSTORM定位點(diǎn)出現(xiàn)在基底處（h=0）以及F-actin處（h>0）的幾率來確定以及優(yōu)化這兩種圖像間的重疊程度，即比較h=0及h > 0處的dSTORM定位點(diǎn)密度。如圖3B所示，h > 0處的dSTORM定位點(diǎn)密度為2353 μ2，而h=0處的dSTORM定位點(diǎn)密度只有318 μm2，表明dSTORM定位點(diǎn)出現(xiàn)在F-actin處的幾率大于出現(xiàn)在基底處，即證明AFM和dSTORM圖像間的重疊程度很好。綜上，此聯(lián)用儀器可實(shí)現(xiàn)在單分子水平上對(duì)具體成分的空間分布和整體形貌間的關(guān)聯(lián)分析。

4?結(jié) 論

搭建了三維超分辨熒光和形貌顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)，用聚合纖維狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）作為典型的樣品，證明此聯(lián)用系統(tǒng)可以提供高分辨率的AFM形貌圖和dSTORM重構(gòu)圖（水平分辨率約20 nm米，形貌圖的垂直分辨率高達(dá)0.1 nm），也證實(shí)此聯(lián)用系統(tǒng)能夠在整體形貌圖中精確定位具體蛋白的分布。此AFM-dSTORM聯(lián)用系統(tǒng)為單分子水平研究解析細(xì)胞膜蛋白聚集體組分及其形成機(jī)理提供了新的分析手段。此外，此AFM-dSTORM聯(lián)用系統(tǒng)也可應(yīng)用于其它領(lǐng)域的研究，如材料精細(xì)結(jié)構(gòu)和缺陷的分析以及生物活性分子與細(xì)胞的相互作用等。

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