何若曦 王琦 李貝 賈晶 路雯婧 雙少敏

摘?要?將牛血清白蛋白介導(dǎo)的硫化銅納米復(fù)合物（BSA/CuS） 通過酰胺鍵修飾在負(fù)載了化療藥物阿霉素（DOX） 的介孔二氧化硅（MSN） 表面，制備了新型藥物載體MSN-DOX@BSA/CuS。此復(fù)合物中BSA作為封閉劑，其二硫鍵與谷胱甘肽發(fā)生氧化還原反應(yīng)后斷裂，導(dǎo)致MSN孔隙暴露，使DOX從中釋放;CuS作為光熱試劑，可將光能轉(zhuǎn)化為熱能，具有光熱治療的作用。利用紫外-可見-近紅外吸收光譜考察了其光吸收性質(zhì)。結(jié)果表明，此藥物載體在近紅外區(qū)800～1100 nm范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的吸收，可在近紅外光照射下實(shí)現(xiàn)光熱轉(zhuǎn)換。另外，將未負(fù)載DOX的載體MSN@BSA/CuS與癌細(xì)胞孵育，此載體表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性; 加入負(fù)載藥物的MSN-DOX@BSA/CuS后，細(xì)胞的存活率降為49%;經(jīng)過額外的激光照射后，細(xì)胞存活率僅為18%。以上結(jié)果表明，所合成的納米藥物載體可同時(shí)實(shí)現(xiàn)光熱治療與化療的協(xié)同治療，有效提高對(duì)癌癥的治療效率。

關(guān)鍵詞?介孔二氧化硅; 牛血清白蛋白; 硫化銅; 光熱治療與化療; 協(xié)同治療

1?引 言

癌癥是目前嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一[1]。光熱療法利用光熱材料將近紅外光轉(zhuǎn)化為熱，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的熱消融[2～4]，是腫瘤治療的有效方法之一， 具有非侵入、過程簡單、正常組織損傷小等優(yōu)點(diǎn)[5]。光熱治療中常用的光熱納米材料有聚合物納米材料[6]、碳基納米材料[7]及過渡金屬硫化物納米材料[8]等，上述材料在近紅外區(qū)均有較強(qiáng)吸收，而且光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。其中，硫化銅（CuS） 納米粒子因其制備容易＼，光熱轉(zhuǎn)換效率高＼，細(xì)胞毒性低，成為一種新型光熱試劑[9，10]。然而，單一光熱治療的治療效率受限，因此，光熱療法與其它療法（如光動(dòng)力治療[11，12]、化學(xué)動(dòng)力治療[13]和化療[14，15]） 相結(jié)合的協(xié)同方法成為發(fā)展趨勢(shì)[16]，為高效治療腫瘤提供了新策略。

近年來，光熱療法與化學(xué)療法結(jié)合引起研究者的關(guān)注。文獻(xiàn)報(bào)道將CuS納米粒子與其它納米材料（如介孔碳[17]、二氧化錳[18]、氧化石墨烯[19]、二氧化硅[20]等） 結(jié)合，構(gòu)建了系列光熱化療協(xié)同治療的復(fù)合納米體系。這些復(fù)合納米體系均利用腫瘤微環(huán)境和正常生理環(huán)境下某些性質(zhì)（如pH值[21]、溫度[22]、還原電位[23]等） 的差異，使藥物在到達(dá)腫瘤組織時(shí)實(shí)現(xiàn)響應(yīng)性釋放。

高含量的谷胱甘肽是腫瘤微環(huán)境的特征表現(xiàn)之一。谷胱甘肽（GSH） 是人體中含量最豐富的還原性物質(zhì)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSH水平（約2～10 mmol/L） 明顯高于細(xì)胞外基質(zhì)中GSH水平（約2～10 μmol/L） ，且腫瘤細(xì)胞中GSH的濃度明顯高于正常細(xì)胞 [24，25]。二硫鍵作為常見的氧化還原敏感基團(tuán)， 在GSH的存在下易裂解，使其成為設(shè)計(jì)氧化還原響應(yīng)藥物遞送系統(tǒng)的最佳反應(yīng)位點(diǎn)[26]。富含天然二硫鍵以及氨基和羧基的血清白蛋白是存在于生物體血清中的一種球狀蛋白，它不僅可與其它載體材料結(jié)合構(gòu)建氧化還原響應(yīng)的新型藥物載體，還可通過生物礦化，為CuS的形成提供生長平臺(tái)。

本研究以牛血清白蛋白（BSA） 為模板，CuS為光熱治療核心納米粒子，通過生物礦化形成納米復(fù)合物（BSA/CuS） 。借助BSA將其共價(jià)鍵合在負(fù)載了化療藥物阿霉素（DOX） 的介孔二氧化硅（MSN） 載體表面，得到納米復(fù)合材料MSN-DOX@BSA/CuS。BSA作為門控與腫瘤微環(huán)境中過表達(dá)的GSH發(fā)生氧化還原反應(yīng)，導(dǎo)致二硫鍵打開，MSN孔隙暴露，從而快速釋放化療藥物。同時(shí)，在激光照射下， 該復(fù)合材料中的CuS可將光能轉(zhuǎn)化為熱能，有效殺死癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)癌癥的化療和光熱協(xié)同治療，提高治療效果。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

JEM-2100型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司） ; TriStar II 3020比表面與孔隙度分析儀（美國麥克默耐瑞提克公司） ; Bruker Tensor II傅里葉紅外光譜儀（德國Bremen公司） ; AXIS ULTRA DLD 型 X-射線光電子能譜儀（英國Kratos公司） ; U-2910紫外可見分光光度計(jì)（日本日立公司） ; Lambda 950紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)（美國珀金埃爾默公司） ; Zetasizer Nano ZS90儀器（英國Malvern公司） ; ZD-85A型氣浴恒溫振蕩器（常州恒隆儀器有限公司） ; 真空干燥箱（上海一恒科技儀器有限公司） ; 冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司） ; SZCL-3A型磁力電熱套攪拌器（杭州瑞佳儀器有限公司） ; FE20酸度計(jì)（上海梅特勒-托利多儀器有限公司） ; LR-MFJ-980激光器（長春鐳銳光電科技有限公司） ; Infinite 200 PRO酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司） 正硅酸乙酯（純度>99%） 、十六烷基三甲基溴化銨（純度>99%） 、牛血清白蛋白（純度99%） 、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，純度98%） 和1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基） 碳二亞胺（EDC，純度98%） 均購于阿拉丁試劑公司; Cu（NO3） 2（分析純，北京化工廠） ; Na2S·9H2O（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司） ; 3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES， 純度98%） 和鹽酸阿霉素（純度98%） 購自上海麥克林生化科技有限公司; 實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水（18.2 MΩ·cm，Milli-Q純水儀（美國Millipore公司） 制備） 。

2.2?MSN的合成

根據(jù)文獻(xiàn)[27]的方法合成MSN。準(zhǔn)確稱取0.5000 g十六烷基三甲基溴化銨和1.5 mL NaOH（2 mol/L） 溶于240 mL水中，加熱至80℃后，加入2.5 mL 正硅酸乙酯并攪拌2 h。將得到的白色沉淀離心后，用乙醇洗滌2次，于140 mL乙醇和6 mL濃HCl中回流36 h。將制得的MSN真空干燥。

2.3?MSN-NH2的合成

準(zhǔn)確稱取0.2000 g MSN分散于80 mL甲醇中，加入1.2 mL APTES， 在85℃油浴中回流12 h。反應(yīng)完成后，用無水乙醇洗滌3次，于干燥箱中干燥。

2.4?BSA/CuS的合成

按照文獻(xiàn)[10]方法并稍作改進(jìn)。將Cu（NO3）2溶液（20 mmol/L，2 mL） 和BSA溶液（40 mg/mL，18 mL） 于單口燒瓶中混合，溶液出現(xiàn)淺綠色混濁。然后，用NaOH溶液（2 mol/L） 將混合物調(diào)至堿性（pH 12） ，此時(shí)混合物顏色變?yōu)樯钭仙?加入1 mL Na2S·9H2O（100 mmol/L） ，溶液變?yōu)樯钭厣?5℃油浴4 h。反應(yīng)完成后，將溶液用二次蒸餾水透析（MWCO=300 kD） 24 h，除去過量的Cu2+。冷凍干燥，獲得粉末狀BSA/CuS。

2.5?MSN@BSA/CuS的合成

將80 mg EDC、60 mg NHS和80 mg BSA溶于40 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.3） 中，在室溫下攪拌20 min，以活化BSA的羧基。隨后向上述溶液中緩慢加入40 mg MSN-NH2，反應(yīng)24 h。最終產(chǎn)物用水洗滌數(shù)次，室溫下真空干燥12 h，研磨后，得到白色蓬松粉末。

2.6?DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線和載藥實(shí)驗(yàn)

配制濃度為1、2、5、10、20、30和40 μg/mL的DOX溶液，分別測(cè)試不同濃度DOX溶液在480 nm處的吸光度，將吸光度與DOX濃度進(jìn)行線性擬合，得到測(cè)定DOX濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取15.0 mg干燥的MSN-NH2分散于8 mL 0.5 mg/mL DOX/PBS 緩沖溶液（pH 7.4） 中，室溫避光攪拌24 h得到MSN-DOX。并將BSA/CuS按照2.5節(jié)的方法修飾于MSN-DOX表面，得到納米載體MSN-DOX@BSA/CuS。用PBS緩沖溶液（pH 7.4） 充分洗滌，以除去未負(fù)載的藥物，直至上清液變?yōu)闊o色。將收集的上清液定容后，稀釋1倍，根據(jù)其在480 nm處的UV-Vis吸收和DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定DOX加載量。根據(jù)公式（1） 計(jì)算載藥率（Drug loading rate，L，%） ：

L（%） =（m1-m2） /m×100% （1）

其中， m1為投入藥物的質(zhì)量， m2為上清液中藥物的質(zhì)量，m為載藥的載體質(zhì)量。DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.0157x+0.0036，其中，y為吸光度值，x為DOX濃度（μg/mL） 。

2.7?藥物釋放實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取3.0 mg MSN-DOX@BSA/CuS分散在不同pH值（7.4、5.3） 和不同濃度GSH（0和10 mmol/L） 的PBS（10 mL） 中，并將其置于氣浴恒溫振蕩器（37℃） 中振蕩反應(yīng)。 在預(yù)定的時(shí)間間隔取出2 mL釋放介質(zhì)，并加入等體積的新鮮培養(yǎng)液。通過監(jiān)測(cè) DOX的紫外-可見吸收光譜值， 繪制DOX釋放曲線。

2.8?MSN@BSA/CuS納米載體的光熱轉(zhuǎn)換測(cè)定

將1 mL不同濃度的MSN@BSA/CuS納米顆粒懸濁液（0、2、4和6 mg/mL） 分別加入石英池中，使用激光持續(xù)照射（980 nm，1 W/cm2，6 min） ，每隔1 min記錄溶液溫度，繪制材料的升溫曲線。為了測(cè)量光熱轉(zhuǎn)換效率（η） ，將MSN@BSA/CuS的水溶液在980 nm（1 W/cm2） 激光下照射600 s，然后關(guān)閉激光光源，使溶液自然冷卻，記錄溫度變化與時(shí)間的關(guān)系。η值通過公式（2） 計(jì)算：

η=hS（Tmax-Tsurr） -QsI（1-10

A980） （2）

其中，h為熱傳遞系數(shù)，S為輻射傳熱表面積。Tmax和Tsurr分別為系統(tǒng)最高溫度和周圍環(huán)境溫度，Qs為溶劑吸收的熱量，I為激光功率，A980為MSN@BSA/CuS在980 nm處的吸光度。 hS的值根據(jù)公式（3） 得出：

hS=mDCDτs（3）

mD和CD表示溶劑的質(zhì)量和比熱容（4.2 J/（g·℃） ） ，τs為系統(tǒng)時(shí)間常數(shù)。為了得到hS值，進(jìn)一步引入θ，其計(jì)算公式如（4） ：

θ=Tsurr-TTsurr-Tmax（4）

其中， θ是無量綱的驅(qū)動(dòng)溫度常數(shù)，T為溶液溫度。因此， τs可以通過線性擬合冷卻時(shí)間對(duì)驅(qū)動(dòng)溫度常數(shù)的自然對(duì)數(shù)的負(fù)值得到。

2.9?細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將Hela細(xì)胞懸液以8000個(gè)/孔的密度接種到96孔板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，向孔中加入含不同濃度MSN、MSN@BSA/CuS、DOX或MSN-DOX@BSA/CuS的新鮮培養(yǎng)基。另設(shè)置MSN-DOX@BSA/CuS組，與癌細(xì)胞共孵育4 h后，給予980 nm近紅外激光照射（1 W/cm2） 5 min，再孵育24 h。用含MTT新鮮培養(yǎng)基替換所有藥孔中培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 h，棄去上清液，加入DMSO輕搖，用酶標(biāo)儀測(cè)量570 nm處吸光度。

3?結(jié)果與討論

3.1?MSN-DOX@BSA/CuS的制備

根據(jù)Stber法制備MSN納米粒子。采用APTES與表面SiOH基團(tuán)之間的偶聯(lián)反應(yīng)，在MSN上修飾氨基。將DOX作為模型藥物，通過氫鍵作用負(fù)載到氨基MSN的孔中。利用BSA的羧基與MSN-NH2的氨基之間的酰胺化反應(yīng)合成MSN-DOX@BSA/CuS（圖1） 。

3.2?納米復(fù)合材料的表征

采用透射電鏡（TEM） 表征所制備的納米復(fù)合材料的形貌和尺寸。由圖2可見，MSN的形狀近似球形或橢圓形，粒徑約為100 nm，并且具有明顯的有序孔道（圖2A） ; BSA/CuS 納米粒子是單分散的，粒徑約為2 nm（圖2B） ; 修飾BSA/CuS后，由于MSN表面接枝了聚合物，孔道被封堵，表明BSA/CuS成功修飾在MSN表面（圖2C） ;MSN、BSA/CuS和MSN@BSA/CuS的可見-近紅外吸收光譜見圖2D，MSN在近紅外區(qū)幾乎無吸收，BSA/CuS在可見區(qū)到近紅外區(qū)800～1100 nm范圍內(nèi)有較強(qiáng)的吸收。MSN修飾BSA/CuS后，在相同波長范圍內(nèi)也有吸收，表明納米材料MSN@BSA/CuS具有潛在的光熱轉(zhuǎn)化能力。

為了進(jìn)一步確定BSA/CuS成功修飾在MSN表面以及MSN@BSA/CuS的元素組成，測(cè)定了MSN（圖3A） 和MSN@BSA/CuS（圖3D） 的X射線光電子能譜（XPS） 。在MSN高分辨率譜圖中，在結(jié)合能為103 eV和532 eV出現(xiàn)了Si 2p峰（圖3B） 和O 1s峰（圖3C） 。與MSN相比，MSN@BSA/CuS出現(xiàn)了Cu 2p峰和N 1s峰。N 1s在400 eV出現(xiàn)峰值（圖3E） ，證明了BSA存在。如圖3F所示，Cu 2p3/2和Cu 2p1/2對(duì)應(yīng)的932.7 eV和952.5 eV兩個(gè)峰與Cu2+在CuS中的結(jié)合能基本相同，表明BSA/CuS成功修飾在MSN表面。

由氮?dú)馕?脫附曲線（圖4A） 和孔徑分布圖（圖4B）可見，MSN有較大的比表面積和孔體積，分別為1143 m2/g和1.25 cm3/g，孔徑約為3 nm。修飾BSA/CuS后，MSN@BSA/CuS的比表面積和孔體積分別降至62 m2/g和0.13 cm3/g，且孔徑也減小，表明MSN有較強(qiáng)的藥物裝載能力，且BSA/CuS有效封堵了MSN的孔道。圖4C為MSN、BSA/CuS及MSN@BSA/CuS的Zeta電位分析結(jié)果，MSN的Zeta電位為19.9 mV，說明在其表面存在大量OH基團(tuán)。進(jìn)行氨基化修飾后電位由負(fù)變?yōu)?0.7 mV，表明NH2基團(tuán)成功修飾在MSN表面。測(cè)得BSA/CuS的電位為27.7 mV，在MSN-NH2上修飾BSA/CuS后，電位由正值變?yōu)?2.6 mV，證明了BSA/CuS納米復(fù)合物在MSN-NH2納米載體上的有效連接。紅外光譜（圖4D） 表明，MSN和MSN@BSA/CuS在1080、960和797 cm1處均有吸收，分別為SiOSi不對(duì)稱伸縮振動(dòng)、MSN表面羥基的彎曲振動(dòng)和SiO對(duì)稱伸縮振動(dòng)。此外，BSA/CuS與MSN@BSA/CuS在1658和1540 cm1處有相同的特征吸收峰，分別歸屬于酰胺鍵中CO的伸縮振動(dòng)和NH的面內(nèi)彎曲振動(dòng)，表明BSA/CuS成功連接在MSN表面。

3.3?MSN@BSA/CuS的光熱轉(zhuǎn)換性能

以波長980 nm（1 W/cm2） 的激光為光源，考察了不同濃度MSN@BSA/CuS懸濁液的溫度隨照射時(shí)間的變化（圖5A） 。在6 min持續(xù)照射后，對(duì)照組水的溫度僅上升了3℃。隨著MSN@BSA/CuS濃度增加，溶液溫度也不斷上升。當(dāng)納米載體濃度為6 mg/mL時(shí)，溫度升高了19℃。為了進(jìn)一步證明MSN@BSA/CuS的光熱效應(yīng)，評(píng)估了其光熱轉(zhuǎn)化效率。根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)（圖5B～5D） ，MSN@BSA/CuS的光熱轉(zhuǎn)換效率η達(dá)到41.8%，表明此載體具有較好的光熱轉(zhuǎn)換性能，可進(jìn)一步用于腫瘤的光熱治療。

ln（θ） （τs=249.11 s）

3.4?DOX負(fù)載量的計(jì)算

通過測(cè)定DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖6A和6B） 和收集的上清液在480 nm處的紫外吸收光譜（圖6C） ，計(jì)算出MSN上DOX的負(fù)載效率為10.68%。

3.5?體外釋放行為分析

MSN表面修飾的BSA/CuS作為堵孔試劑可防止藥物在進(jìn)入癌細(xì)胞前發(fā)生泄漏，當(dāng)載藥體系進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)過量的谷胱甘肽與BSA發(fā)生氧化還原反應(yīng)并打開其二硫鍵，使MSN孔隙暴露，從而實(shí)現(xiàn)藥物釋放。從體外藥物釋放曲線（圖7） 可知，在未加入GSH的pH 7.4和pH 5.3的PBS溶液中，藥物釋放量僅為20%和8.6%。相比之下，當(dāng)GSH濃度為10 mmol/L時(shí)，pH 7.4的PBS溶液藥物釋放量上升為27%，而pH 5.3的PBS溶液表現(xiàn)出更快更高的藥物釋放，達(dá)到了56%。體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BSA/CuS能有效將藥物包封在MSN中，避免藥物在癌細(xì)胞內(nèi)過早釋放。同時(shí)，納米復(fù)合物MSN-DOX@BSA/CuS還具有氧化還原響應(yīng)釋放的性質(zhì)。

3.6?光熱與化療協(xié)同治療腫瘤

通過MTT實(shí)驗(yàn)探究了載體的細(xì)胞毒性和光熱與化療協(xié)同治療腫瘤的效果。由圖8A可見，未載藥的納米載體MSN和MSN@BSA/CuS細(xì)胞存活率均高于80%，細(xì)胞毒性較小。圖8B為不同載藥體系對(duì)Hela細(xì)胞的化療-熱療協(xié)同殺傷效果。單獨(dú)使用MSN-DOX@BSA/CuS化療的細(xì)胞毒性低于游離的DOX和MSN-DOX，說明BSA/CuS有效封堵MSN孔道，對(duì)DOX起緩釋作用; MSN-DOX@BSA/CuS進(jìn)入細(xì)胞后，無近紅外光照射時(shí)，Hela細(xì)胞的存活率為49%; 當(dāng)施加激光照射時(shí)，納米粒子的光熱效果導(dǎo)致局部溫度過高，Hela細(xì)胞的存活率下降至18%，這是因?yàn)楣庹债a(chǎn)生的熱量會(huì)增加細(xì)胞膜通透性，進(jìn)而增強(qiáng)化療藥物和納米載體的轉(zhuǎn)移。因此，此納米粒子能夠較好地將化療與光熱治療相結(jié)合，對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行更有效的協(xié)同治療。

4?結(jié) 論

通過酰胺鍵將牛血清白蛋白介導(dǎo)的硫化銅鍵合在介孔二氧化硅上，構(gòu)建了MSN@BSA/CuS載體。此載體具有易于制備、低細(xì)胞毒性和良好的光熱轉(zhuǎn)換性能等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)載入化療藥物DOX后，納米復(fù)合物MSN-DOX@BSA/CuS在腫瘤微環(huán)境中GSH的存在下，通過氧化還原響應(yīng)特性釋放出抗癌藥物。同時(shí)，復(fù)合納米載體可以在激光照射下將光能轉(zhuǎn)化為熱能， 殺死癌細(xì)胞。與單一化療效果相比，光熱治療可以增加癌細(xì)胞膜的通透性，有助于化療藥物能夠更快更多地進(jìn)入癌細(xì)胞， 發(fā)揮藥效，從而表現(xiàn)出更高的細(xì)胞殺傷效率。此智能納米載體可實(shí)現(xiàn)光熱-化療的協(xié)同治療，提高治療效果，為癌癥的精準(zhǔn)有效治療提供了新思路。

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Construction of Protein-mediated Copper Sulfide Bonded Mesoporous

Silica Nanoparticles Vector for Chemo-photothermal

Synergistic Therapy of Cancer

HE Ruo-Xi， WANG Qi， LI Bei， JIA Jing， LU Wen-Jing， SHUANG Shao-Min*

（School of Chemistry and Chemical Engineering， Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

Abstract?Bovine serum albumin-mediated copper sulfide nanocomplex （BSA/CuS）was modified on mesoporous silica （MSN）loaded with chemotherapeutic drug doxorubicin （DOX） by amide bond to prepare a new drug carrier， MSN-DOX@BSA/CuS. The disulfide bond of blocking agent BSA would break down after redox reaction with glutathione， resulting in MSN pore exposure and release of DOX. CuS， as a photothermal reagent， could convert light energy into heat for photothermal therapy. UV-Vis-NIR absorption spectra were used to investigate the absorption properties of the carrier. The results showed that the carrier had strong absorption in the range of 800-1100 nm and could realize the photothermal conversion under the near infrared light. In addition， MSN@BSA/CuS was incubated with cancer cells and showed no cytotoxicity. When MSN-DOX@BSA/CuS was added， the relative survival rate of the cells decreased to 49%. After the extra laser， the cell viability was only 18%. The above results showed that the synthesized nano drug carrier could realize the synergistic treatment of photothermal therapy and chemotherapy at the same time， and effectively improved the treatment efficiency of cancer.

Keywords?Mesoporous silica nanoparticles;Bovine serum albumin;Copper sulfide;Chemotherapy and photothermal therapy;Synergistic therapy

（Received 19 October 2019;accepted 21 November 2019）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 21874087） .