劉卓靚 陶呈安 王建方

摘?要?鳥(niǎo)嘌呤四鏈體（G-四鏈體）是一種特殊的核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)，它可與高鐵血紅素結(jié)合，形成具有過(guò)氧化物酶活性的核酶; 也可增強(qiáng)特殊結(jié)構(gòu)染料的熒光強(qiáng)度。G-四鏈體作為功能核酸中的一種，具有性質(zhì)穩(wěn)定、特異性好、功能多樣等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種生化分析中。本文對(duì)近年來(lái)G-四鏈體在生化分析中的研究和應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述，對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞?G-四鏈體; 功能核酸; 核酶; 生化分析; 評(píng)述

1?引 言

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，特定核酸、蛋白、酶等的檢測(cè)，已成為某些疾病的直接或間接診斷指標(biāo)[1～3]。而傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，如高效液相色譜法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、免疫印跡法、電泳法[4～6]都涉及專業(yè)人員操作以及大型儀器的使用，存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜、檢測(cè)靈敏度不高等問(wèn)題。而比色法及熒光法[7，8]作為儀器分析中的經(jīng)典方法，重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單，易于試劑盒的開(kāi)發(fā)。比色法或熒光法中如何高效穩(wěn)定輸出信號(hào)的報(bào)告分子是分析方法的研究熱點(diǎn)。功能核酸鳥(niǎo)嘌呤四鏈體（G-四鏈體）的特殊理化性質(zhì)，如與高鐵血紅素結(jié)合生成具有過(guò)氧化物酶活性的核酶、增強(qiáng)特殊結(jié)構(gòu)染料的熒光強(qiáng)度等，可靈活地實(shí)現(xiàn)信號(hào)的穩(wěn)定輸出。利用G-四鏈體作為報(bào)告分子，與各種功能核酸或核酸信號(hào)放大方法聯(lián)用，可實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)分子高特異性、高靈敏的檢測(cè)，為多種生化分析提供快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。

本文首先介紹了G-四鏈體的分類和功能，以及利用其與金屬離子作用引起的結(jié)構(gòu)變化而導(dǎo)致性質(zhì)的變化，結(jié)合特定染料或藥物分子的性質(zhì)，與其它功能核酸聯(lián)用等，在小分子、蛋白質(zhì)、酶、金屬離子、目標(biāo)DNA或RNA檢測(cè)、細(xì)胞成像及癌癥治療等方面應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述。

2?G-四鏈體簡(jiǎn)介

2.1?G-四鏈體的分類

鳥(niǎo)嘌呤平面是由4個(gè)鳥(niǎo)嘌呤通過(guò)氫鍵構(gòu)成的方形平面，G-四鏈體由幾個(gè)鳥(niǎo)嘌呤平面堆疊而成，其結(jié)構(gòu)由處于平面之間的金屬離子形成穩(wěn)定金字塔結(jié)構(gòu) [9]。中心穩(wěn)定離子為一價(jià)或者二價(jià)金屬離子，其中K+是最常見(jiàn)的金屬離子，金屬離子的大小決定G-四鏈體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[10，11]。

根據(jù)形成G-四鏈體的DNA或RNA鏈的數(shù)目分類，由一條鏈形成四鏈體結(jié)構(gòu)稱為分子內(nèi)G-四鏈體，多條鏈構(gòu)成的稱為分子間G-四鏈體。根據(jù)鏈的走向可分為3類：當(dāng)四條鏈的方向均相同時(shí)，為平行結(jié)構(gòu); 當(dāng)兩條鏈方向相同，另兩條鏈與其方向相反時(shí)，為反平行結(jié)構(gòu); 其它情況稱為混合平行結(jié)構(gòu)（圖1）[12，13]。G-四鏈體的結(jié)構(gòu)可通過(guò)圓二色譜測(cè)定。所有的G-四鏈體結(jié)構(gòu)在210 nm處都有一個(gè)正的特征吸收峰。平行結(jié)構(gòu)的G-四鏈體在240 nm處有一個(gè)負(fù)吸收峰，在260 nm附近有一個(gè)正吸收峰; 反平行結(jié)構(gòu)的G-四鏈體在260 nm處有一個(gè)負(fù)吸收峰，在290 nm處有一個(gè)正吸收峰[14]。

G-四鏈體的結(jié)構(gòu)主要取決于DNA或RNA的序列、核酸鏈的濃度和穩(wěn)定離子的種類[15]。以穩(wěn)定離子種類為例，Kong等[16]發(fā)現(xiàn)同樣的序列在K+或Na+條件下形成不同的結(jié)構(gòu)，他們系統(tǒng)研究了以T為間隔的堿基序列（5′-G3TiG3TjG3TkG3-3′）。當(dāng)T的總數(shù)目≤5時(shí)，在100 mmol/L的K+和Na+條件下均形成平行結(jié)構(gòu); 當(dāng)T的總數(shù)目為6～7時(shí)，在K+存在下依然形成平行結(jié)構(gòu)G-四鏈體; 而Na+穩(wěn)定時(shí)折疊成混合平行結(jié)構(gòu)。 Li等[17]發(fā)現(xiàn)，PW17在K+存在下形成平行結(jié)構(gòu)G-四鏈體，而Pb2+條件下為反平行結(jié)構(gòu)。

2.2?G-四鏈體的性質(zhì)

2.2.1?G-四鏈體構(gòu)成的模擬酶?具有酶催化活性的DNA或RNA稱為核酶（DNAzyme/RNAzyme）[18]。目前已發(fā)現(xiàn)具有切割或連接DNA/RNA、模擬過(guò)氧化物酶等活性的核酶[19～21]。G-四鏈體與輔因子高鐵血紅素（Hemin）結(jié)合形成具有過(guò)氧化物酶活性的核酶，可催化多種底物的氧化，包括ABTS、TMB、AmplexRed、魯米諾等。這種核酶是Travascio等[22]在篩選可特異結(jié)合N-甲基化卟啉IX的核酸適配體時(shí)發(fā)現(xiàn)的，而后進(jìn)一步優(yōu)化得到18個(gè)堿基的核酸適配體PS2.M。PS2.M形成的G-四鏈體與Hemin構(gòu)成的核酶，其催化活性是Hemin單獨(dú)存在時(shí)的250倍[23]。此類核酶的催化反應(yīng)機(jī)理與辣根過(guò)氧化物酶類似，G-四鏈體模擬辣根過(guò)氧化物酶中的組氨酸殘基為Hemin中的Fe提供一個(gè)軸向配體和一個(gè)疏水環(huán)境，有利于OO的異裂。G-四鏈體為Hemin提供一個(gè)平面結(jié)構(gòu)，有利于氫的交換[24～26]。目前，對(duì)于此類核酶的活性調(diào)控主要有3種方法：（1）是改變G-四鏈體本身的序列，從而改變其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來(lái)影響其性質(zhì); （2）是改變穩(wěn)定中心離子，從而改變G-四鏈體的構(gòu)型而改變Hemin的結(jié)合情況; （3）是在G-四鏈體的序列末端增加腺嘌呤，可將其活性提高至原有活性的4倍[24]。另外，還可加入ATP來(lái)穩(wěn)定催化過(guò)程中產(chǎn)生的自由基，提高催化效率[27]。

2.2.2?G-四鏈體增強(qiáng)熒光的染料?G-四鏈體可結(jié)合一些特定的熒光染料，極大地增強(qiáng)染料自身的熒光強(qiáng)度， 例如卟啉衍生物、酞菁染料、結(jié)晶紫、三苯甲烷等染料。熒光增強(qiáng)的原理是G-四鏈體可為染料分子提供一個(gè)疏水環(huán)境，防止熒光分子的相互靠近導(dǎo)致的自淬滅現(xiàn)象。

結(jié)晶紫（Crystal violet， CV）是一種三苯甲烷染料，堆積在兩個(gè)鳥(niǎo)嘌呤平面之間，可區(qū)分平行和反平行G-四鏈體。反平行G-四鏈體的Loop環(huán)可結(jié)合CV使其不受溶劑的影響，使得熒光大大增強(qiáng)。而平行G-四鏈體側(cè)鏈的Loop環(huán)不能結(jié)合CV，使得CV的熒光增強(qiáng)明顯弱于結(jié)合反平行G-四鏈體的CV[16]。

硫磺素T（Thioflavin T， ThT）是一種水溶性染料，可特異性地識(shí)別并結(jié)合G-四鏈體，結(jié)合后其熒光強(qiáng)度可增大2500倍[28]。

（Z）-4-（3，5-difluoro-4-hydroxybenzylidene）-1，2-dimethyl-1H-imidazol-5（4H）-one（DFHBI）是一種可與RNA G-四鏈體結(jié)合并對(duì)其進(jìn)行特異性識(shí)別的染料分子，結(jié)合后可模擬綠色熒光蛋白的熒光，用于細(xì)胞中的RNA成像[29]。在此基礎(chǔ)上，F(xiàn)eng等[30]報(bào)道了6種與紅色熒光蛋白生色團(tuán)類似的染料分子，與G-四鏈體結(jié)合后發(fā)出的熒光光譜范圍幾乎覆蓋紅色熒光蛋白的發(fā)射光譜，并且有較高的熒光量子產(chǎn)率，以此可模擬紅色熒光蛋白，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)成像。

2.2.3?G-四鏈體降低電信號(hào)的電化學(xué)活性分子

亞甲基藍(lán)（Methylene blue，MB）是一種帶正電的芳香結(jié)構(gòu)，是一種常用的電化學(xué)信號(hào)分子。Zhang等[31]研究發(fā)現(xiàn)，由于G平面的末端π-π堆疊效應(yīng)，MB可競(jìng)爭(zhēng)Hemin結(jié)合到G-四鏈體上，顯著減少擴(kuò)散到電極表面的MB，從而使得電流下降。

3?G-四鏈體在生化分析中的應(yīng)用

3.1?小分子與蛋白質(zhì)的檢測(cè)

核酸適配體是經(jīng)體外篩選，可高特異性和高親和力地識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)分子的單鏈DNA或RNA。以G-四鏈體為信號(hào)分子檢測(cè)小分子和蛋白質(zhì)的傳感分析方法大多與核酸適配體單元聯(lián)用。如Willner研究組[32]將ATP的核酸適配體連接上一段G-四鏈體序列作為識(shí)別探針，另一條DNA與之部分雜交形成中間留有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的雙鏈結(jié)構(gòu)。當(dāng)ATP存在時(shí)，核酸適配體與ATP結(jié)合，識(shí)別探針從雙鏈上解離下來(lái)，釋放出的G-四鏈體與Hemin形成DNAzyme，催化底物反應(yīng)（圖 2）。利用類似的設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)可卡因、溶菌酶、細(xì)胞因子[33～35]等的檢測(cè)。在此類設(shè)計(jì)中，要求仔細(xì)篩選G-四鏈體和核酸適配體中被雙鏈結(jié)構(gòu)封閉的堿基數(shù)目，使得在有目標(biāo)分子條件下G-四鏈體可從雙鏈解離產(chǎn)生信號(hào)，而無(wú)目標(biāo)分子時(shí)，G-四鏈體不會(huì)自動(dòng)解離產(chǎn)生較高的背景信號(hào)。值得注意的，凝血酶有兩種長(zhǎng)度分別為15及29個(gè)堿基的核酸適配體，且都可形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)。Li等[36]利用凝血酶的核酸適配體結(jié)合凝血酶后，可促進(jìn)核酸適配體形成的G-四鏈體，并更好地結(jié)合Hemin以提高DNAzyme的催化活性，從而實(shí)現(xiàn)凝血酶的檢測(cè)。

3.2?酶活性的分析

酶是生命過(guò)程中不可或缺的一部分，各種疾病的發(fā)生都與酶活性的異常相關(guān)，因此酶活性的檢測(cè)是生化分析中的重要內(nèi)容。以G-四鏈體為信號(hào)分子分析酶活性的報(bào)道中，檢測(cè)對(duì)象大多是以核酸為底物的酶。以下介紹幾種在疾病診斷、分子生物學(xué)中有重要意義的酶的檢測(cè)方法。

3.2.1?T4多聚核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase，T4 PNK）?T4 PNK是一種雙功能酶，可移除3′磷酸基團(tuán)以恢復(fù)3′羥基基團(tuán)，也可實(shí)現(xiàn)5′磷酸化。Liu等[37]報(bào)道了一種基于G-四鏈體-DNAyzme比色檢測(cè)T4 PNK的方法。在該體系中，設(shè)計(jì)了兩條探針，一條是3′磷酸化的引物，一條是封閉有G-四鏈體序列的發(fā)夾探針。當(dāng)T4 PNK存在時(shí)，引物的3′磷酸被去磷酸化，生成3′羥基，此時(shí)聚合酶可將引物延伸打開(kāi)發(fā)夾，釋放G-四鏈體序列。該方法可檢測(cè)低至0.01 U/mL的T4 PNK。基于T4 PNK5′磷酸化活性，裴仁軍研究組[38]設(shè)計(jì)了一種裂分的G-四鏈體 DNAzyme檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)最低濃度0.014 U/mL的T4 PNK的檢測(cè)。

3.2.2?核酸外切酶Ⅲ（Exonuclease Ⅲ，Exo Ⅲ）?Exo Ⅲ具有從3′-5′方向切割DNA的活性，在DNA復(fù)制等生理過(guò)程中有重要意義。Leung等[39]設(shè)計(jì)了發(fā)夾莖部含有G-四鏈體結(jié)構(gòu)的探針用于分析ExoⅢ的活性。核酸內(nèi)切酶Ⅲ從發(fā)夾莖部的3′端切斷，最后剩下的單鏈部分即為G-四鏈體，與CV結(jié)合后大大增加其熒光，以此來(lái)檢測(cè)核酸內(nèi)切酶Ⅲ的活性（圖3A）。

3.2.3?DNA連接酶（DNA ligase）?DNA連接酶能催化DNA分子內(nèi)或分子間毗鄰的5′磷酸基團(tuán)和3′羥基基團(tuán)形成磷酸二酯鍵， 將兩段相鄰的DNA拼合成一條完整的DNA鏈。He等[40]利用DNA連接前后對(duì)于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的改變，開(kāi)發(fā)了基于G-四鏈體檢測(cè)DNA連接酶的方法（圖3B），最低可檢測(cè)0.2 U/mL的DNA連接酶。

3.2.4?DNA甲基化酶（DNA methyltransferase）?DNA甲基化酶能識(shí)別特定序列中的胞嘧啶或腺嘌呤，并將甲基共價(jià)連接到該堿基上，可調(diào)控基因表達(dá)。Li等[41]利用DNA甲基化酶識(shí)別發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的甲基化位點(diǎn)并對(duì)其甲基化，然后特異性切割酶DpnI識(shí)別被甲基化的堿基對(duì)其切斷，將G-四鏈體短片段釋放出來(lái)，可實(shí)現(xiàn)6 U/mL DNA甲基化酶的檢測(cè)。為進(jìn)一步降低檢出限，引入聚合酶形成分子機(jī)器，通過(guò)識(shí)別甲基化后的片段DNA，進(jìn)行多次的聚合及切割，可檢測(cè)更低濃度的甲基化酶，檢出限為0.25 U/mL。

3.2.5?焦磷酸酶（Pyrophosphatase， PPase）?PPase是作用于雙磷酸鍵上的酸酐水解酶， 可催化一分子焦磷酸鹽轉(zhuǎn)化為兩分子磷酸鹽離子。Wang等[42]根據(jù)Cu2+與焦磷酸配位形成Cu-Ppi復(fù)合物，而焦磷酸的水解產(chǎn)物磷酸不結(jié)合Cu2+，PPase作用后Cu2+從復(fù)合物上釋放出來(lái)，作為穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)的中心離子，催化TMB與H2O2反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了PPase的檢測(cè)，檢出限為0.0006 U/mL（圖3C）。

3.2.6?堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）?ALP可催化核酸分子脫去磷酸基團(tuán)，從而轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基末端。Liu等[43]利用其能產(chǎn)生自由羥基末端的性質(zhì)開(kāi)發(fā)了一種以G-四鏈體為信號(hào)分子的電化學(xué)傳感器。ALP將雜交在電極上的DNA的磷酸基團(tuán)除去形成羥基，再加入脫氧核糖末端轉(zhuǎn)移酶延伸得到長(zhǎng)鏈的T序列，此時(shí)加入一段末端為polyA的G-四鏈體探針即能雜交到長(zhǎng)鏈T上，G-四鏈體與Hemin形成DNAzyme催化電極表面Thi的氧化， 實(shí)現(xiàn)信號(hào)的輸出。此方法可實(shí)現(xiàn)最低濃度為0.00003 U/mL的ALP的檢測(cè)。

3.2.7?尿嘧啶-DNA糖基化酶（Uracil -?DNA Glycocasylase， UDG）?UDG能特異性識(shí)別并除去DNA單鏈或雙鏈的尿嘧啶殘基，在細(xì)胞增殖過(guò)程中保持基因穩(wěn)定性。Hu等[44]設(shè)計(jì)了一種免標(biāo)記檢測(cè)UDG的新方法。該方法通過(guò)去除雙鏈DNA中的其中一條單鏈的4個(gè)尿嘧啶，形成AP位點(diǎn)使得雙鏈結(jié)構(gòu)解離，釋放出的單鏈可折疊成G-四鏈體，增強(qiáng)甲基化卟啉（NMM）的熒光，實(shí)現(xiàn)UDG的檢測(cè)，檢出限為0.05 U/mL。另一種檢測(cè)UDG的方法涉及DNA修復(fù)酶切割酶的使用。利用UDG對(duì)U進(jìn)行糖基化后，內(nèi)切酶VI即可識(shí)別并切斷糖基化后的尿嘧啶產(chǎn)生3′羥基端，再經(jīng)過(guò)聚合酶和限制性內(nèi)切酶反復(fù)地聚合與切割，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。此方法可實(shí)現(xiàn)最低濃度0.0001 U/mL UDG的檢測(cè)[45]。

3.2.8?聚合酶（Polymerase）?聚合酶能依據(jù)模板序列將dNTP聚合到引物上， 形成與模板互補(bǔ)的單鏈，對(duì)維持基因的穩(wěn)定性有重要作用。Leung等[46]設(shè)計(jì)了一個(gè)帶有懸垂端的發(fā)夾分子，當(dāng)有聚合酶存在時(shí)，較短的發(fā)夾一段作為延伸引物，另一段懸垂端作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行變性后，聚合產(chǎn)物鏈在K+存在下形成G-四鏈體，結(jié)合并增強(qiáng)Ir配合物的熒光，實(shí)現(xiàn)對(duì)聚合酶的檢測(cè)。

3.2.9?端粒酶（Telomerase）?端粒酶是一種核糖蛋白酶，能將端粒重復(fù)序列5′-GGGTTA-3′連接到染色體末端， 從而抑制癌細(xì)胞的無(wú)限增殖。Xiao等[47]利用端粒酶聚合生成的重復(fù)片段將發(fā)夾打開(kāi)，釋放出完整的G-四鏈體，G-四鏈體與Hemin形成DNAzyme， 催化ABTS顯色， 以此來(lái)檢測(cè)端粒酶的活性。Li等[48]?開(kāi)發(fā)了一個(gè)更簡(jiǎn)單的方法，設(shè)計(jì)了一條含有3組3個(gè)鳥(niǎo)嘌呤重復(fù)單元的探針。此探針在結(jié)合Hemin后只有極低的催化活性。但當(dāng)端粒酶存在時(shí)，端粒酶能在探針末端添加3個(gè)鳥(niǎo)嘌呤的重復(fù)單元，此時(shí)探針可形成G-四鏈體，高效催化ABTS的氧化，實(shí)現(xiàn)端粒酶的檢測(cè)。

3.2.10?脫氧核糖末端轉(zhuǎn)移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase， TdT）?TdT是一種特殊的DNA聚合酶，不需要模板，可催化DNA3′羥基端延伸，是一種被廣泛使用的工具酶。Nie的研究組[49，50]報(bào)道了在富含dGTP的底物池中，TdT合成的DNA長(zhǎng)鏈可形成多個(gè)連續(xù)無(wú)固定序列的G-四鏈體，利用生成的G-四鏈體對(duì)ThT的熒光增強(qiáng)（圖3D）和CV的電化學(xué)信號(hào)放大作用，實(shí)現(xiàn)了TdT活性分析以及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

3.3?金屬離子的檢測(cè)

目前，金屬離子污染問(wèn)題日趨嚴(yán)重，開(kāi)發(fā)高效檢測(cè)金屬離子的方法，成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。以G-四鏈體為信號(hào)分子的檢測(cè)方法可簡(jiǎn)單、高效、便捷地檢測(cè)金屬離子，按其檢測(cè)原理可分為三類。

3.3.1?特異性穩(wěn)定G-四鏈體的金屬離子?利用中心離子穩(wěn)定的G-四鏈體構(gòu)型不同而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。Li等[17]報(bào)道了一種基于G-四鏈體結(jié)構(gòu)變化檢測(cè)Pb2+的方法。PS2.M在K+存在時(shí)折疊成平行結(jié)構(gòu)的G-四鏈體，與Hemin結(jié)合后顯示較高的過(guò)氧化物酶活性。 在Pb2+存在時(shí)， PS2.M折疊成反平行的G-四鏈體，不利于與Hemin的結(jié)合，過(guò)氧化物酶活性下降。根據(jù)K+與Pb2+穩(wěn)定的G-四鏈體的催化活性的差異，可實(shí)現(xiàn)二者的檢測(cè)（圖4A）。利用此原理，還可實(shí)現(xiàn)Tb3+[51]?、Ba2+[52]等的檢測(cè)。此外，還有一類特殊的例子，如利用Cu+能高效催化疊氮基團(tuán)與炔基的Click反應(yīng)，使得兩條裂分的DNA連接后能形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，加入取代鏈后可將完整的G-四鏈體序列置換下來(lái)，實(shí)現(xiàn)CV的熒光增強(qiáng)，對(duì)Cu2+進(jìn)行檢測(cè)，最低檢測(cè)濃度可達(dá)到65 nmol/L[53]。

3.3.2?與堿基作用的特定金屬離子?利用特定金屬離子與堿基的作用實(shí)現(xiàn)金屬離子檢測(cè)，如T-Hg2+-T， C-Ag+-C結(jié)構(gòu)的形成。其中一類是基于金屬離子與堿基作用后抑制G-四鏈體的形成（Turn-off模式），另一類是促進(jìn)G-四鏈體的形成（Turn-on模式）。Willner研究組報(bào)道了一種基于T-Hg2+-T的分子機(jī)器檢測(cè)Hg2+（圖4B）[54]。Li等[55]報(bào)道了基于C-Ag+-C作用下，拉近兩條裂分的G-四鏈體序列，構(gòu)成完整G-四鏈體檢測(cè)Ag+，檢出限為2.5 nmol/L。

3.3.3?具有切割活性DNAzyme對(duì)應(yīng)的金屬離子?自1994年第一例具有金屬離子切割活性的DNAzyme被報(bào)道以來(lái)，越來(lái)越多的金屬離子切割活性酶被發(fā)現(xiàn)?；谇懈罨钚訢NAzyme與G-四鏈體結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)金屬離子檢測(cè)的方法，基本思路是利用發(fā)夾結(jié)構(gòu)或者DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)封閉G-四鏈體信號(hào)區(qū)域，當(dāng)有目標(biāo)金屬離子存在時(shí)，對(duì)發(fā)夾結(jié)構(gòu)或者雙鏈結(jié)構(gòu)中的特定位置切割，通過(guò)釋放G-四鏈體序列，檢測(cè)目標(biāo)離子。2009年， Yin等[56]報(bào)道了基于Cu2+切割型的DNAzyme檢測(cè)Cu2+的方法。當(dāng)有目標(biāo)離子Cu2+存在時(shí)，探針鏈自我切割， 釋放出自由的G-四鏈體部分，G-四鏈體部分與Hemin結(jié)合形成DNAzyme催化底物，實(shí)現(xiàn)Cu2+的檢測(cè)。通過(guò)這種方法可靈敏檢測(cè)Zn2+、UO2+2、Mg2+、Pb2+（圖4C）[57～59]，由于切割性核酶的特異性，使得該方法能特異性地實(shí)現(xiàn)金屬離子的檢測(cè)。

3.4?目標(biāo)DNA/RNA檢測(cè)

許多疾病的發(fā)生與一些特定DNA或者RNA的異常表達(dá)有關(guān)，如p53、miRNA141，對(duì)這些DNA、RNA早期高靈敏檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)疾病的早診斷、早治療。Weizmann等[60]報(bào)道了通過(guò)目標(biāo)DNA打開(kāi)發(fā)夾結(jié)構(gòu)釋放G-四鏈體產(chǎn)生信號(hào)的方法檢測(cè)目標(biāo)DNA; Deng等[61]利用目標(biāo)DNA拉近裂分的G-四鏈體結(jié)構(gòu)作為信號(hào)分子檢測(cè)DNA（圖5Ⅰ）。

對(duì)低豐度DNA、RNA，可通過(guò)信號(hào)放大方法實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。信號(hào)放大的方式包括與其它納米材料聯(lián)用，或者引入核酸為底物的信號(hào)放大技術(shù)。以金納米顆粒聯(lián)合G-四鏈體放大檢測(cè)目標(biāo)DNA為例，修飾在金電極上的捕獲探針與目標(biāo)DNA雜交，此時(shí)加入修飾識(shí)別探針的金納米顆粒，此識(shí)別探針中間含有與目標(biāo)互補(bǔ)序列以及G-四鏈體序列。由于金納米顆粒上修飾多個(gè)含有G-四鏈體的識(shí)別探針，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大（圖5Ⅱ）[62]。以核酸為底物的信號(hào)放大方法主要有滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling circle amplification， RCA）、鏈置換擴(kuò)增（Strand displacement amplification， SDA）、核酸內(nèi)切酶輔助的放大（Nicking endonuclease signal amplification， NESA）、外切酶Ⅲ輔助信號(hào)放大方法等。這些放大方法以G-四鏈體為信號(hào)分子可實(shí)現(xiàn)超低濃度的核酸檢測(cè)[63～65]。Wang等[66]設(shè)計(jì)了一個(gè)含有3段與G-四鏈體互補(bǔ)以及與目標(biāo)DNA互補(bǔ)序列的環(huán)狀DNA，以其為模板，以目標(biāo)DNA為引物，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物中含有多個(gè)G-四鏈體結(jié)構(gòu)，加入Hemin形成多個(gè)DNAzyme，催化底物魯米諾發(fā)光，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA的檢測(cè)。前述的信號(hào)放大方法都需要酶的參與，而隨著DNA納米技術(shù)的發(fā)展，一種無(wú)酶鏈取代技術(shù)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Hybridization chain reaction， HCR）被報(bào)道[67]。HCR中設(shè)計(jì)兩個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，通過(guò)觸發(fā)鏈（一般為目標(biāo)DNA）打開(kāi)其中一個(gè)發(fā)夾，被打開(kāi)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)另一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，兩者交替打開(kāi)，形成一條長(zhǎng)鏈的雙鏈DNA。

Shimron等[68]對(duì)兩個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列做了修改，使得在形成長(zhǎng)的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)時(shí)，每個(gè)發(fā)夾末端有一段裂分G-四鏈體序列，相鄰兩個(gè)裂分G-四鏈體片段即可組成一個(gè)完整的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，作為信號(hào)輸出分子。

3.5?納米結(jié)構(gòu)的形成與調(diào)控

平行的G-四鏈體結(jié)構(gòu)可在特定金屬離子存在下形成長(zhǎng)的、連續(xù)的納米結(jié)構(gòu)，稱為G納米線。這類納米結(jié)構(gòu)有良好的機(jī)械穩(wěn)定性、抗熱、抗DNase I水解，以及獨(dú)特的光學(xué)和電化學(xué)性質(zhì)，在結(jié)構(gòu)納米技術(shù)中有潛在的應(yīng)用價(jià)值[69]。Ren等[70]利用G納米線形成后其瑞利散射顯著增強(qiáng)，聯(lián)合Exo Ⅲ放大方法， 實(shí)現(xiàn)了Hg2+的靈敏檢測(cè)。He等[71]發(fā)現(xiàn)，G納米線表面負(fù)載CoIIPc后， 可高效、高選擇性地電催化CO2的還原。

利用G-四鏈體結(jié)構(gòu)形成前后其結(jié)構(gòu)的變化而引起鏈長(zhǎng)度的變化，可作為納米結(jié)構(gòu)的有效調(diào)控手段。Sannohe等[72]在兩段雙鏈結(jié)構(gòu)中設(shè)置裂分的兩段G-四鏈體結(jié)構(gòu)，當(dāng)K+存在時(shí)，G-四鏈體形成，拉近兩段雙鏈，形成以G-四鏈體為節(jié)點(diǎn)的X型納米結(jié)構(gòu)。G-四鏈體也可作為納米材料的距離調(diào)控手段。Sathya等[73]將ATP核酸適體的兩端分別連接碳點(diǎn)和銀納米顆粒，當(dāng)沒(méi)有目標(biāo)物ATP時(shí)，DNA呈松散狀態(tài)，碳點(diǎn)與銀納米顆粒相距較遠(yuǎn)，沒(méi)有作用;而當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí)，核酸適體結(jié)合其形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，處于DNA兩端的碳點(diǎn)和銀納米顆粒距離被拉近， 形成有效的FRET對(duì)。

3.6?成像分析與癌癥治療

G-四鏈體可增強(qiáng)一些特異性染料的熒光，利用其特異性以及高倍數(shù)的熒光信號(hào)放大作用進(jìn)行成像分析。G-四鏈體可特異性地結(jié)合TMpyP4，TMpyP4具有優(yōu)良的光熱性質(zhì)，可作為癌癥治療中的光動(dòng)力治療分子。因此，這些特異性分子是G-四鏈體用于成像分析和癌癥治療的基礎(chǔ)。

細(xì)胞凋亡在細(xì)胞和機(jī)體生長(zhǎng)調(diào)節(jié)過(guò)程中具有重要作用，細(xì)胞凋亡與多種疾?。ㄈ缢ネ诵约膊『桶┌Y）的發(fā)展有關(guān)。傳統(tǒng)評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡的方法包括DNA ladder實(shí)驗(yàn)和TUNEL實(shí)驗(yàn)。雖然這些方法可有效地指示細(xì)胞凋亡，但是具有消耗時(shí)間長(zhǎng)、工作量大、多步的分離和清洗、低靈敏度、假陽(yáng)性、高花費(fèi)等缺點(diǎn)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，Nie研究組[74]基于TdT酶激活G-四鏈體合成，在單細(xì)胞水平對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行免標(biāo)記的原位生物成像（圖6A）。最近，該團(tuán)隊(duì)及合作者針對(duì)常見(jiàn)的丙型肝炎病毒，以病毒RNA基因組序列中的G-四鏈體為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成熒光探針ThT-NE，建立了病毒RNA基因組活細(xì)胞熒光成像新方法[75]。該方法可實(shí)現(xiàn)非修飾或不需遺傳改造的活細(xì)胞中病毒RNA基因組分布信息獲取，監(jiān)測(cè)整個(gè)病毒增殖過(guò)程，為病毒生物學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷提供了新工具。

核仁素是涉及RNA轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制和bcl-2穩(wěn)定的多功能蛋白，很多癌癥細(xì)胞會(huì)高表達(dá)核仁素。AS1411是核仁素的核酸適配體，也可形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)。Shieh等[76]利用AS1411可特異結(jié)合并增強(qiáng)TMpyP4的熒光，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別與光動(dòng)力治療（圖6B）。Liu等[77]在AS1411的兩端分別設(shè)計(jì)富含G-C的雙鏈結(jié)構(gòu)，雙鏈結(jié)構(gòu)可作為阿霉素的載體進(jìn)行運(yùn)送，因此可通過(guò)G-四鏈體實(shí)現(xiàn)兩種藥物的輸送，用于克服腫瘤細(xì)胞抗藥性的治療（圖6C）。而AS1411的識(shí)別作用只限于某些特定種類的腫瘤細(xì)胞，為了增加G-四鏈體作為藥物載體以及成像分子適用范圍，Tan研究組利用裂分的核酸適配體與G-四鏈體構(gòu)建的雙功能核酸分子用于細(xì)胞成像與藥物輸送[78]?，以及合成同時(shí)具有核酸適配體和G-四鏈體序列的長(zhǎng)鏈DNA探針實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的光動(dòng)力治療以及近紅外成像[79]。以上研究中設(shè)計(jì)的治療探針一般只包含1個(gè)G-四鏈體結(jié)構(gòu)，其輸送的光動(dòng)力治療分子數(shù)目有限。Nie研究組[80]開(kāi)發(fā)了一種基于TdT產(chǎn)生的G-四鏈體用于細(xì)胞成像和光動(dòng)力治療的方法。以A549細(xì)胞的核酸適配體作為引物分子，TdT聚合生成含有多個(gè)G-四鏈體的長(zhǎng)鏈DNA，加入染料ThT后，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞的成像檢測(cè)。而TMPyP4與G-四鏈體結(jié)構(gòu)的親和力更強(qiáng)，可競(jìng)爭(zhēng)ThT結(jié)合到G-四鏈體結(jié)構(gòu)上，引入多個(gè)TMPyP4分子，可提高光動(dòng)力治療的效率（圖6D）。前面所述的工作是通過(guò)增加G-四鏈體的數(shù)目從而增加光敏劑數(shù)量來(lái)提高治療效率。近日，Cheng等[81]開(kāi)發(fā)了一種新型的光敏劑分子（TMPipEOPP）4+·4I，相比于傳統(tǒng)卟啉，實(shí)現(xiàn)了50 nm的紅移以及7.4倍的光吸收效率，極大地增強(qiáng)了單線態(tài)氧的產(chǎn)生以及光動(dòng)力治療的效率。將 （TMPipEOPP）4+·4I與G-四鏈體結(jié)合作為光敏劑，并與MnO2結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)高效的體內(nèi)及體外光動(dòng)力治療，并有望應(yīng)用于臨床治療。

4?總結(jié)與展望

G-四鏈體作為一種功能核酸，具有性質(zhì)穩(wěn)定、特異性好、功能多樣等特點(diǎn)，被廣泛用于各種生化分析中。目前基于G-四鏈體開(kāi)發(fā)的分析檢測(cè)方法包括比色法、熒光法、電化學(xué)、電化學(xué)發(fā)光等多種形式。由于G-四鏈體結(jié)構(gòu)的特殊性， 其被用于細(xì)胞成像以及癌癥治療等方面的研究。G-四鏈體未來(lái)主要的發(fā)展趨勢(shì)可能有以下方面：（1）提高模擬過(guò)氧化物酶的活性。目前的研究結(jié)果表明G-四鏈體構(gòu)成的核酶雖然可通過(guò)前文方法提高活性，但是對(duì)比蛋白酶的活性還是有很大差距。因此，提高核酶活性是重要的研究?jī)?nèi)容。（2）特異性識(shí)別的紅外染料的合成。隨著成像技術(shù)的發(fā)展，普通熒光成像面臨著高背景、易被光漂白等應(yīng)用方面的限制。開(kāi)發(fā)組織穿透能力高，結(jié)合G-四鏈體后能顯著增強(qiáng)熒光的染料，可拓展G-四鏈體在細(xì)胞成像方面的應(yīng)用。（3）便攜式傳感器的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。目前，基于G-四鏈體的分析傳感方法多局限于實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用， 開(kāi)發(fā)便攜式（如試紙類、數(shù)顯類）直讀型便攜式商用傳感器將是未來(lái)的研究趨勢(shì)。

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Progress on Applications of G-quadruplex in Biochemical Analysis

LIU Zhuo-Liang1，2， TAO Cheng-An1， WANG Jian-Fang*1

1（Department of Biology and Chemistry， College of Liberal Arts and Sciences，

National University of Defense Technology， Changsha 410073， China）

2（State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics，

College of Chemistry and Chemical Engineering， Hunan University， Changsha 410082， China）

Abstract?G-quadruplex is a special secondary structure of nucleic acid. G-quadruplex can bind with hemin to form DNAzyme with peroxidase activity， and also it can enhance the fluorescence intensity of some dyes. As one of the functional nucleic acids， G-quadruplex is widely used in various biochemical analyses due to its high stability， specificity and flexibility. The application of G-quadruplex in biochemical analysis and its application prospects are briefly introduced.

Keywords?G-quadruplex; Functional nucleic acid; DNAzyme/RNAzyme; Biochemical analysis; Review

（Received 13 July 2019; accepted 13 November 2019）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 21705163）， the Natural Science Foundation of Hunan Province， China （No. 2019JJ50737）， the Research Project of the National University of Defense Technology （No. ZK18-03-39） and the Open Subject of State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics （No. 2017011）.